专利名称：检测呋喃它酮代谢物的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测呋喃它酮代谢物的试剂盒，特别是检测动物组织中呋喃它酮代谢物的试剂盒。
技术背景 硝基呋喃类药物常作为广谱类抗生素用于预防和治疗由沙门氏菌和埃希氏菌引起的猪、牛、家禽及蜜蜂的胃肠道疾病。但在长时间的实验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药物禁止在治疗和饲料中使用。由于硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，无法检测，但其代谢产物因和蛋白质结合而相当稳定，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。目前用来检测硝基呋喃类代谢物的最常用方法是高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS/MS )等，这些方法灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少，但样品前处理过程复杂，仪器化程度高价格昂贵，与之相比，免疫方法具有灵敏度高、样品预处理简单、短暂的检测时间、较大的检测样本量等特点，适合现场监控和大量样品的筛查。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测呋喃它酮代谢物的试剂盒。本实用新型的试剂盒，其包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和8个试纸条，微孔试剂条有8个反应孔，反应孔上具有微孔塞，其中冻干有呋喃它酮代谢物单克隆抗体-胶体金标记物。试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有呋喃它酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。样品吸收垫位于底板始端，吸水垫位于底板末端，检测线和质控线平行，均呈与试纸条的长相垂直的条带状，质控线位于距离吸水垫始端与反应膜相连处5-8mm，检测线位于距离质控线5_6mm。试纸条样品吸收垫上检测端粘贴有保护膜，保护膜上有MAX标记线。本实用新型试剂盒中试纸条底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂盒盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料。本实用新型试剂盒具有如下有益效果I.灵敏度高。呋喃它酮代谢物检测试剂盒以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的呋喃它酮代谢物单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试剂盒具有较高的特异性和灵敏度。本试剂盒对呋喃它酮代谢物的检测灵敏度为I U g/L。2.显示检测结果形象、直观准确。检测时试纸条以显示红色线“ I ”及“ Il ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示在被检测样本液中呋喃它酮代谢物含量高于等于试剂盒对呋喃它酮代谢物的最低检测限，两条红线“ Il ”印迹表示在被检测样本中呋喃它酮代谢物含量低于试剂盒对呋喃它酮代谢物的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。3.成本低，投资少。使用本实用新型试剂盒，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。4.易于大范围推广应用。试剂盒操作简单，能较好满足动物组织检测的需求，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图I为本实用新型试纸条结构示意图；图2为本实用新型试纸条俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图；图4为本实用新型试纸条检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具俯视图；图7为本实用新型盒体与固定用具侧视图。
具体实施方式
一、呋喃它酮代谢物检测试剂盒的组装制备I)试纸条样品吸收垫I、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫位于底板始端，吸水垫位于底板末端，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸样品吸收垫上检测端粘贴有保护膜，保护膜上印有MAX标记线，检测线4包被有呋喃它酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。2)微孔试剂条微孔试剂条8具有微孔塞9，孔中冻干有呋喃它酮代谢物单克隆抗体-胶体金标记物。3)将I)试纸条和2)微孔试剂条装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试剂盒盒体12内的固定用具11中。[0026]二、试剂盒的使用I、样品前处理称取5. 0g±0. 05g均质的样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml 10%三氯乙酸，再加入IOOiU衍生化试剂(向装有151mg 2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加入IOml甲醇溶解混匀)，充分振荡3min ;在60°C温箱中孵育I. 5h ;取出依次加入Iml 0. 5mol/L磷酸氢二钾溶液、I. 5ml 2mol/L氢氧化钠溶液和IOml乙酸乙酯，振荡10s，脂肪含量高的样本轻微振荡8-10下，以防样本乳化；3000g以上，室温(20-25°C)离心5min ;取8ml乙酸乙酯相至IOml干燥的玻璃试管中，于5(T60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml正己烷，涡动30s，再加0. 8ml样品复溶液(0. 2mol/L磷酸盐缓冲液)，涡动IOs充分混匀；3000g以上，室温(20-25°C)离心5min ;除去上层有机相，取下层IOOiU用于分析。2、用试剂盒检测用微量移液器吸取IOOiU复溶的样本液，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀，将标记好的试纸条插入微孔中——印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中；室温(200C -25°C)孵育5min后，取出试纸条，判定结果。三、检测结果分析呋喃它酮代谢物在样品中的含量高于等于试剂盒对其的最低检测限时，呋喃它酮代谢物单克隆抗体-胶体金标记物与药物结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与呋喃它酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸条以显示红色线“ I ”，判为阳性，如图4. a图所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，试纸条以显示红色线为“ Il ”，判为阴性，如图4.b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条判为无效，如图4. c、4. d所示。四、检测试剂盒中用到的材料制备方法I、呋喃它酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定( I)呋喃它酮代谢物半抗原的制备a.取l.Og对羟基苯甲醛溶于乙腈中，加入0.32g碳酸钾，0. Ig碘化钠，搅拌。加入溴乙酸乙酯0. 44g，装上回流冷凝管，80°C搅拌过夜。反应停止后，蒸干乙腈，加水溶解，乙酸乙酯萃�。舾缮瞎杞褐兔岩宜嵋阴�=5:1过柱纯化得产物I. OSg ；b.取步骤a得到的I. 08g产物溶于乙醇中，加氢氧化钾0. 5g，70°C搅拌4h。反应停止后，蒸干乙醇，加水溶解，调节PH值到6，加60ml X3乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，蒸干，上硅胶柱，石油醚乙酸乙酯=3:1洗脱得产物0.738; c.取步骤b得到的0. Ig产物加N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶解，在搅拌下加0. 41g呋喃它酮代谢物的甲醇溶液5ml，60°C搅拌4h。反应停止后，蒸干溶剂，加乙醇重结晶得半抗原产物0. 53g。(2)免疫原的制备[0043]取12mg呋喃它酮代谢物半抗原，溶解于Iml DMF中，得到溶液I ;取15mg 二环己基碳二亚胺(DCC)和IOmg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0. 2ml DMF充分溶解后加入溶液I中，室温下搅拌24 h，即可得到溶液II ;称取牛血清白蛋白(BSA)30mg，使之充分溶解在3ml水中，将溶液II逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h，用O.Olmol/L PBS 4°C透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于_20°C保存备用。(3)包被原的制备取12mg呋喃它酮代谢物半抗原用I. 5ml DMF溶解，冷却至10°C，得到溶液I ;取氯甲酸异丁酯10 Ul加入溶液I中，10°C搅拌反应30min得到溶液II ;取30mg卵清白蛋白(OVA)用 2. 2ml 50mmol/L Na2C03 溶解与溶液II 10°C反应 4h，然后 4°C过夜；用 0. Olmol/ L PBS 4°C透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20°C保存备用。(4)呋喃它酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定将载体蛋白、呋喃它酮代谢物半抗原、呋喃它酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7. 4的PBS配成0. 5mg/mL的溶液，以0. 01mol/L pH7. 4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800 nm范围内扫描，得到载体蛋白、呋喃它酮代谢物半抗原、呋喃它酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明呋喃它酮代谢物半抗原与载体蛋白偶联成功。2、呋喃它酮代谢物单克隆抗体的制备a.动物免疫将步骤I得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为1501^/只，使其产生
抗血清。b.细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞,按8:1 (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选得到稳定分泌呋喃它酮代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株。c.细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成5X IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。d.单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0. 2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7. 4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、呋喃它酮代谢物单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸(购于sigma公司)稀释成0. 01% (质量百分含量)，取IOOml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2. 5ml1%柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂)，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)呋喃它酮代谢物单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用0. 2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7. 2，按每毫升胶体金溶液中加入5(Tl00i! g抗体的标准向胶体金溶液中加入上述呋喃它酮代谢物单克隆抗体，继续搅拌混匀IOminJpA 10%牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积百分含量)，静置lOmin。12000rpm，4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。复溶缓冲液含牛血清白蛋白(BSA) 0. 19T0. 3% (体积百分含量)、吐温_800. 059T0. 2% (质量百分含量)、pH7. 2的0. 02mol/L磷酸盐缓冲液。5、将呋喃它酮代谢物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入100 U I呋喃它酮代谢物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50°C条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有呋喃它酮代谢物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，将微孔试剂加上微孔塞，密封保存。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0. 5%(体积百分含量))、pH为7. 2,0. lmol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37°C烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将呋喃它酮代谢物半抗原-卵清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL,用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为I. 0 y g/cm2 ;用0. 01mol/L、pH 7. 4 PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200ii g/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为I. Oy g/cm2。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
权利要求1.一种检测呋喃它酮代谢物的试剂盒，其特征在于试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和8个试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反应膜上具有包被有呋喃它酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ 1 ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ 1 ”。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述检测线和质控线平行，均呈与试纸条的长相垂直的条带状。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述样品吸收垫位于底板始端，所述吸水垫位于底板末端，所述质控线位于距离吸水垫始端与反应膜相连处5-8mm，所述检测线位于距离质控线5_6mm。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试纸条样品吸收垫上的检测端粘贴有保护膜，保护膜上有MAX标记线。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述微孔试剂条有8个反应孔，反应孔上具有微孔塞。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述微孔试剂中冻干有呋喃它酮代谢物单克隆抗体-胶体金标记物。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒盒体为硬纸盒，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料。
专利摘要一种检测呋喃它酮代谢物的试剂盒，其特征在于试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和8个试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。本实用新型灵敏度高，显示检测结果形象、直观准确，成本低，投资少。
文档编号G01N33/577GK202649213SQ20122014394
公开日2013年1月2日 申请日期2012年4月7日 优先权日2012年4月7日
发明者何方洋, 冯才伟, 冯才茂, 赵正苗, 冯静, 陈炜玲, 刘琳, 杨秀贤, 崔海峰 申请人:北京勤邦生物技术有限公司
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