专利名称：快速检测致病大肠杆菌的TiO<sub>2</sub>纳米带生物传感器芯片及系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品中细菌的检测技术领域。
背景技术：
食品安全问题一直是制约我国食品行业发展的瓶颈。据卫生部调查结果显示，微生物污染食品问题已成为目前影响我国食品卫生和安全的最主要因素，细菌性食物中毒造成的中毒人数最多，近两年占到总中毒人数的一半左右。
传统的细菌检测手段如细胞培养、荧光测试等不仅检测周期长而且耗费大量的人力物力，难以满足目前国内外对食品安全检测的要求。目前，酶联免疫吸附测定技术 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)以及聚合酶链反应法(Polymerase Chain Reaction, PCR)等常用的检测手段与传统方法相比，虽然能够有效的缩短分析时间，但是其检测时间仍长达五到六个小时，而且不能实现对细菌的实时检测。近年来，抗体或免疫传感器已经成为人们研究的热点，通过抗原抗体的相互作用，微生物可以被直接或间接的快速检测出来。实践证明，利用此原理制备的生物传感器具有低成本、高灵敏度、高稳定性和时时在线探测特种细菌的特点。特别是近年来，随着纳米技术的进步和微加工技术的不断成熟，纳米生物传感器也不断地被开发出来，并表现出良好的稳定性、灵敏度和寿命。
TiO2是一种宽带隙半导体氧化物，其在传感、光催化、燃料敏化太阳能电池以及电化学锂存储等方面有着重要的潜在应用价值。此外，其还具有良好的生物相容性、化学稳定性和可忽略的蛋白质变性作用，这些特殊的性能都使其成为理想的生物传感材料。发明内容
针对传统食品细菌检测方法的诸多问题，本发明目的第一目的是提供一种快速检测五种重要的食品致病菌的TiO2纳米带生物传感器芯片。
本发明包括两个平行的金电极和TiO2纳米带，所述TiO2纳米带连接在两个平行的金电极之间，所述TiO2纳米带为多层状纳米结构,所述TiO2纳米带的表面键合有若干轻基。
本发明还提出快速检测食品致病菌的系统本发明快速检测食品致病菌的系统包括生物传感器、阻抗检测电路、多级蠕动泵和交变磁�。錾锎衅靼ń萜�、出样容器和TiO2纳米带生物传感器芯片，进样容器和出样容器通过微流通道连通，TiO2纳米带生物传感器芯片中的TiO2纳米带置于所述微流通道内，TiO2纳米带生物传感器芯片中的两个平行的金电极分置于微流通道的两侧；所述 TiO2纳米带生物传感器芯片中的TiO2纳米带置于所述交变磁场内；在所述进样容器上分别连接细菌进样管和清洗液进样管，所述多通道蠕动泵分别设置在所述细菌进样管和清洗液进样管上；所述阻抗检测电路分别与两个金电极、多蠕动泵蠕动泵电连接。
本发明采用多层状TiO2纳米带做传感材料，其具有较大的面积，且表面键合大量的羟基，羟基可以很容易的与抗体相互作用，使得抗体被固定在纳米带表面，从而抗体可以快速捕获细菌，使用该纳米带生物传感器芯片检测细菌的时间由传统的五、六个小时缩短为50分钟；同时，TiO2纳米带面积可控，表面羟基的数目可控导致抗体固定数目的可控，从而在细菌数目较低到10 102cfu/ml时，细菌仍能被很好的检测到。蠕动泵可以实现高精度的给传感器进样，检测过程所需的细菌用量很少，利于节约成本。采用阻抗测量芯片测定阻抗，操作简单，测试速度快，便于使用。同时，与现有技术相比，利用本检测系统不需要对含有细菌的样本做复杂的预处理，从而缩短了细菌的检测时间，易于满足对细菌快速检测的需求。
本发明适合用于快速检测E. coli、non-0157 STEC、Salmonella、Listeria monocytogenes、和Campylobacter五种重要的食品致病菌。
进一步地，本发明所述阻抗检测电路包括相互连接的单片机和阻抗检测芯片。利用阻抗检测芯片来测定TiO2纳米带生物传感器芯片在抗体修饰前后及细菌捕获后I Hz I MHz范围内的阻抗谱。
图I是本发明具有多层状结构的TiO2纳米带示意图；图2是本发明含有TiO2纳米带生物传感器芯片的快速检测食品致病菌的系统的结构示意图；图3是本发明一种阻抗检测电路的单片机与串行通信�？榈牡缏吠迹煌�4是本发明一种阻抗检测电路的蠕动泵驱动及外围接口�？榈牡缏吠迹煌�5是本发明一种阻抗检测电路的阻抗检测�？榈牡缏吠迹煌�6是本发明一种阻抗检测电路的电源�？榈牡缏吠迹煌�7是本发明利用含TiO2纳米带生物传感器芯片的系统检测食品致病菌时，抗体固定前后及细菌捕获后TiO2纳米带生物传感器芯片的阻抗值与频率的关系曲线。
具体实施方式
一、本发明多层状结构TiO2纳米带采用溶液法制备，以下举例说明将0. 2 g TiO2粉末在不断搅拌下加入到2. O mol/L的Ca(OH)2和10 mol/L的NaOH混合液中，将此混合液转移到聚四氟乙烯反应釜中密封，在100 250°C下，于4小时至7天后得到产物，即具有多层状结构的TiO2纳米带。所得产物用去离子水冲洗至中性备用。
本发明所制得多层状纳米结构的TiO2纳米带的结构示意图见图I。多层状1102纳米带的表面键合有一定数目的羟基。该多层状纳米带具有价带可调、表面羟基数量可控的优点。通过调控反应时间的长短可以控制TiO2纳米带的面积，从而调节TiO2纳米带表面羟基的数目。羟基数目多，则固定抗体数量相应增加，可以提高TiO2纳米带的敏感性，使得在细菌数目低到10 102cfu/ml时，仍能被很好的检测到。
二、多层状结构的TiO2纳米带生物传感器芯片的制备过程如下将TiO2纳米带置于氧化硅基片上，然后采用光刻法制备两个平行的金电极与TiO2纳米带相连，使得在两个平行的金电极之间连接有TiO2纳米带。
使用本发明多层状TiO2纳米带生物传感器芯片时，将该生物传感器芯片的表面进行抗体修饰，具体过程如下将TiO2纳米带生物传感器芯片置于2-甲基-2-丙硫醇中对金电极表面进行修饰，然后分别用99. 5%乙醇和二次去离子水清洗。将致病性细菌抗体直接滴在TiO2纳米带生物芯片的表面上，在室温下孵育2小时，然后用去离子水冲洗，并在氮气气氛下干燥。这样表面修饰有抗体的TiO2纳米带生物传感器芯片就制成了。
三、本发明包含有多层状的TiO2纳米带生物传感器芯片的快速检测食品致病菌的系统主要有三部分构成生物传感器、自动进样清洗装置和阻抗检测电路。
图2是本发明快速检测食品致病菌的系统的结构示意图。该系统中的生物传感器包括微流通道3、进样容器4、出样容器5和TiO2纳米带生物传感器芯片，进样容器4和出样容器5通过微流通道3连通。
TiO2纳米带生物传感器芯片中的TiO2纳米带6置于微流通道3内，TiO2纳米带生物传感器芯片中的相互平行的金电极7和金电极8分置于微流通道3的两侧。TiO2纳米带生物传感器芯片的金电极7和金电极8通过导线与图4的阻抗检测电路的外围接口�？橹械慕酉叨俗覲3的VIN接线柱和VOUT接线柱连接。使用时，在微流通道3的两侧施加交变磁场9,使TiO2纳米带生物传感器芯片微流通道中的TiO2纳米带处于交变磁场内，这就会使免疫磁分离的细菌在微流通道3内流动时更易被TiO2纳米带上的抗体捕获。
在本发明快速检测食品致病菌的系统的自动进样清洗装置中，多级蠕动泵可以分别控制通道12和13，通过细菌进样管10与进样容器4连通，蠕动泵通过清洗液进样管11 与进样容器4连通。蠕动泵通过细菌进样管10自动给生物传感器定量注入致病大肠杆菌的培养液。通道于12和13的步进电机转速范围为O. I 50 rpm,流量最低可达I μ L/ min,以此来保证系统高精度控制细菌培养液的进样量。通过清洗液进样管11注入清洗液 (如蒸懼水)来清洗TiO2纳米带生物传感器芯片。
本发明的阻抗检测电路包括单片机与串行通信�？�、蠕动泵驱动及外围接口模块、阻抗检测模块及电源�？樗牟糠止钩桑鞲瞿？橹渫ü髂？榈缏吠贾邢嗤绫旰诺囊畔嗔�。
图3和图4分别是本发明一种阻抗检测电路的单片机与串行通信�？橐约叭涠们巴馕Ы涌谀？榈牡缏吠�。
图3中阻抗检测电路的核心控制芯片采用飞利浦公司P89C51型单片机。单片机 P89C51通过图4中的步进电机直流电机驱动电路中的ULN2803A达林顿集成驱动芯片U3 和光电耦合器U6来分别控制图2的通道12和13的开启、停止、加速减速及正反转。由于核心控制电路中的微控制器Ul的GPIO驱动能力有限，因此采用ULN2803A达林顿集成驱动芯片U3驱动图2中通道12的步进电机，蠕动泵驱动电路板中接线端子P2的1、2、3、4、5接线柱分别与图2中通道12的步进电机相连。微控制器Ul通过发出有序的矩形脉冲，控制 ULN2803A驱动四相步进电机实现加速、减速、正反转等功能。
图5是本发明一种阻抗检测电路的阻抗检测�？榈牡缏吠�。在阻抗检测�？橹胁捎肁DI公司的AD5933型高精度的阻抗测量芯片测定抗体固定前、抗体固定后以及细菌滴加后TiO2纳米线生物传感器芯片在I Hz I MHz频率范围内的阻抗谱。AD5933芯片由片上集成频率发生器与12位、IMSPS的模数转换器(ADC)组成。用频率发生器产生的信号来激励外部复阻抗，外部阻抗的响应信号由片上ADC进行采样，然后由片上DSP引擎进行离散傅里叶变换(DFT)处理。通过DFT算法在每个频率上返回一个实部(R)数据字和一个虚部(I) 数据字。校准之后，算出各扫描频率点的阻抗幅度和相对相位。随后图3中单片机P89C51通过串行通信�？榈腞S232接口把数据传递给上机位(PC机)用户。
图6是本发明阻抗检测电路的电源�？榈牡缏吠�。阻抗检测电路的各个�？橥ü嘤Φ亩丝谟氲缭茨？橄嗔Ｒ源死赐ü缭辞鞲瞿？榈恼Ｔ俗�
四、以大肠杆菌为例，举例说明利用本发明系统检测细菌的过程。
I、将TiO2纳米带生物传感器芯片置于微流通道中，使TiO2纳米带6与微流通道 3的流体流动方向相垂直，然后利用阻抗测定电路中的AD5933型高精度的阻抗测量芯片测定抗体固定前I Hz I MHz频率范围内TiO2纳米带生物传感器芯片的阻抗值；2、取出TiO2纳米带生物传感器芯片，对芯片表面进行抗体修饰，随后将抗体修饰的 TiO2纳米带生物传感器芯片置于微流通道3中，使TiO2纳米带6与微流通道3的流体流动方向相垂直，然后利用阻抗测定电路中的AD5933型高精度的阻抗测量芯片测定抗体固定后I Hz I MHz频率范围内TiO2纳米线生物传感器芯片的阻抗值；3、将通道12和13分别与阻抗检测电路电连接，通过阻抗检测电路控制第一蠕动泵向固定有TiO2纳米带生物传感器芯片的微流通道3注入致病大肠杆菌。利用阻抗测定电路中的AD5933型高精度的阻抗测量芯片测定细菌吸附后I Hz I MHz频率范围内TiO2纳米带生物传感器芯片的阻抗谱。随后利用阻抗检测电路控制13通道对固定有TiO2纳米带生物传感器芯片的微流通道3注入一定量的去离子水进行清洗，以用于重复使用。
五、检测结论图7是本发明利用含TiO2纳米带生物传感器芯片的系统检测致病大肠杆菌时，抗体固定前后及浓度为IO2 cfu/ml的细菌捕获后TiO2纳米带生物传感器芯片的阻抗值与频率的关系曲线。
从图7可见，抗体加入后，TiO2纳米带生物传感器芯片阻抗值降低。而当加入细菌后，TiO2纳米带生物传感器芯片阻抗值升高。这是由于当TiO2纳米带表面固定抗体后,TiO2 纳米带表面轻基与抗体结合使得抗体固定，同时TiO2纳米带与抗体发生静电吸引亦使得抗体被固定，由于抗体加入TiO2纳米带表面电荷减少引起阻抗降低；当对致病大肠杆菌进行检测时，抗体捕获细菌使得TiO2纳米带表面电荷增加而使得阻抗升高。这表明固定有抗体的TiO2纳米带生物传感器芯片可以快速检测致病性大肠杆菌。
权利要求
1.一种快速检测致病大肠杆菌的TiO2纳米带生物传感器芯片，其特征在于包括两个平行的金电极和TiO2纳米带,所述TiO2纳米带连接在两个平行的金电极之间,所述TiO2纳米带为多层状纳米结构，所述TiO2纳米带的表面键合有若干羟基。
2.一种包含权利要求I的TiO2纳米带生物传感器芯片的快速检测食品致病菌的系统，其特征在于包括生物传感器、阻抗检测电路、多通道蠕动泵和交变磁�。凰錾锎衅靼ń萜�、出样容器和TiO2纳米带生物传感器芯片，进样容器和出样容器通过微流通道连通，TiO2纳米带生物传感器芯片中的TiO2纳米带置于所述微流通道内，TiO2纳米带生物传感器芯片中的两个平行的金电极分置于微流通道的两侧；所述TiO2纳米带生物传感器芯片中的TiO2纳米带置于所述交变磁场内；在所述进样容器上分别连接细菌进样管和清洗液进样管，所述多通道蠕动泵分别设置在所述细菌进样管和清洗液进样管上；所述阻抗检测 电路分别与两个金电极、多蠕动泵蠕动泵电连接。
3.根据权利要求2所述的快速检测致病大肠杆菌的系统，其特征在于所述阻抗检测电路包括相互连接的单片机和阻抗检测芯片。
全文摘要
快速检测致病大肠杆菌的TiO2纳米带生物传感器芯片及系统，涉及食品中细菌的检测技术领域。TiO2纳米带生物传感器芯片是在两个平行的金电极之间连接有TiO2纳米带，TiO2纳米带为多层状纳米结构，TiO2纳米带的表面键合有羟基。快速检测食品致病菌的系统的生物传感器的进样容器和出样容器通过微流通道连通，TiO2纳米带生物传感器芯片中的TiO2纳米带置于微流通道内，TiO2纳米带生物传感器芯片中的两个平行的金电极分置于微流通道两侧，且TiO2纳米带置于磁场内；该系统内装有多级蠕动泵，分别连通细菌进样管与进样容器及清洗液进样管与进样容器。本发明可缩短细菌检测时间，避免交叉感染。
文档编号G01N27/02GK102928588SQ20121043245
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者董文钧, 沈金明, 沈旸 申请人:江苏康宝电器有限公司
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