牵牛子致肾毒性作用毒效部位及其制备方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：牵牛子致肾毒性作用毒效部位及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药领域中牵牛子致肾毒性作用毒效部位及其制备方法，具体是牵牛子致肾毒性作用毒效部位中总树脂苷类成分的制备方法。
背景技术：
牵年子(Morning Glory 5feet/)，异名草金铃(《雷公炮炎论》)、黑白丑(《本草纲目》)等，旋花科植物裂叶牵牛nil (L.) Choisy或圆叶牵牛purpurea (L.)Voigt的干燥成熟种子,苦寒有毒,功效为湾水通便、消痰漆饮、杀虫攻积。为临床常用药，历版《中国药典》均有收载，仅现行版药典中收载含有牵牛子的中成药就有一捻金、大黄清胃丸、山楂化滞丸等7种；《现代中成药手册》中记载有舟车丸，调中四消丸等29种中成药含有牵牛子。中药服用时间长，剂量高，体内浓度大，容易造成毒性成分体内蓄积而引起中毒。近年来，牵牛子在临床上虽广泛应用，但人们只关注它的治疗功效，却忽略了长期使用或过量使用后它对肾脏造成的毒性作用，为临床安全用药留下隐患。古代文献记载牵牛子“有毒”，现代临床实践与药理实验也证实了这一点，但仅限于对中毒现象的描述，而其致肾毒性作用的物质基础却不甚明确，因此需要确认牵牛子致肾功能损伤的毒效部位。中药的安全性历来是临床应用中倍受关注的问题，也是中药现代化、国际化、可持续发展的必须突破的瓶颈之一。

发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了牵牛子致肾毒性作用毒效部位及其制备方法。本发明的技术方案是
本发明所用的牵牛子来自辽宁省沈阳市中药饮片厂，所用的809^100%乙醇是指乙醇的体积分数为80% 100%。一、牵牛子致肾毒性作用毒效部位是乙醇提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分。二、乙醇提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分的制备方法是
I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入3飞倍的80% 100%乙醇(指二者的重量比为1:3 1:5)，浸泡1(T15 h，回流提取4飞h，过滤，反复2 4次，合并滤液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取，各2-4次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用809^100%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成,过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 2^0. 5ml乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。与现有技术相比，本发明的积极效果是确定了牵牛子致肾毒性的有效部位总树脂苷类成分，可为牵牛子临床的安全应用提供依据。在此基础上，如进一步的研究，在不影响疗效的前提下，去掉毒性部位，或经过炮制等方法减小毒性作用等，或者在牵牛子药材的质量控制指标中，增加有毒部位的限量控制等。如关木通具有致肾毒性作用，经有关学者研究确定为其中含有的马兜铃酸成分，现在应用含有关木通的中成药，将关木通换为木通，主要是不含有致肾毒性作用的马兜铃酸，另外也可为其他含有马兜铃酸成分的其他中药安全应用提供依据，如中药细辛，有学者研究也含有马兜铃酸成分，可以通过控制马兜铃酸的限量，来安全应用。

图I是实施例十八-3中Jaffe法测定给药前一天和给药后第十四天血清肌酐(Cr, creatinine)浓度的示意图。结果显示给药后对照组血清肌酶浓度无明显变化,牵牛子总树脂苷组血清肌酐浓度明显升高，与阳性对照药关木通组相似。图2是实施例十八-3中尿素酶偶联法测定给药前一天和给药后第十四天血清尿素氮(BUN,blood urea nitrogen)浓度的示意图。结果显示给药后对照组血清尿素氮浓度略有升高，牵牛子总树脂苷组血清尿素氮浓度升高，与阳性对照药关木通组相似。图3是实施例十八-4中病理切片示意图。结果显示对照组肾小球与肾小管结构基本正常，肾小管排列整齐，管腔边界清晰，间质无充血水肿，肾小球与肾小囊腔大小正常。牵牛子总苷组大鼠肾脏结构在给药后出现明显破坏，同时累及肾小球与肾小管，肾小球表现为毛细血管壁细胞坏死，脱落，肾小球肿胀，肾小囊消失。肾小管症状与阳性对照药关木通组相似。关木通组大鼠肾脏损伤部位主要为肾小管，表现为肾小管上皮细胞嗜酸变性，刷状缘消失。
具体实施例方式一、80%乙醇提取物的正丁醇萃取部位总树脂苷类成分的制备方法是
I、制备牵牛子80%乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的80%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子80%乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将80%乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。二、100%乙醇提取物的正丁醇萃取部位总树脂苷类成分的制备方法是I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的100%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子100%乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将100%乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。三、乙醇3倍量加入的提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分的制备方法是
I.制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入3倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :3)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2.制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3.总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。四、乙醇5倍量加入的提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分的制备方法是I.制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入5倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :5)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2.制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3.总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。五、乙醇浸泡10 h的提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分的制备方法是 I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡10 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。
2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。六、乙醇浸泡15 h的提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分的制备方法是 I、制备牵牛子乙醇提取液取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡15 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。七、乙醇回流提取4 h的提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分的制备方法是
I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取4 h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。八、乙醇回流提取6 h的提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分的制备方法是
I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取6h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。九、乙醇回流提取2次的提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分的制备方法是
I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复2次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3 次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。十、乙醇回流提取4次的提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分的制备方法是
I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复4次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。^^一、乙醇提取物的正丁醇萃取2次的总树脂苷类成分的制备方法是
I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�2次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。十二、乙醇提取物的正丁醇萃取4次的总树脂苷类成分的制备方法是I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�4次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。十三、乙醇提取物的正丁醇萃取物用80%乙醇溶解的制备方法是
I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。 3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用80%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。十四、乙醇提取物的正丁醇萃取物用100%乙醇溶解的制备方法是
I、制备牵牛子乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取，各3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用100%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。十五、总树脂苷类成分纯化时加入0. 2ml乙酸乙酯的制备方法是
I、制备牵牛子95%乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子95%乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将95%乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 2mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。十六、总树脂苷类成分纯化时加入0. 5ml乙酸乙酯的制备方法是
I、制备牵牛子95%乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子95%乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将95%乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 5mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。十七、乙醇提取物的正丁醇萃取部位总树脂苷类成分的制备方法是
I、制备牵牛子95%乙醇提取液
取牵牛子粉碎，加入4倍的95%乙醇(指二者的重量比为I :4)，浸泡12 h，回流提取5h，过滤，反复3次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得牵牛子95%乙醇提取液的浸膏。2、制备正丁醇萃取物
将95%乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃�。�3次。合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物。3、总树脂苷类成分的纯化
取正丁醇萃取物，用95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 3mL乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。十八、精制后的总树脂苷类成分致肾毒性效果
I、供试液的制备
取实施例十五得到的淡黄色粉末的总树脂苷类成分，加水稀释至相当于药材浓度I. 5g/mL,作为牵牛子总树脂苷供试液。取关木通粉碎，加入4倍蒸馏水(指二者的重量比为I :4)，浸泡30 min后，加热至沸腾，煎煮60 min，倾出药液，过滤，反复煎煮2次。合并药液，过滤，浓缩至相当于关木通浓度1.5 g/ml作为阳性对照溶液(因为关木通目前经过很多学者多年的研究已被确认具有肾毒性作用，因此本发明中作为阳性对照。专利中本项内容主要是以此为对照确定了致肾毒性作用试验的有效性和剂量)。取蒸馏水为阴性对照组。
2、动物分组及给药方法
按大鼠体重随机将大鼠平均分为3组，即灌胃阴性对照组、灌胃牵牛子总树脂苷组(15 g/kg/day)和灌胃关木通阳性对照组(15 g/kg/day)。将三组大鼠放入代谢笼适应7天后，每天灌胃一次，连续灌胃14天。3、肾功能的测定
于给药前I天和给药后第14天，眼眶采血I mL至离心管，静置，离心取上层血清，Jaffe法测定血清肌酐(Cr, creatinine)浓度(参见图I);尿素酶偶联法测定血清尿素氮(BUN, blood urea nitrogen)浓度(参见图 2)。4、病理切片制作
取新鲜肾组织10%中性福尔马林溶液固定过夜，经酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成3 um切片，经苏木精-依红(HE)染色，置光学显微镜下观察(参见图3)。
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5、实验结果
给药后动物血清肌酶浓度明显升高，血清尿素氮浓度升高，病理切片显示牵牛子总苷组大鼠肾脏结构在给药后出现明显破坏，同时累及肾小球与肾小管，肾小球表现为毛细血管壁细胞坏死，脱落，肾小球肿胀，肾小囊消失。肾小管症状与阳性对照药关木通组相似。关木通组大鼠肾脏损伤部位主要为肾小管，表现为肾小管上皮细胞嗜酸变性，刷状缘消失。6、结论
牵牛子总苷确有致肾毒作用。
权利要求
1.牵牛子致肾毒性作用毒效部位是乙醇提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分。
2.制备权利要求I所述的牵牛子致肾毒性作用毒效部位即乙醇提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分的方法，其特征是 (1)制备牵牛子乙醇提取液取牵牛子粉碎，加入重量为牵牛子3 5倍的80% 100%乙醇，浸泡1(T15 h，回流提取4飞h，过滤，反复2 4次，合并滤液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得牵牛子乙醇提取液的浸膏； (2)制备正丁醇萃取物将乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取，各2 4次，合并正丁醇萃取液，经旋转蒸发仪50 V蒸干溶剂，得到正丁醇萃取物； (3)总树脂苷类成分的纯化取正丁醇萃取物，用809^95%的乙醇溶解，加入醋酸铅粉末直至不再有黄色沉淀生成，过滤，向滤液中通入H2S至不再有黑色沉淀生成，过滤，向滤液中加入0. 2^0. 5ml乙酸乙酯，经旋转蒸发仪60°C蒸干溶剂，得到牵牛子总树脂苷类成分的淡黄色粉末。
3.如权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤(I)中乙醇的体积分数为95%。
4.如权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤(I)中乙醇的加入量为牵牛子重量的4倍。
5.如权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤(I)中浸泡时间为12h。
6.如权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤(I)回流提取时间为5h。
7.如权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤(I)中回流提取次数为3次。
8.如权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤(2)中萃取次数为3次。
9.如权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤(3)中乙醇的体积分数为95%。
全文摘要
本发明提供一种牵牛子致肾毒性作用毒效部位及其制备方法，所要解决的问题是关注牵牛子治疗作用的同时应该重点关注其毒副作用。牵牛子致肾毒性作用的物质基础及部位不甚明确，成为中药现代化、国际化，可持续发展的瓶颈。本发明的要点是牵牛子致肾毒性作用毒效部位是乙醇提取物的正丁醇萃取部位的总树脂苷类成分。其制备方法是制备牵牛子乙醇提取液；制备正丁醇萃取物；总树脂苷类成分的纯化。本发明的用途是，在确定了牵牛子致肾毒性的有效部位总树脂苷类成分，可为牵牛子临床的安全应用提供依据。
文档编号G01N33/15GK102680293SQ201210133988
公开日2012年9月19日申请日期2012年5月3日优先权日2012年5月3日
发明者于治国, 俞悦, 刘珍珍, 张元媛, 毕开顺, 陈晓辉, 马超申请人:沈阳药科大学

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牵牛子致肾毒性作用毒效部位及其制备方法