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专利名称：益肾安神膏质量标准检测方法
技术领域：
本发明属于药技术领域。具体涉及益肾安神膏质量标准检测方法。
背景技术：
益肾安神膏是一个传统煎膏剂，由人参、珍珠粉、南沙参、北沙参、丹参、黄芪、五味子(制)、桑椹、女贞子(制)、当归、淫羊藿、香附(制)、灵芝、甘松、鸡血藤、淡菜、九节菖蒲、远志(制)、牡蛎、续断、虎杖、枇杷叶、陈皮、地黄、麦芽、稻芽等二十六味中药组成，具有补益气血，益肾安神的功效。用于气血亏虚所致的头昏目眩，腰膝酸软，盗汗失眠；也可用于产后、病后调养。方中丹参为臣药，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦的功效。
原质量标准中对其中人参等八味药进行了定性鉴别，但没有反映药物内在质量的指标成分的含量测定项，无法在生产中有效的保证产品的内在质量，进而药品疗效得不到保证。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为克服上述的不足之处，改进原有的质量标准，提高产品质量，增加了其中枇杷叶的定性鉴别，建立了丹参中原儿茶醛C7H6O3的含量测定。
本发明提供了益肾安神膏质量标准检测方法，该方法包括对其中枇杷叶的定性鉴别和建立了丹参中原儿茶醛的含量测定。
本发明提供的益肾安神膏中枇杷叶的定性鉴别方法为薄层鉴别法，该方法包括下列步骤照薄层色谱法(中国药典2000年版附录VIB)测定。
取本品100g，置锥形瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)200ml，摇匀，提取(超声处理或热回流或冷浸)20分钟，放冷后，滤过，滤液蒸干，残渣加水80ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次80ml，弃去水液，正丁醇回收至干，残渣加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材2g，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)30ml，提取(超声处理或热回流或冷浸)20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解后，用水饱和正丁醇提取二次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)1ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各10μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以苯-丙酮(10～2)∶(5～0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
本发明提供的益肾安神膏中丹参药味中原儿茶醛含量的测定法为高效液相测定法，该方法包括下列步骤照高效液相色谱法(中国药典2000年版附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，用甲醇-0.8％冰醋酸溶液(15～2)∶(85～98)为流动相，待原儿茶醛色谱峰出峰后用甲醇-0.8％冰醋酸溶液(95～70)∶(5～30)洗脱3～25分钟；检测波长为280nm。理论塔板数按原儿茶醛峰计算应不低于6000～2000。
对照品溶液的制备 精密称取原儿茶醛对照品适量，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)制成每1ml含6.8989μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品30.7712g，置烧杯中，精密称定，加25ml溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)搅拌使溶解，转移至50ml量瓶中，用溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)少量多次反复洗涤烧杯，洗液并入同一量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)4ml，摇匀，提取(超声处理或热回流或冷浸)10分钟，放冷后，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
计算 结果 本品每g含丹参(以原儿茶醛(C7H6O3)计)22.42μg。
本发明益肾安神中丹参药味中的原儿茶醛含量的测定经过了系列试验(1)仪器与试药仪器Agilent--1100液相色谱仪；对照品来源于中国药品生物制品检定所(批号0844-200003，供含量测定用)；样品批号(1)030901(2)030902(3)031001
试剂甲醇为色谱醇。
(2)色谱条件经过摸索，采用检测波长280nm，流速0.5～1.5ml/min，经试验，确定采用流动相甲醇-0.5％冰醋酸溶液(15～2)∶(85～98)，待原儿茶醛色谱峰出峰后用甲醇-0.8％冰醋酸溶液(95～70)∶(5～30)洗脱3～25分钟。色谱柱C18(15cm×5μm)，柱温45～20℃。
(3)供试品制备方法取本品30g，置烧杯中，精密称定，加25ml溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)搅拌使溶解，转移至50ml量瓶中，用溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)少量多次反复洗涤烧杯，洗液并入同一量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)4ml，摇匀，提取(超声处理或热回流或冷浸)10分钟，放冷后，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(4)提取时间的选择取本品30g，置烧杯中，精密称定，加25ml溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)搅拌使溶解，转移至50ml量瓶中，用溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)少量多次反复洗涤烧杯，洗液并入同一量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)4ml，摇匀，分别(a)振摇、(b)提取(超声处理或热回流或冷浸)5分钟、(c)提取(超声处理或热回流或冷浸)10分钟、(d)提取(超声处理或热回流或冷浸)15分钟、(f)提取(超声处理或热回流或冷浸)20分钟，放冷后，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液测定，结果见下表选择提取(超声处理或热回流或冷浸)10分钟可将所测成分完全提出。
提取时间

(5)标准曲线取不同浓度的原儿茶醛对照品溶液分别进样，以峰面积为纵坐标Y，进样量为横坐标X，做回归得标准曲线，结果表明原儿茶醛进样量8.536～1280.40ng范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系，结果见下表。
标准曲线

(6)精密度试验精密量取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，进样分析，重复测定5次，记录峰面积，结果见下表。
精密度试验

(7)稳定性试验取同一供试品溶液分别在制备好后0小时、3小时、8小时、15小时、21小时注入液相色谱仪，进样测定结果，其峰面积均未见明显变化，说明供试品溶液较稳定，结果见下表。
稳定性试验

(8)重复性试验取样品(批号030901)30g，置烧杯中，精密称定，加25ml溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)搅拌使溶解，转移至50ml量瓶中，用溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)少量多次反复洗涤烧杯，洗液并入同一量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)4ml，摇匀，提取(超声处理或热回流或冷浸)10分钟，放冷后，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。注入液相色谱仪，分别测定，结果见下表。
重复性试验

(9)加样回收率测定取样品(批号030901)15g，置烧杯中，精密称定，精密加入原儿茶醛对照品一定量，加25ml溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)搅拌使溶解，转移至50ml量瓶中，用溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)少量多次反复洗涤烧杯，洗液并入同一量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)4ml，摇匀，提取(超声处理或热回流或冷浸)10分钟，放冷后，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。注入液相色谱仪，分别测定，结果见下表。
加样回收率

(10)样品测定取样品(批号(1)030901(2)030902(3)031001)30g，置烧杯中，精密称定，加25ml溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)搅拌使溶解，转移至50ml量瓶中，用溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)少量多次反复洗涤烧杯，洗液并入同一量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)4ml，摇匀，提取(超声处理或热回流或冷浸)10分钟，放冷后，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。注入液相色谱仪，分别测定，结果见下表样品测定

(11)阴性样品测定取不含丹参的样品30g，置烧杯中，精密称定，加25ml溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)搅拌使溶解，转移至50ml量瓶中，用溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)少量多次反复洗涤烧杯，洗液并入同一量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)4ml，摇匀，提取(超声处理或热回流或冷浸)10分钟，放冷后，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。注入液相色谱仪，进样10μl进行分析。结果对样品测定无干扰。
为了考察质量标准提高后《益肾安神膏》的稳定性情况，进行了长期稳定性试验1、试验条件将市售包装《益肾安神膏》置于室温条件下(25℃±2℃)，相对湿度60％±10％，放置一定时间后进行观察，取样检测，重点考察性状，鉴别，含量，检查，卫生学检查项目。
2、测试结论《益肾安神膏》经一年多来产品稳定性试验表明，产品的理化性质和卫生学检查等重点考察项目均符合《益肾安神膏》质量标准要求，产品质量较为稳定。
负责后台信息处理的是公知计算机，安装相应的软件，对内置超声波接收处理电路的PS/2接口键盘送给后台的数据，按照PS/2接口协议实施技术方案所规定的数据封装，取出净荷数据，对特定数值进行区分判断新型键盘工作状态，是键盘输入模式，还是手写输入模式，还是混合输入模式。如果是手写输入模式，根据超声波接收处理装置提供的笔迹点坐标值，或左右边长值，或左右时间长度值的集合，完成输入手写笔迹。配合相应的驱动程序及应用软件，可以把手写笔迹直接显示在计算机的屏幕上。在超声波接收处理装置内部电路不含运算时，后台信息处理装置首先根据超声波接收处理装置提供的参考时间值计算出笔尖坐标值，然后完成输入板书笔笔迹任务。笔尖坐标值由(3)式和(4)式计算得到。如果是键盘输入模式，完成键值处理。如果是混合的输入模式，先要判别是手写数据还是键盘数据，然后分别处理。
长期稳定性试验批号030102 (RT25℃±2℃和RH60％±10％)

长期稳定性试验批号030103 (RT25℃±2℃和RH60％±10％)



图1枇杷叶薄层色谱图1、阴性样品 2、样品 3、枇杷叶对照药材图2丹参中原儿茶醛对照品色谱3丹参中原儿茶醛样品色谱4丹参中原儿茶醛阴性样品色谱图具体实施方式
实例一、批号0309011、枇杷叶薄层鉴别取本品100g，置锥形瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)200ml，摇匀，提取(超声处理或热回流或冷浸)20分钟，放冷后，滤过，滤液蒸干，残渣加水80ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次80ml，弃去水液，正丁醇回收至干，残渣加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)1ml使溶解，作为供试品溶液。另取枇杷叶对照药材2g，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)30ml，提取(超声处理或热回流或冷浸)20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解后，用水饱和正丁醇提取二次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)1ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述二种溶液各10μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以苯-丙酮(10～2)∶(5～0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2、丹参中原儿茶醛含量测定照高效液相色谱法(中国药典2000年版附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，用甲醇-0.8％冰醋酸溶液(15～2)∶(85～98)为流动相，待原儿茶醛色谱峰出峰后用甲醇-0.8％冰醋酸溶液(95～70)∶(5～30)洗脱3～25分钟；检测波长为280nm。理论塔板数按原儿茶醛峰计算应不低于6000～2000对照品溶液的制备精密称取原儿茶醛对照品适量，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)制成每1ml含6.8989μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品30.7712g，置烧杯中，精密称定，加25ml溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)搅拌使溶解，转移至50ml量瓶中，用溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)少量多次反复洗涤烧杯，洗液并入同一量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)4ml，摇匀，提取(超声处理或热回流或冷浸)10分钟，放冷后，加溶剂(甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
计算 结果 本品每g含丹参(以原儿茶醛(C7H6O3)计)22.42μg。
实例二、批号030902
按030901批检测，检测结果(1)鉴别呈阳性，(2)丹参(以原儿茶醛(C7H6O3)计)19.84μg。
实例三、批号031001按030901批检测，检测结果(1)鉴别呈阳性，(2)丹参(以原儿茶醛(C7H6O3)计)21.35μg。
权利要求
1.一种益肾安神膏质量标准检测方法，其特征在于增加了其中枇杷叶的定性鉴别，建立了丹参中原儿茶醛的含量测定。
2.根据权利要求1所述的一种益肾安神膏质量标准检测方法，其特征在于其中所述的枇杷叶的定性鉴别包括下列步骤取本品100g，置锥形瓶中，加溶剂甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿200ml，摇匀，提取用超声处理、热回流或冷浸20分钟，放冷后，滤过，滤液蒸干，残渣加水80ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次80ml，弃去水液，正丁醇回收至干，残渣加溶剂甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材2g，加溶剂甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿30ml，提取用超声处理、热回流或冷浸20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解后，用水饱和正丁醇提取二次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加溶剂甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿1ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各10μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以苯-丙酮10～2∶5～0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.根据权利要求1所述的一种益肾安神膏质量标准检测方法，其特征在于其中所述的丹参中原儿茶醛的含量测定方法包括下列步骤照高效液相色谱法测定(1)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，用甲醇-0.8％冰醋酸溶液15～2∶85～98为流动相，待原儿茶醛色谱峰出峰后用甲醇-0.8％冰醋酸溶液95～70∶5～30洗脱3～25分钟；检测波长为280nm，理论塔板数按原儿茶醛峰计算应不低于6000～2000；(2)对照品溶液的制备精密称取原儿茶醛对照品适量，加溶剂甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿制成每1ml含8μg的溶液，即得；(3)供试品溶液的制备取本品30g，置烧杯中，精密称定，加25ml溶剂甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿搅拌使溶解，转移至50ml量瓶中，用溶剂甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿少量多次反复洗涤烧杯，洗液并入同一量瓶中，加溶剂甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加溶剂甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿4ml，摇匀，提取超声处理或热回流或冷浸10分钟，放冷后，加溶剂甲醇、乙醇、水、正丁醇或氯仿稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(4)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每g含丹参以原儿茶醛C7H6O3计，不得少于16μg。
全文摘要
本发明属于中药技术领域。本发明公开了中药益肾安神膏质量标准检测方法。本发明改进了原有质量标准，增加了其中枇杷叶的定性鉴别，建立了丹参原儿茶醛的含量测定。通过本发明的质量控制，提高了产品稳定性，有利于工业化生产的质量控制。
文档编号G01N30/02GK1737569SQ200410089330
公开日2006年2月22日 申请日期2004年12月9日 优先权日2004年12月9日
发明者徐福莺, 邵宝平, 谢松, 沈绣红 申请人:上海雷允上药业有限公司