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专利名称：一种三聚氰胺或三聚氰酸的测定方法及它的试剂盒或试纸条的制作方法
一种三聚氰胺或三聚氰酸的测定方法及它的试剂盒或试纸条技术领域：
本发明涉及医学、食品或环境检验与测定技术领域。更具体地，本发 明涉及三聚氰胺或三聚氰酸的测定方法，还涉及三聚氰胺或三聚氰酸测定 试剂盒或试纸条。背景技术：
三聚氰胺(melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰 胺、三聚酰胺，分子式C3N6H6或C3N3(NH2)3,分子量126.12,其机构式 如下三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料。在强酸或强碱液中，三 聚氰胺发生水解，胺基逐步地被羟基取代，首先生成三聚氰酸二酰胺，进 一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。三聚氰胺是一种重要 的化工材料，三聚氰胺与醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途 的材料，防火耐热且有很高的稳定性，是建筑业中常用的防火材料，并用 于生产塑料、厨房用具、防火纤维、商业滤膜、胶水和阻燃剂。三聚氰胺 不是食品、饲料的生产原料，也不是国家允许使用的食品、伺料添加物。早在2007年3月美国因宠物饲料致猫狗死亡而大量召回被三聚氰胺 污染的宠物甸料，研究人员发现，这些召回的宠物食品在其小麦谷蛋白添 加物中含有较高浓度的三聚氰胺。美国食品药品管理局调查显示，在召收 的宠物食品、死亡动物的尿液晶体和肾脏细胞中都发现有三聚氰胺。蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量约16%,而三聚氰胺的含氮量约66%。目前釆用的蛋白质测定方法"凯氏定氮法"是通过测定 样品中的含氮量来确定蛋白质含量的。由于现有食品和饲料蛋白质含量测 定方法存在的这种缺陷，由于在植物蛋白粉和饲料中使测定蛋白质含量增 加一个百分点，使用三聚氰胺的成本只是实际蛋白原料的1/5，于是一些 人有意将三聚氰胺用作食品和饲料添加剂，以便在食品和饲料质量检测中 抬高蛋白质含量，欺骗国家质检部门和消费者。三聚氰胺是一种白色结晶粉末，没有气味和味道，所以掺杂后不易被 发现。目前检测三聚氰胺的方法有气相色谱-质谱法、超高效液相色谱-电喷 雾串联质谱法、反相高效液相色谱法、高效液相色谱-二极管阵列法、高 效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-四极杆质谱联用、固相萃取与高效 液相色谱联用、液相色谱串联质谱法(LC-MS),测试成本高昂，测试速度 较慢。但目前还没有釆用酶法测定三聚氰胺或三聚氰酸的方法。因此，本 发明人经过大量的研究工作，终于作出了本发明。
发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种三聚氰胺的测定方法，该方法灵敏度高、精 确度好，线形范围宽广，专一性好，测试速度快速、测试成本低廉、稳定 期长，适于广泛地推广应用。本发明的目的是提供 一种三聚氰胺检测试剂盒或试纸条。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明的三聚氰胺测定方法是一种将强酸水解、酶联法(Couple Reaction)与其他物理法、化学法、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶循环扩增比色法(Enzymatic Recycling Method)组合而成 的一种三聚氰胺或三聚氰酸(cyanuric acid)测定方法。为了表述简便起见，除非另外特别地指出，在本文中提到三聚氰胺时，实际上它应该理解既是三聚氰胺，也是三聚氰酸。本发明涉及三聚氰胺的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下A、样品准备三聚氰胺在强酸的作用下可以进行水解反应，其三聚氰胺中的胺基逐 步地被羟基取代，生成相应的三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺，最后变 成三聚氰酸。因此，如果待测定物是三聚氰酸，则无需该处理步骤。A-l)标准样品的制备将1-3重量份三聚氰胺溶于3-9重量份含有10-40重量％无机强酸与 10-40重量％硫酸氢钠的溶液中，然后，让该混合溶液在温度150-17(TC 下加热3-5小时，再将该溶液冷却到室温，然后进行离心分离得到上清液， 往其中加入与所述无机强酸同等当量的无机强碱，中和在其溶液中存在的 无机强酸，再将三聚氰胺浓度调整到200ppm，得到的溶液作为标准样品；A-2)样品处理称取1-3重量份待测定样品，溶于3-9重量份含有10-40重量％无机 强酸与10-40重量％硫酸氢钠的溶液中，然后，让该混合溶液在150-170。C 下加热3-5小时，再将该溶液冷却到室温，然后进行离心得到上清液，往 其中加入与所述无机强酸同等当量的无机强碱，中和在其溶液中存在的无 机强酸，这样得到的上清液作为待测样品；A-3)空白的制备含有10-40重量％无机强酸与10-40重量％硫酸氢钠的溶液在温度 150-17(TC下加热3-5小时，再将该溶液冷却到室温，然后进行离心得到 的上清液，往其中加入与所述无机强酸同等当量的无机强碱，中和其溶液 中存在的无机强酸，这样得到的上清液作为空白样品，其三聚氰胺浓度为 Oppm。在本发明中，所述的含有10-40重量％无机强酸与10-40重量％硫酸 氢钠的溶液可以用55重量％无机强酸代替。 所述的无机强酸选自硫酸、硝酸或盐酸。优选地，所述的无机强酸是硫酸。所述的无机强碱选自氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂。 优选地，所述的无机强碱是氢氧化钠。 B、三聚氰酸酶解在步骤A)得到的标准样品、待测样品、空白样品在下述条件下分别进行三聚氰酸的酶解反应B-l )该酶解反应介质含有缓冲液 80-700mmol/L稳定剂 0.01 - 7mol/L三聚氰酸酰胺水解酶 1000 - 80000U/L双缩脲酰胺水解酶 1000 - 80000U/L脲基甲酸水解酶 1000 - 80000U/L上述这些试剂组成单剂试剂，在实际操作中称之试剂2;这些试剂可以 是粉末状的，在使用前加水进行溶解制成溶液；也可以配制成液体试剂， 直接使用。根据本发明，在所述的三聚氰酸酶解反应中，使用的缓冲液应该是能 够使其三聚氰酸酶解介质的pH在其水解反应期间基本保持在6.5 - 8.5的 溶液。如果该pH高于8.5或pH低于6.5,则酶活性达不到预期的活性效 果，需要添加更多的介质与酶，才有可能达到预期的活性效果。所述的缓冲液选自三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲 液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-l-丙醇缓冲液或双甘氨肽缓冲液。优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸 (Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液的缓冲液。更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸 (Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液的缓冲液。在本发明的意义上，所述的稳定剂应该理解是一种能保护试剂中的介 质(底物)与酶不会随着时间推移而改变其性质，进而失去活性的物质， 它会使得试剂具备很长的活性寿命，通常长达数月，甚至一、二年。如果没有所述的稳定剂，则试剂的活性在溶液中只能维持数小时，顶多数十小 时，就会失去活性而不再具备检测性能。在本发明中，所述的稳定剂使用量是0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够，则试剂活性的寿命就 会缩短；如果所述的稳定剂使用量过高，则会增加成本。在本发明中，所述的稳定剂是本技术领域的技术人员熟知的，例如是 一种或多种选自氯化钠、丙二醇、乙二醇、甘油、硫基乙醇、葡萄糖、腺 苷二磷酸、牛血清白蛋白、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸或谷氨酸钠等的稳定剂。优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自丙二醇、甘油、葡萄糖、 牛血清白蛋白、氯化钠的稳定剂。更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、牛血清白蛋白 的稳定剂。B-2)所述的三聚氰酸酶解进行下述三个酶催化反应 三聚氰酸依次在三聚氰酸酰胺水解酶、双缩脲酰胺水解酶与脲基甲酸水解酶的作用下最后得到二氧化碳(碳酸氢根；HCOf )和氨(胺；NH4+)，其反应如下三聚氰酸+水 三聚氰酸酰胺水解酶双缩脲+ 二氧化碳 双缩脲+水双缩脲酰胺水解酶脲基甲酸+氨 脲基甲酸+水脲基甲酸水解酶2二氧化碳+2氨 三聚氰酸在三聚氰酸酰胺水解酶(cyanuric acid amidohydrolase; EC 3.5.2.15)的作用下生成双缩脲和二氧化碳(碳酸氢根；HC03—),而双 缩脲在双缩脲酰胺水解酶(biuret amidohydrolase; EC3.5丄84)的作用下 生成脲基甲酸和氨(胺；NH4+),接着脲基甲酸在脲基甲酸水解酶 (allophanate hydrolase; EC3.5.1.54)的作用下生成二个二氧化碳(碳酸 氢根；HC03—)和二个氨(胺；NH4+)，因此，三聚氰酸经过三聚氰酸 酰胺水解酶、双缩脲酰胺水解酶、脲基甲酸水解酶的酶解作用后， 一个三 聚氰酸分子可以生成三个二氧化碳(HC03—)分子及三个氨(NH4+)分 子。这样，可以将测试灵敏度提高6倍。B-3)反应温度36-38。C,反应时间8-12分钟。 C、 二氧化碳与氨的定量测定釆用比色法，可以通过检测三聚氰酸酶解产物(二氧化碳及氨)的含量 测定三聚氰胺或三聚氰酸的含量。测定二氧化碳与氨的方法有很多，大致可以分成二类 一类是仪器测 试法，目前直接测试三聚氰胺或三聚氰酸的方法例如有HPLC、 GC、 MS 及其联用法，这些方法比釆用化学法直接测定三聚氰胺或三聚氰酸的灵敏 度提高三倍,但是过程繁瑣；目前巿场有多种仪器测定二氧化碳及氨含量, 它们主要用于临床测试及大气监测；另 一类是离子选择性电极法、电位法、 电化学法、离子交换技术、比色法等。这些方法的灵敏度都太低，即使灵 敏度提高三倍，也无法测定微量三聚氰胺或三聚氰酸。酶法测定二氧化碳 或氨有许多方法，目前巿场也有测定二氧化碳或氨的相应产品出售，本发 明人及申请人提出多项专利申请，其中涉及二氧化碳的有34项发明专利 申请，涉及氨的有37项发明专利申请。对于微量三聚氰胺或三聚氰酸的 测定，这些现有方法因其含量低还难以满足其要求。为此本发明人经过大量研究，获得一种灵敏度、精密度与再现性均好、 专一性与准确性高的微量三聚氰胺或三聚氰酸的测定方法。本发明是釆用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method )、酶比色 法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction ) 技术，通过测定烟酰胺辅酶或辅酶在340nm波长处的吸光度变化测定二 氧化碳及氨的浓度；或通过生成丐l嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色 原(Quioneimine dye )在400—700nm波长处的吸光度上升测定二氧化碳 及氨浓度的方法，从而测定微量三聚氰胺或三聚氰酸的含量。在该方法中，三聚氰胺与三聚氰酸水解时生成的氨和二氧化碳是采用 以下述反应为基础的测定方法测定的(1)氨+ a-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水(2) 谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨+ a-酮戊二酸十过氧化氢(3) 二氧化碳+乙酰辅酶A +还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+辅酶A+辅酶(4) 丙酮酸+磷酸根+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢(5) 2过氧化氢+2还原型辅酶NADH过氧化物酶 2辅酶+4水由前面所述可知， 一个三聚氰酸分子可以生成三个二氧化碳 (HC03一)及三个氨(NH4+)。 一个铵(胺)离子可以将二个还原型辅 酶分子氧化成一个辅酶分子，一个二氧化碳分子也可以将二个还原型辅酶 分子氧化成一个辅酶分子；通过上述酶反应， 一个三聚氰酸分子可以将 12个还原型辅酶分子氧化成辅酶，因此提高灵敏度12倍，加上上述的酶 循环扩增，氨离子及二氧化碳重复循环作用，5分钟可以循环数10次以 上，灵敏度总共可以提高至少数百倍，因此，这种方法具有非常高的灵敏 度。在测定氨时，使用谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase; EC 1.4丄2; EC 1.4.1.3; EC 1.4.1.4 )酶(偶)联谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11)、 NADH过氧化物酶(NADH peroxidase; EC l.ll丄l; EC1.11丄2)。所述的谷氨酸脱氢酶作为作用酶，将氨酶解成谷 氨酸。所述的谷氨酸氧化酶作为循环酶将谷氨酸再次转化成氨，使氨不断 地被重复循环利用。谷氨酸氧化酶又可以作为作用酶，在酶解谷氨酸时同 时产生过氧化氢。谷氨酸脱氢酶作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm 处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)；NADH过氧化物 酶也作为显色酶，在过氧化氢的作用下，也将还原型辅酶(在340nm处 有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)；从而能够通过测定 还原型辅酶在340nm处吸光度的下降速率(程度)；利用比色法，与标准 品吸光度的下降速率(程度)相比可以计算出氨的含量。测定二氧化碳时，使用丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51 )酶(偶)联的丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.3 )、 NADH 过氧化物酶(NADHperoxidase; EC 1.11.1.1; EC 1.11.1.2)。所述的丙酮 酸脱氢酶作为作用酶，将二氧化碳酶解成丙酮酸。丙酮酸氧化酶作为循环 酶再将这种丙酮酸转变成二氧化碳，使二氧化碳不断地被重复循环利用。 丙酮酸氧化酶又可以作为作用酶，在酶解丙酮酸时也同时产生过氧化氢。 丙酮酸脱氢酶作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化 成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)；NADH过氧化物酶也作为显色酶， 在过氧化氢的作用下，也将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成 为辅酶(在340nm处没有吸收峰)；从而能够通过测定还原型辅酶在340nm 处吸光度的下降速率(程度)；利用比色法，与标准品吸光度的下降速率 (程度)相比可以计算出二氧化碳的含量。通过大量实验研究表明，在测定样品中三聚氰胺与三聚氰酸含量时， 应该在下述测定条件下进行以达到比色法测定二氧化碳(碳酸氢根； HCO;T)及氨(铵(胺)；NH4+)所要求的准确性与再现性。制备试剂1:分别移取或称取下述缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、 谷氨酸氧化酶、NADH过氧化物酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、还 原型辅酶、(x-酮戊二酸、乙酰辅酶A,然后将它们混合均匀，使用时用水 将它们溶解得到 一种溶液，它们的浓度分别是50 — 500 mmol/L缓冲液 稳定剂谷氨酸脱氢酶谷氨酸氧化酶NADH过氧化物酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸氧化酶还原型辅酶a-酮戊二酸0.01-7 mol/L 1000- 80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000 - 80000 U/L 1000 - 80000 U/L 0.2 - 0.30 mmol/L 1 一 20 mmol/L乙酰辅酶A 0.5-20mmol/L它们可以组成单剂试剂或双剂试剂；在实际搡作中将单剂试剂称之 试剂l，而将双剂试剂分别称之试剂1与试剂3;谷氨酸脱氢酶、谷氨酸 氧化酶、NADH过氧化物酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、还原型辅 酶、a-酮戊二酸、乙酰辅酶A在试剂1和试剂3的位置是不限定的。所 述的还原型辅酶选自NADPH、 NADH或thio- NADH。这些试剂可以是 粉状的，使用前用水溶解得到水溶液；当然，也可以配制成液体试剂直接 使用。然后，把待测样品、所述的试剂1和试剂2加到生化分析仪中使这些 试剂浓度达到上述浓度，再在温度36-38。C下在主波长340nm与副波长 405nm处分别进行检测8-12分钟；标准样品和空白样品进行同样的检测；标准样品和空白样品进行如前面所描述的同样测定。在本发明中这种测定可以使用在目前巿场上销售的紫外/可见光分析 仪、半、全自动生化分析仪进行。例如由迈瑞公司以商品名BS300、奥林 帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名 7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全 自动生化分析仪。D、结果数据处理D-l根据前面测定结果按照下式计算样品中的三聚氰胺含量△A (样品)—AA (空白)三聚氰胺浓度^- x标准浓度(ppm)△A (标准)-AA (空白)式中△A (待测样品)表示待测样品在仪器上的吸光度变化； △A (空白)表示空白品在仪器上的吸光度变化； △A (标准)表示标准品在仪器上的吸光度变化。 D-2测定线性范围试验从B-5-l试验结果中，制备1200ppm标准品，再按比例稀释，测试结果呈线性，R值应符合1200ppm线性的规定。 D-3灵敏度试验 按校准结果计算。 D-4精密度试验将B-5-3试验结果按下式计算出精密度(CV):S=《(X—XilVn-l式中X -试验结果平均值； Xi -各次试验结果； n -试验次数.N210 CV=S/X* 100% D-5相对极差试验将B-5-3试验结果按下式计算相对极差 A IT- T(x + y + Z)，x^^第一lfb各次试验结果平均值 7^第二批各次试验结果平均值 Z~—第三批各次试验结果平均值U——为X， Y, Z中的最大值V——为X， Y， Z中的最小值每批试样数取nS3根据本发明的另一种优选实施方式，三聚氰胺或三聚氰酸水解时生成 的氨和二氧化碳可以釆用以下述反应为基础的测定方法进行测定(1)氨+过氧化氢+ a-酮戊二酸谷氨酸氧化酶 谷氨酸+氧+水(2) 谷氨酸+水+辅酶 谷氨酸脱氢酶 氨+01-酮戊二酸+还原型辅酶(3) 二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A 丙酮酸氧化酶丙酮酸+辅酶A+氧(4) 丙酮酸+辅酶A+辅酶 丙酮酸脱氢酶 二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶 由前面的反应可知，一个三聚氰酸分子可以生成三个二氧化碳分子与 三个氨分子。 一个氨离子可以将一个辅酶分子还原成一个还原型辅酶分 子， 一个二氧化碳分子也可以将一个辅酶分子还原成一个还原型辅酶分 子；通过上述这些酶反应， 一个三聚氰酸分子可以将6个辅酶分子还原成 还原型辅酶，因此可以提高灵敏度6倍，再加上酶循环扩增，氨离子及二 氧化碳重复循环作用，在5分钟内可以循环数10次以上，因此，该灵敏 度可提高至少上百倍。在测定氨时，使用谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11),酶(偶)联谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4丄3; EC 1.4丄4)。谷氨酸氧化酶作为作用酶，将氨酶解生成谷氨 酸。谷氨酸脱氢酶作为循环酶将谷氨酸再次转变成氨，使氨不断地被重复 循环利用。谷氨酸脱氢酶也作为显色酶，将辅酶(在340nm处没有吸收 峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)；从而能够通过测定还 原型辅酶在340nm处吸光度的上升速率(程度)；利用比色法，与标准品 吸光度的上升速率(程度)相比可以计算出氨的含量。在测定二氧化碳时，使用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6) 酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51 )。丙酮酸氧 化酶作为作用酶将二氧化碳酶解生成丙酮酸。丙酮酸脱氢酶作为循环酶将 丙酮酸再次转变成二氧化碳，使二氧化碳不断地被重复循环利用。丙酮酸 脱氢酶也作为显色酶，将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原 型辅酶(在340nm处有吸收峰)；从而能够通过测定还原型辅酶在340nm 处吸光度上升的速率(程度)；利用比色法，与标准品吸光度的上升速率(程度)相比可以计算出二氧化碳的含量。在该实施方式中使用前面描述的试剂2,而需要制备下述试剂1。试剂1的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷 氨酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、辅酶、a-酮戊二酸、过氧化 氢、乙酰辅酶A、辅酶A,然后将它们混合均匀，使用时再用水将它们溶 解得到一种溶液，它们的浓度分别是缓冲液 50- 500mmol/L稳定剂谷氨酸脱氢酶 谷氨酸氧化酶 丙酮酸脱氢酶 丙酮酸氧化酶 辅酶a-酮戊二酸过氧化氢 乙酰辅酶A 辅酶A0.01 - 7mol/L 1000- 80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 0.5 - 2.5 mmol/L 1 _ 20 mmol/L 1 _ 20 mmol/L 0.5 — 5 mmol/L 0.5 — 5 mmol/L它们可以组成单剂试剂或双剂试剂；在实际操作中将单剂试剂称之 试剂l,而将双剂试剂分别称之试剂1与试剂3;谷氨酸脱氢酶、谷氨酸 氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、辅酶、a-酮戊二酸、过氧化氢、 乙酰辅酶A、辅酶A在试剂1和试剂3中的位置是不限定的。所述的还 原型辅酶选自NADP+、 NAD+或thio-NAD+。这些试剂可以是粉状的，使 用前用水溶解得到水溶液；当然，也可以配制成液体试剂直接使用。然后，把待测样品、所述的试剂1和试剂2加到生化分析仪中使这些 试剂浓度达到上述浓度，再在温度36-38。C下在主波长340nm与副波长 405nm处分别进行检测8-12分钟；标准样品和空白样品进行同样的检测；其数据处理如前面所描述的。根据本发明的第三种优选实施方式，三聚氰胺或三聚氰酸水解时生成的氨和二氧化碳可以釆用以下述反应为基础的测定方法进行测定(1) 氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根(2) 磷酸根+腺苷二磷酸+草酖乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳(3) 二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+辅酶A+氧(4) 2丙酮酸+ 2辅酶A + 2辅酶丙酮酸脱氢酶 2二氧化碳+2乙酰辅酶A + 2还原型辅酶 由前面的反应可知，一个三聚氰酸分子可以生成三个二氧化碳分子与 三个氨分子。 一个氨离子可以将一个辅酶分子还原成一个还原型辅酶分 子， 一个氨离子还可以生成二个二氧化碳分子，因此会生成9个二氧化碳分子； 一个二氧化碳分子还可以将一个辅酶分子还原成还原型辅酶；通过上述这些酶反应， 一个三聚氰酸分子可以将12个辅酶分子还原成还原型 辅酶，提高灵敏度12倍，加上酶循环扩增，氨离子及二氧化碳重复循环 作用，在5分钟内可以循环数10次以上，，因此，该灵敏度可提高至少数 百倍。在测定氨时，使用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2 )， 酶(偶)联丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、丙酮酸脱氢酶 (pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51)。谷氨酰胺合成酶将氨酶解生成 磷酸根。丙酮酸羧化酶在腺苷二磷酸及草酰乙酸作用下，将磷酸根酶解生成丙酮酸与二氧化碳；丙酮酸脱氢酶作为显色酶，在丙酮酸作用下，将辅 酶(在340nm处没有吸收峰)还原成还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)； 从而能够通过测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速率(程度)；利 用比色法，与标准品吸光度的上升速率(程度)相比可以计算出氨的含在测定二氧化碳时，使用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6) 酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51 )。丙酮酸氧化酶作为作用酶将二氧化碳酶解生成丙酮酸。丙酮酸脱氢酶作为循环酶， 再将丙酮酸转变成二氧化碳，使二氧化碳不断地被重复循环利用。丙酮酸脱氢酶也作为显色酶，将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原 型辅酶(在340nm处有吸收峰)；从而能够通过测定还原型辅酶在340nm 处吸光度上升的速率(程度)；利用比色法，与标准品吸光度的上升速率 (程度)相比可以计算出二氧化碳的含量。在该实施方式中使用前面描述的试剂2，而需要制备下述试剂1。 试剂l的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、 丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷 酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A，然后将它 们混合均匀，使用时再用水将它们溶解得到 一种溶液，它们的浓度分别是50 - 500 mmol/L 0.01 -7mol/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000 - 80000 U/L 1000- 80000 U/L 0.5 - 2.5 mmol/L 1 - 20 mmol/L 0.5-5 mmol/L 0.5-5 mmol/TL 1 - 20 mmol/L 1 - 20 mmol/L 0.5-5 mmol/L 0.5-5 mmol/L 缓冲液不得使用磷酸缓冲液。它们可以组成单剂试剂或双剂试剂；在实际操作中将单剂试剂称之 试剂1，而将双剂试剂分别称之试剂1与试剂3;谷氨酰胺合成酶、丙酮缓冲液 稳定剂谷氨酰胺合成酶丙酮酸羧化酶丙酮酸氧化酶丙酮酸脱氢酶辅酶谷氨酸腺苷三磷酸腺苷二磷酸草酰乙酸过氧化氢乙酰辅酶A辅酶A酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A在试剂1和试剂3中的位置是不限定的。所述的还原型辅酶选自NADP+、 NAD+或thio-NAD+。这些试剂可以是粉状的，使用前用水溶解得到水溶液；当然，也 可以配制成液体试剂直接使用。然后，把待测样品、所述的试剂1和试剂2加到生化分析仪中使这些 试剂浓度达到上述浓度，再在温度36-38'C下在主波长340nm与副波长 405nm处分别进行检测8-12分钟；标准样品和空白样品进行同样的检测；其数据处理如前面所描述的。根据本发明的第四种优选实施方式，三聚氰胺或三聚氰酸水解时生成 的氨和二氧化碳可以釆用以下述反应为基础的测定方法进行测定(1) 氨+ a-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水(2) 谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨+01-酮戊二酸+过氧化氢(3) 二氧化碳+乙酰辅酶A +还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+辅酶A+辅酶(4) 辅酶A+丙酮酸+氧丙酮酸氧化酶过氧化氢+ 二氧化碳+乙酰辅酶A(5) 2过氧化氢+ 2还原型色原组合过氧化物酶2吲嗒胺色原或醌亚胺色原+ 2水 由前面的反应可知，一个三聚氰酸分子可以生成三个二氧化碳分子与 三个氨分子。 一个氨离子可以生成一个过氧化氢分子， 一个二氧化碳分子 也可以生成一个过氧化氢分子；通过过氧化物酶的作用，过氧化氢将还原 型色原组合(无色)氧化成有颜色的吲嗒胺色原或醌亚胺色原，通过上述 这些酶反应， 一个三聚氰酸分子可以生成6个过氧化氢分子，提高灵敏度 6倍，加上酶循环扩增，氨离子与二氧化碳重复循环作用，在5分钟内可 以循环10次以上，因此，该灵敏度可提高至少上百倍。吲嗒胺色原或醌亚胺色原的摩尔消光系数是12-20,比还原型辅酶的摩尔消光系数6.2 高2倍以上，因此本方法的灵敏度还要比上述三个方法都要高。在测定氨时，使用谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4.1.3; EC 1.4.1.4 )酶(偶)联谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11 )、过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11.1.7)。谷氨 酸脱氢酶作为作用酶将氨酶解生成谷氨酸。谷氨酸氧化酶作为循环酶，再 将谷氨酸转变成氨，使氨不断地被重复循环利用，因此连续不断地产生过 氧化氢。过氧化物酶作为显色酶，通过与过氧化氢的作用，使无色的还原 型色原体组合氧化成有色染料(吲嗒胺色原或醌亚胺色原)，从而可以使 用可见光分析仪器，在400 - 700nm (根据还原型色原体组合的不同而定) 波长处测定染料一吲嗒胺色原(Indamine dye )或醌亚胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收上升速率(程度),；利用比色法，与标准品吸 光度的上升速率(程度)相比可以计算出氨的含量。在测定二氧化碳时，使用丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51 )酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、过氧化 物酶(peroxidase ; EC Lll丄7)。丙酮酸脱氢酶作为作用酶将二氧化碳 酶解生成丙酮酸。丙酮酸氧化酶作为循环酶，再将丙酮酸转变成二氧化碳， 使二氧化碳不断地被重复循环利用，因此连续不断地产生过氧化氢。过氧 化物酶作为显色酶，通过与过氧化氢的作用，使无色的还原型色原体组合 氧化成有色染料(吲嗒胺色原或醌亚胺色原)，从而可以使用可见光分析 仪器，在400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)波长处测定 染料一吲嗒胺色原(Indamine dye )或醌亚胺色原(Quioneimine dye )— 含量高低的光吸收上升速率(程度)；利用比色法，与标准品吸光度的上 升速率(程度)相比可以计算出二氧化碳含量。在该实施方式中使用前面描述的试剂2，而需要制备下述试剂1。试剂1的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷 氨酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、还原型辅酶、 a-酮戊二酸、乙酰辅酶A、辅酶A、还原型色原体组合，然后将它们混合均匀，使用时再用水将它们溶解得到一种溶液，它们的浓度分别是:缓冲液 稳定剂谷氨酸脱氢酶 谷氨酸氧化酶 丙酮酸脱氢酶 丙酮酸氧化酶还原型辅酶a-酮戊二酸 乙酰辅酶A 辅酶A还原型色原体组合50- 500 mmol/L 0.01 -7mol/L 1000- 80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 0.1 -2mmol/L 1 - 20 mmol/L 0.5-5 mmol/L 0.5 — 5 mmol/L 0.1-20 mmol/L它们可以组成单剂试剂或双剂试剂；在实际操作中将单剂试剂称之 试剂1，而将双剂试剂分别称之试剂1与试剂3;谷氨酸脱氢酶、谷氨酸 氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、还原型辅酶、a-酮戊二酸、乙酰辅酶A、辅酶A、还原型色原体组合在试剂1和试剂3 中的位置是不限定的。所述的还原型辅酶选自NADPH、 NADH或thio-NADH。在本发明中，所述的还原型色原体组合(Chromogen)可以选自如下 (但不仅限于)组合 3-甲基-2-苯蓬哇酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯瘗唑酮腙N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯瘗唑酮腙2.4- 双氯石碳酸3-甲基-2-苯P塞唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3_甲基_2-苯蓬唑酮腙3.5- 双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯谨哇酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯蓬哇酮腙N-乙基-N- (2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯蓬哇酮腙 仨溴羟基苯甲酸3-甲基-2-苯鬼唑酮腙 双甲基苯胺3-甲基-2-苯虔唑酮腙N-乙基-N- (2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯嚷哇酮腙2，2，-AZINO-双(3-乙基苯。塞哇-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羟基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯瘗唾酮腙3- 甲基-乙基-羟基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-蓬p定腔4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒 仨溴羟基苯甲酸4-氨基抗砒 双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-双(3-乙基苯卩塞哇-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羟基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒3-甲基-乙基-羟基苯胺。然后，把待测样品、所述的试剂1和试剂2加到生化分析仪中使这些 试剂浓度达到上述浓度，再在温度36-38。C下在主波长400-700nm与副波 长410-800nm处分别进行检测8-12分钟；标准样品和空白样品进行同样其数据处理如前面所描述的。所有这些试剂可以是粉状的，使用前用水溶解得到水溶液；当然， 也可以配制成液体试剂直接使用。本发明还涉及一种三聚氰胺检测试剂盒，其特征在于它含有试剂1:缓冲液50 _ 500mmol/L、稳定剂0.01 - 7 mol/L、谷氨酸脱氢 酶1000 - 80000 U/L、谷氨酸氧化酶1000 - 80000 U/L、 NADH过氧化物 酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸脱氢酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸氧化酶1000 -80000 U/L、还原型辅酶0.2 - 0.30 mmol/L、 a-酮戊二酸1 - 20 mmol/L、 乙酰辅酶A0.5 - 20 mmol/L;上述试剂可以组成单剂试剂或双剂试剂；试剂2:缓冲液80-700mmol/L、稳定剂0.01 - 7mol/L、三聚氰酸酰 胺水解酶1000- 80000U/L、双缩脲酰胺水解酶1000-80000 U/L、脲基 甲酸水解酶1000 _ 80000U/L。根据本发明的一种优选实施方式，一种三聚氰胺检测试剂盒的特征在 于它含有试剂1:缓冲液50 - 500 mmol/L、稳定剂 0.01 - 7 mol/L、谷氨酸脱 氢酶1000 - 80000 U/L、谷氨酸氧化酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸脱氢酶 1000- 80000 U/L、丙酮酸氧化酶1000- 80000 U/L、辅酶 0.5 - 2.5 mmol/L、 a-酮戊二酸1 -20mmol/L、过氧化氢1 - 20mmol/L、乙酰辅酶 A0.5-5mmol/L、辅酶A 0.5-5 mmol/L;上述试剂可以组成单剂试剂 或双剂试剂；试剂2:缓冲液80 — 700mmol/L、稳定剂0.01 — 7mol/L、三聚氰酸酰 胺水解酶1000- 80000U/L、双缩脲酰胺水解酶1000 - 80000U/L、脲基 甲酸水解酶1000 - 80000U/L。根据本发明的另一种优选实施方式，一种三聚氰胺检测试剂盒的特征 在于它含有试剂1:缓冲液50 - 500 mmol/L、稳定剂 0.01 - 7 mol/L、谷氨酰胺 合成酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸羧化酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸氧化 酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸脱氢酶1000 - 80000 U/L、辅酶0.5-2.5 mmol/L、谷氨酸1 - 20 mmol/L、腺苷三磷酸0.5 - 5 mmol/L、腺苷二磷酸0.5-5mmol/L、草酰乙酸1 _ 20 mmol/L、过氧化氢1 - 20 mmol/L、乙酰 辅酶A0.5-5mmol/L、辅酶A 0.5 - 5 mmol/L;其中所述的缓冲液是非磷 酸盐缓冲液；上述试剂可以组成单剂试剂或双剂试剂；试剂2:缓冲液80 — 700mmol/L、稳定剂0.01 - 7mol/L、三聚氰酸酰 胺水解酶1000-80000U/L、双缩脲酰胺水解酶1000 - 80000 U/L、脲基 甲酸水解酶1000 - 80000U/L。根据本发明的另一种优选实施方式，一种三聚氰胺检测试剂盒的特征 在于它含有试剂1:缓冲液50 - 500 mmol/L、稳定剂0.01 -7 mol/L、谷氨酸脱 氢酶1000 - 80000 U/L、谷氨酸氧化酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸脱氢酶 1000 - 80000 U/L、丙酮酸氧化酶1000 - 80000 U/L、过氧化物酶1000 -80000 U/L、还原型辅酶0.1 - 2mmol/L、 a-酮戊二酸1 - 20 mmol/L、乙酰 辅酶A0.5-5mmol/L、辅酶A 0.5 - 5 mmol/L、还原型色原体组合0.1-20 mmol/TL;上述试剂可以组成单剂试剂或双剂试剂；其中所述的还原型色原体组 合如在前面所描述的。试剂2:缓冲液80-700mmol/L、稳定剂0.01 - 7mol/L、三聚氰酸酰 胺水解酶1000- 80000U/L、双缩脲酰胺水解酶1000-80000 U/L、脲基 甲酸水解酶1000 _ 80000U/L。另外，在本发明中，还可以将上述这些试剂盒的试剂按照其试剂盒 组成吸附在试纸条上，干燥后得到三聚氰胺检测试剂条，它们可以作为快 速检测之用。本发明的测定方法可以用于测定奶粉、鲜奶、奶制品或含奶产品等 各种产品中的三聚氰胺或三聚氰酸，还可以用于测定鲜牛、羊、猪、鸡肉 以及各种蛋及其它们的制品中的三聚氰胺或三聚氰酸。[有益效果]发明的方法测定速度快，每小时可测试120—3200个样品，每毫升试 剂可测试4一8个样品；灵敏度高，可测到0.05ppm;灵敏度可达到0.0015± 0.0005A/ppm、精确度可达到(误差《％),再现性好，测定成本低(每 亳升试剂人民币30-120元；每条试纸条成本0.5-2元)，因而具有广泛应 用的前景。
具体实施方式实施例l:奶粉中三聚氰胺的测定A、 样品预处理1) 标准样品称2mg纯三聚氰胺溶于30亳升含有35重量％硫酸与35重量％硫酸 氢钠的溶液中，在16(TC下加热4小时，再将该溶液冷却到室温，然后在 室温条件下进行离心，得到的上清液加入8亳升与所述硫酸同等当量的氢 氧化钠中和在该溶液中存在的硫酸，再用蒸馏水将该溶液调整到最终体积 40亳升；标准样品的三聚氰胺浓度为200ppm。2) 待测样品lg奶粉溶于3毫升含有35重量％硫酸与35重量％硫酸氢钠的溶液 中，在16(TC下加热4小时，再将该溶液冷却到室温，然后在室温条件下 进行离心，得到的上清液加入0.8毫升与所述硫酸同等当量的氢氧化钠中 和在该溶液中存在的硫酸，再用蒸馏水将该溶液调整到最终体积4毫升； 该溶液作为样品待测。3) 空白样品30亳升含有35%重量°/。硫酸与35重量％硫酸氢钠的溶液，在160°C 下加热4小时，再将该溶液冷却到室温，然后在室温条件下进行离心，得 到的上清液加入8亳升与所述硫酸同等当量的氢氧化钠中和在该溶液中 存在的硫酸，再用蒸馏水将该溶液调整到最终体积40亳升；空白样品的 三聚氰胺浓度为Oppm。B、 样品的测定测定样品使用日立7080全自动生化分析仪。 B-l、该全自动生化分析仪主要操作参数如下 计量方法 两点终点法测试计量时间点:19,31主波长:340副波长:405反应温度:37样品体积:20试剂1 ( Rl )体积:200试剂2 ( R2 )体积:25试剂3 ( R3 )体积:25反应方向:负标准样品1:0标准样品2:200B-2、试剂1的制备分别移取或称取所述的磷酸缓冲液(pH 8.0)、还原型辅酶、a-酮戊 二酸，然后将它们混合起来，再用水溶解得到试剂1溶液，它们在该溶液 中的浓度分别是100mmol/L、 0.32mmol/L、 15mmol/L。B-3、试剂2的制备分别移取或称取所述的磷酸缓冲液(pH 8.0)、甘油、三聚氰酸酰胺 水解酶、双缩脲酰胺水解酶和脲基甲酸水解酶，然后将它们混合起来，再 用水溶解得到试剂2溶液，它们在该溶液中的浓度分别是10Ommol/L、 3mol/L、 50000U/L、 60000U/L、 50000U/L。B-4、试剂3的制备分别移取或称取磷酸缓冲液(pH 8.0)、甘油、谷氨酸脱氢酶、谷氨 酸氧化酶、NADH过氧化物酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、乙酰辅 酶A,然后将它们混合起来，再用水溶解得到试剂3溶液，它们在该溶液 中的浓度分别是10Ommol/L、 3mol/L、 60000mmol/L、 50000U/L、 70000U/L、 70000U/L、 50000U/L、 20mmol/L。然后，待测样品、标准样品和空白样品置入仪器进行检测。B-5得到测定的结果按照说明书中说明的数据处理方法进行处理，其结果如下该奶粉中三聚氰胺含量是4.55ppm 测定线性范围试验表明R值符合1200ppm线性的规定。 灵敏度达到0.0018/ppm。 精密度是2% 相对极差是3%。实施例2:液态奶中三聚氰胺的测定A、 样品预处理与上述实施例1描述的相同，但使用的样品是液态奶。B、 样品的测定样品的测定使用全自动生化分析仪。B-l、该仪器的主要参数与前面实施例1描述的相同，除了反应方向 改为正。B-2、试剂1的制备分别移取或称取所述的Tris-盐酸缓冲液(pH8.2)、辅酶、过氧化氢、 a-酮戊二酸，然后将它们混合起来，再用水溶解得到试剂1溶液，它们在 该溶液中的浓度分别是10Ommol/L、 7mmol/L、 20mmol/L、 15mmol/L。B-3、试剂2的制备与前面实施例1描述的相同。B-4、试剂3的制备分别移取或称取Tris-盐酸缓冲液(pH8.2)、甘油、谷氨酸脱氢酶、 谷氨酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、辅酶、乙酰辅酶A，然后 将它们混合起来，再用水溶解得到试剂3溶液，它们在该溶液中的浓度分别是10Ommol/L、 3mol/L、 60000U/L、 50000U/L、 70000U/L、 50000U/L、 10 mmol/L 、 10 mmol/L 。B-5、结果数据处理与前面实施例1描述的相同。其结果如下: 该液体奶中三聚氰胺含量是0.87ppm 测定线性范围试验表明R值符合1200ppm线性的规定。 灵敏度达到0.0012/ppm。精密度是3% 相对极差是3%。实施例3:面包中三聚氰胺的测定A、 样品预处理与前面实施例l描述的相同，但使用的样品是面包。B、 样品的测定样品的测定在全自动生化分析仪，与前面实施例l描述的相同。 B-l、主要参数与前面实施例2描述的相同。 B-2、试剂1的制备分别移取或称取所述的Tris-盐酸缓冲液(pH8.2)、辅酶、谷氨酸、 腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、过氧化氢，然后将它们混合起来, 再用水溶解得到试剂1溶液，它们在该溶液中的浓度分别是100mmol/L、 8mmol/L、 20mmol/L 、 1Ommol/L 、 1Ommol/L 、 15mmol/L 、 20mmol/L。B-3、试剂2的制备(三聚氰酸的水解)与前面实施例1描述的相同。B-4、试剂3的制备分别移取或称取Tris-盐酸缓冲液(pH8.2)、甘油、谷氨酰胺合成酶、 丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、辅酶A、乙酰辅酶A，然 后将它们混合起来，再用水溶解得到试剂3溶液，它们在该溶液中的浓度 分别是10Ommol/L、 3mol/L、 60000mmol/L、 70000U/L、 80000U/L、 80000U/L、 1Ommol/L、 1Ommol/L。B-5、结果数据处理与前面实施例l描述的相同。其结果如下该面包中三聚氰胺含量是1.52ppm测定线性范围试验表明R值符合1200ppm线性的规定。灵敏度达到0.0019/ppm。精密度是2%相对极差是4%。实施例4:奶粉中三聚氰胺的测定 A、样品预处理与前面实施例1描述的相同，但使用的样品是奶粉。B、样品的测定使用常州若诺基仪器有限公司722可见光分光光度计。 B-l、单一试剂的制备分别移取或称取所述的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)、甘油、还原型辅 酶、(x-酮戊二酸、4-氨基抗砒、石碳酸、乙酰辅酶A、辅酶A、三聚氰酸 酰胺水解酶、双缩脲酰胺水解酶、脲基甲酸水解酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨 酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶，然后将它们混合 起来，再用水溶解得到试剂溶液，它们在该溶液中的浓度分别是 10Ommol/L、 2mol/L、 lmmol/L、 12mmol/L、 2mmol/L、 10mmol/L、 3 mmol/L、 3mmol/L、 50000U/L、 60000U/L、 50000U/L、 60000mmol/L、 50000U/L、 60000U/L、 50000U/L、 100000U/L。所述的单一试剂1亳升加到分光光度计的恒温比色皿中，再将0.08 毫升的样品同样加入比色皿中，混合均勻，在温度36-38。C下在波长505nm 处，进行检测，计量l-5分钟的吸光度的变化；标准样品和空白样品进行B-2、结果数据处理与前述相同。其结果如下 该奶粉中三聚氰胺含量是1.3邮pm 测定线性范围试验表明R值符合1200ppm线性的规定。 灵敏度达到0.00n/ppm。 精密度是1% 相对极差是3%。实施例5:液态奶中三聚氰胺的试纸条检测A、 样品预处理与前面实施例l描述的相同，但使用的样品是液态奶。B、 样品的测定B-l、单一试剂的制备分别移取或称取所述的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)、甘油、还原型辅 酶、a-酮戊二酸、4-氨基抗砒、石碳酸、乙酰辅酶A、辅酶A、三聚氰酸 酰胺水解酶、双缩脲酰胺水解酶、脲基甲酸水解酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶，然后将它们混合 起来，再用水溶解得到试剂溶液，它们在该溶液中的浓度分别是100mmol/L、 2mol/L、 lmmol/L、 12mmol/L、 2mmol/L、 10mmol/L、 3 mmol/L、 3mmol/L、 50000U/L、 60000U/L、 50000U/L、 60000mmol/L、 50000U/L、 60000U/L、 50000U/L、 100000U/L。将试纸条侵入溶液中后，干燥备用， 是为试纸条。将本发明的试纸条侵入液态奶中，立即取出，5分钟后观看颜色变化， 比较事前用不同浓度标准样品做成的比色板，可以得到初步结果。
权利要求
1、一种三聚氰胺的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下A、样品准备1)标准样品的制备将1-3份三聚氰胺溶于3-9重量份含有10-40重量％无机强酸与10-40重量％硫酸氢钠的混合溶液中，然后，让该混合溶液在温度150-170℃下加热3-5小时，再将该溶液冷却到室温，然后进行离心分离得到上清液，往其中加入与所述无机强酸同等当量的无机强碱，中和在其溶液中存在的无机强酸，再将三聚氰胺浓度调整到200ppm，得到的溶液作为标准样品；2)样品预处理称取1-3重量份待测定样品，溶于3-9重量份含有10-40重量％无机强酸与10-40重量％硫酸氢钠的溶液中，然后，让该混合溶液在150-170℃下加热3-5小时，再将该溶液冷却到室温，然后进行离心得到上清液，往其中加入与所述无机强酸同等当量的无机强碱，中和在其溶液中存在的无机强酸，这样得到的上清液作为待测样品；3)空白样品含有10-40重量％无机强酸与10-40重量％硫酸氢钠的溶液在温度150-170℃下加热3-5小时，再将该溶液冷却到室温，然后进行离心得到的上清液，往其中加入与所述无机强酸同等当量的无机强碱，中和其溶液中存在的无机强酸，这样得到的上清液作为空白样品，其三聚氰胺浓度为0ppm；B、三聚氰酸酶解在步骤A)得到的标准样品、待测样品、空白样品在下述条件下分别进行三聚氰酸的酶解反应B-1)该酶解反应介质含有缓冲液80-700mmol/L、稳定剂0.01-7mol/L、三聚氰酸酰胺水解酶1000-80000U/L、双缩脲酰胺水解酶1000-80000U/L、脲基甲酸水解酶1000-80000U/L；B-2)三聚氰酸依次在三聚氰酸酰胺水解酶、双缩脲酰胺水解酶与脲基甲酸水解酶的作用下进行酶催化反应，最后得到二氧化碳和氨；B-3)反应温度36-38℃，反应时间8-12分钟；C、二氧化碳与氨的定量测定首先，制备试剂试剂1的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、NADH过氧化物酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、还原型辅酶、α-酮戊二酸、乙酰辅酶A，然后将它们混合均匀，使用时用水将它们溶解得到一种溶液，它们的浓度分别是50-500mmol/L、0.01-7mol/L、1000-80000mmol/L、1000-80000U/L、100-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、0.2-0.3mmol/L、1-20mmol/L与0.5-20mmol/L；它们可以组成单剂试剂或双剂试剂；试剂2的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、三聚氰酸酰胺水解酶、双缩脲酰胺水解酶和脲基甲酸水解酶，然后将它们混合均匀，使用时用水将它们溶解得到一种溶液，它们的浓度分别是80-700mmol/L、0.01-7mol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L；然后，把待测样品、所述的试剂1和试剂2加到生化分析仪中使这些试剂浓度达到上述浓度，再在温度36-38℃下在主波长340nm与副波长405nm处分别进行检测8-12分钟；标准样品和空白样品进行同样的检测；D、数据处理由主波长340nm的吸光度变化，根据下式计算得到三聚氰胺含量ΔA(标准)-ΔA(空白)式中ΔA(待测样品)表示待测样品的吸光度变化；ΔA(空白)表示空白品的吸光度变化；ΔA(标准)表示标准品的吸光度变化。
2、 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述方法的步 骤C如下C、 二氧化碳与氨的定量测定 首先，制备下述试剂1与试剂2。试剂1的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、 谷氨酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、辅酶、a-酮戊二酸、 过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A,然后将它们混合均匀，使用时再用 水将它们溶解得到一种溶液，它们的浓度分别是50 - 500mmol/L、0.01 - 7mol/L 、 1000 -訓00mmol/L 、 1000 - 80000mmol/L 、 1000 -80000mmol/L、 1000 - 80000mmol/L、 0.5 — 2.5mmol/L、 1 — 20mmol/L、 1-20mmol/L、 0.5-5 mmol/L、 0.5-5 mmol/L;它们可以组成单剂试剂 或双剂试剂；试剂2的制备分别移取或称取所述的缓冲液、稳定剂、三聚氰 酸酰胺水解酶、双缩脲酰胺水解酶和脲基甲酸水解酶，然后将它们混 合起来，再用水将溶解得到一种溶液，它们在该溶液中的浓度分别是 80-700mmol/L、 0.01 — 7mol/L、 1000 — 80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L;然后，把待测样品、所述的试剂1和试剂2加到生化分析仪中使 这些试剂浓度达到上述浓度，再在温度36-38。C下在主波长340nm与 副波长405nm处分别进行检测8-12分钟；标准样品和空白样品进行 同样的检测。
3、 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述方法步骤 C如下C、 二氧化碳与氨的定量测定首先，制备下述试剂1与试剂2。试剂1的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶 A,然后将它们混合均匀，再用水将它们溶解得到一种溶液，它们的 浓度分别是50500mmol/L、 0.01 - 7mol/L、 1000 _ 80000U/L、 1000 -80000U/L、 1000- 80000U/L、 1000 - 80000U/L、 0.5 - 2.5 mmol/L、 1 - 20mmol/L、 0.5 - 5mmol/L、 0.5 - 5mmol/L、 1 - 20mmol/L、 1 -20mmol/L、 0.5-5mmol/L、 0.5 - 5mmol/L;其中所述的缓冲液是非 磷酸盐缓冲液；它们可以组成单剂试剂或双剂试剂；试剂2的制备分别移取或称取所述的缓冲液、稳定剂、三聚氰 酸酰胺水解酶、双缩脲酰胺水解酶和脲基甲酸水解酶，然后将它们混 合起来，再用水将溶解得到一种溶液，它们在该溶液中的浓度分别是 80-700mmol/L、 0.01 - 7mol/L、 1000 - 80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L;然后，把待测样品、所述的试剂1和试剂2加到生化分析仪中使 这些试剂浓度达到上述浓度，再在温度36-38。C下在主波长340nm与 副波长405nm处分别进行检测8-12分钟；标准样品和空白样品进行
4、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述方法的步 骤C如下C、 二氧化碳与氨的定量测定 首先，制备下述试剂1与试剂2。试剂1的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、 谷氨酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、还原型 辅酶、a-酮戊二酸、乙酰辅酶A、辅酶A、还原型色原体组合，然后 将它们混合均匀，使用时用水将它们溶解得到一种溶液，它们的浓度 分别是50- 500mmol/L、 0.01-7mol/L、 1000 - 80000mmol/L、 1000-80000mmol/L、 1000 - 80000mmol/L、 1000 - 80000mmol/L、 1000 -80000mmol/L、 0.1-2mmol/L、 1 - 20mmol/L、 0.5 - 5mmol/L、 0.5 - 5mmol/L、 0.1 - 20mmol/L;它们可以组成单剂试剂或双剂试剂；试剂2的制备分别移取或称取所述的缓冲液、稳定剂、三聚氰 酸酰胺水解酶、双缩脲酰胺水解酶和脲基甲酸水解酶，然后将它们混 合起来，再用水将溶解得到一种溶液，它们在该溶液中的浓度分别是 80-700mmol/L、 0.01 - 7mol/L、 1000 - 80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L;然后，把待测样品、所述的试剂1和试剂2加到生化分析仪中使 这些试剂浓度达到上述浓度，再在温度36-38。C下在主波长 400-700nm与副波长410-800nm处分别进行检测8-12分钟；标准样 品和空白样品进行同样的检测。
5、 一种三聚氰J 试剂1:稳定剂谷氨酸脱氢酶 谷氨酸氧化酶 NADH过氧化 丙酮酸脱氢酶 丙酮酸氧化酶 还原型辅酶 a-酮戊二酸 乙酰辅酶A其特征在于它含有50 - 500 mmol/L 0.01 - 7mol/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 0.2 - 0.30 mmol/L 1 - 20 mmol/L 0.5 — 20 mmol/L上述试剂可以组成单剂试剂或双剂试剂； 试剂2:缓冲液 80-700mmol/L 稳定剂 0.01 _ 7mol/L三聚氰酸酰胺水解酶 双缩脲酰胺水解酶 脲基甲酸水解酶
6、 一种三聚氰胺检测试剂盒，试剂1:缓冲液 稳定剂谷氨酸脱氢酶 谷氨酸氧化酶 丙酮酸脱氢酶 丙酮酸氧化酶 辅酶a-酮戊二酸乙酰辅酶A 辅酶A1000 - 80000U/L 1000- 80000U/L 1000- 80000U/L。其特征在于它含有50 - 500 mmol/L 0.01 - 7mol/L 1000 - 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 0.5 - 2.5 mmol/L 1 - 20 mmol/L 1 - 20 mmol/L 0.5-5 mmol/L 0.5 — 5 mmol/L上述试剂可以组成单剂试剂或双剂试剂 试剂2:缓冲液稳定剂三聚氰酸酰胺水解酶双缩脲酰胺水解酶脲基甲酸水解酶
7、 一种三聚氰胺检测试剂盒 试剂1:缓冲液稳定剂谷氨酰胺合成酶80 - 700mmol/L 0.01 - 7mol/L 1000- 80000U/L 1000- 80000U/L 1000-80000U/L。 其特征在于它含有0-500 mmol/L 0.01 _7mol/L 1000- 80000 U/L丙酮酸羧化酶1000-80000 U/L丙酮酸氧化酶1000 - 80000 U/L丙酮酸脱氢酶1000-80000 U/L辅酶0.5 — 2.5 mmol/L谷氨酸1 _ 20 mmol/L腺苷三磷酸0.5-5 mmol/L翁 黉 變0.5-5 mmol/L草酰乙酸1 _ 20 mmol/L过氧化氢1 _ 20 mmol/L乙酰辅酶A0.5-5 mmol/L辅酶A0.5-5 mmol/L其中所述的缓冲液是非磷酸盐缓冲液；上述试剂可以组成单剂试剂或双剂试剂; 试剂2:缓冲液稳定剂三聚氰酸酰胺水解酶双缩脲酰胺水解酶脲基甲酸水解酶
8、 一种三聚氰胺检测试剂盒 试剂1:缓冲液稳定剂谷氨酸脱氢酶 谷氨酸氧化酶 丙酮酸脱氢酶 丙酮酸氧化酶 过氧化物酶80 - 700mmol/L 0.01 - 7mol/L 1000-80000U/L 1000- 80000U/L 1000- 80000U/L 其特征在于它含有:50 — 500 mmol/L 0.01-7 mol/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L还原型辅酶 0.1-2 mmol/La-酮戊二酸 1-20mmol/L乙酰辅酶A 0.5-5 mmol/L辅酶A 0.5-5 mmol/L还原型色原体组合 0.1 - 20 mmol/L上述试剂可以组成单剂试剂或双剂试剂；试剂2:缓冲液 80-700mmol/L 稳定剂 0.01 _ 7mol/L三聚氰酸酰胺水解酶 1000 - 80000U/L双缩脲酰胺水解酶 1000 - 80000U/L脲基甲酸水解酶 1000 - 80000U/L。
9、 根据权利要求1-8中任一项权利要求所述的测定方法，其特 征在于所述的缓冲液选自三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液、磷酸盐 缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-l-丙醇缓冲液或双甘氨肽缓冲液。
10、 根据权利要求1-8中任一项权利要求所述的测定方法，其特 征在于所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、丙二醇、甘油、硫基 乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸钠、葡聚糖、乙二 胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸或谷氨酸钠的稳定剂。
全文摘要
本发明涉及医学、食品或环境检验与测定技术领域。更具体地，本发明涉及一种三聚氰胺或三聚氰酸的测定方法及它的试剂盒或试纸条，其中所述测定方法包括样品准备、三聚氰酸酶解、二氧化碳与氨的定量测定和数据处理等步骤。本方法测定速度快，灵敏度高，精确度高，再现性好，测定成本低，因而具有广泛应用的前景。
文档编号G01N21/31GK101403691SQ200810172189
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月14日 优先权日2008年11月14日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司