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专利名称：肝功能测定的血液检测样品的制作方法及采样试纸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种运用于肝功能测定的血液检测样品的制作及分析方法，特别是以半乳糖单点法(GSP)、半乳糖排除能力法(GEC)以及其它半乳糖法检验肝功能时，血液检测样品的制作及分析方法。
背景技术：
半乳糖单点法(Galactose Single Point Method，GSP)是用于评估肝病患者的残余肝功能(residual liver function)的方法，该方法可测定肝功能以及检验特殊代谢缺失对于新药品药效学的影响。
常规的半乳糖单点法为静脉注射0.5g/kg的半乳糖，并于60分钟后，测量血浆中的半乳糖浓度(Tang H.S.et al.(1992)Digestion，52222-231；Ranek L.etal.(1983)Clin.Physiol.3173-178)。其测量的方式是根据不同半乳糖标准溶液浓度与其吸光值的关系，制作标准曲线；同时将抽取的血液添加HClO4振荡混合，离心取上清液，于上清液中加入KOH振荡混合后再离心取上清液，上清液中再加入半乳糖去氢酶(galactose dehydrogenase)，为避免颜色反应不准确而置于暗室60分钟以制作血液检测样品，测定其吸光值，对照标准曲线找出其浓度值。
上述方法中，每个血液检测样品均以分阶段添加药剂的方式制作，且每加一次药剂都需经振荡、混合、离心的过程，再加上置于暗室60分钟的避光操作，其缺点为1)制作过程繁复耗时，使用的药剂种类及用量较多；2)无法于较短时间制作及分析大量的血液检测样品。

发明内容
本发明的目的是提供一种肝功能测定的血液检测样品的制作方法及采样试纸，利用简易的程序，使用较少的药剂种类及用量，大量制作血液检测样品并缩短其制作时间。
本发明所提供的肝功能测定的血液检测样品的制作方法，包括如下步骤步骤一，提供一种半乳糖组合物；步骤二，注射适量该半乳糖组合物进入受测者体内；步骤三，经一段间隔时间，抽取受测者血液，滴加适量于特定采样试纸上阴干；步骤四，将采样试纸上的阴干血液溶出，制成血液检测样品。
其中，步骤一所述半乳糖组合物包含有1wt％至50wt％半乳糖粉末，缓冲液及抗氧化剂；其pH值为4.0至9.0；其中，所述抗氧化剂为亚硫酸氢钠，所述缓冲液选自下列任一种或一种以上的缓冲液柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸缓冲液及三乙醇胺缓冲液。
上述半乳糖组合物中，所述半乳糖含量为总量的4wt％至40wt％。所述缓冲液添加量为总量的0.001wt％至5wt％。所述抗氧化剂添加含量为总量的0.001wt％至5wt％。
步骤二所述半乳糖组合物注射量为每人每公斤体重注入0.5g。
步骤三所述受测者血液滴加量优选为50～200微升，更优选为100微升。
步骤三所述滴加受测者血液时需一次滴加完毕，不可于阴干后再重复滴加。步骤三所述间隔时间为60分钟。
步骤四所述溶出过程的溶出液包含检测试剂、酶制剂及呈色剂。其中，所述检测试剂为三氯乙酸。所述酶制剂包含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)辅酶溶液和半乳糖去氢酶溶液。所述酶制剂包含体积百分比为75％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)辅酶溶液、体积百分比为1.25％的半乳糖去氢酶溶液和体积百分比23.75％的稀释液。
本发明所提供的肝功能测定的血液检测样品的采样试纸，是由纸浆制作的特定滤纸，所述纸张厚度达0.4mm以上，应用于上述的肝功能测定的血液检测样品的制作方法中，用以制作肝功能测定的血液检测样品。
本发明方法与现有的常规方法相比，具备下列特性及优点分析及测定过程简易，所使用的药剂种类及用量均较少；可于短时间内制作及测量大量的血液检测样品。


图1为本发明的流程图；图2为滴加不同体积全血的干血点，其半乳糖浓度分析图；图3为重复滴加血液对干血点半乳糖浓度的分析图；图4为干血点的稳定性分析图；图5为半乳糖浓度-吸光值的标准曲线图；图6为本发明方法与半乳糖单点法检测结果的相关性图。
其中，图1中数字代表步骤1制备半乳糖组合物2实施静脉注射3 60分钟后抽血4滴于滤纸上并阴干形成干血点5添加三氯乙酸
6添加酶溶液7添加呈色剂8完成血液检体之制作具体实施方式
(一)血液检测样品的制备本发明的血液检测样品的制作方法主要是运用于检验血液中半乳糖浓度，以之作为肝功能的指针。
如图1所示的流程图，首先配制半乳糖组合物(步骤1)，是将1wt％至50wt％(wt％在本发明中表示为g/100ml)，优选为4wt％至40wt％的半乳糖粉末，与缓冲液及抗氧化剂混合后，调整pH值为4.0至9.0而成的；其中抗氧化剂占总量的0.001wt％至5wt％，可选用亚硫酸氢钠(sodium bisulfite)；缓冲液占总量的0.001wt％至5wt％，可选自下列缓冲液中的任一种或一种以上柠檬酸缓冲液(citrate buffer)、磷酸缓冲液(phosphate buffer)、醋酸缓冲液(acetate buffer)、碳酸缓冲液(carbonate buffer)及三乙醇胺缓冲液(triethanolamine buffer)。接着注射(步骤2)该半乳糖组合物进入受测者体内；注射量可视状况不同而调整适量，一般为每人每公斤体重须注射0.5g半乳糖，受测者需空腹八小时以上。注射约60分钟后，取受测者血液(步骤3)数滴约0.5mL。
每个血液检测样品的制作是滴加100μL受测者血液于特定滤纸或GSP专用检验试纸上，如图2所示，滴加不同体积受测者血液于此专用滤纸上，其中滴加50μL及100μL样品所测出的半乳糖浓度-吸光值的标准曲线两者较相近，而滴加25μL样品所测得的标准曲线误差太大则无法使用；此外，由表1可看出不同材质及厚度的滤纸，对干血点浓度分析的影响使用纸浆制作的滤纸，其干血点分布较其它材质均匀，且纸张厚度须达0.4mm以上，所测出的半乳糖浓度的误差百分比才会在±15％以内。滴加血液时需一次滴加完毕，不可阴干后再重复滴加；如图3所示，先滴加25μL受测者血液于特定滤纸上，阴干后再重复滴加一次，与一次滴加完毕相比，该干血点的半乳糖浓度-吸光值的标准曲线，会随分布位置不同而有误差。
表1不同材质的滤纸对干血点浓度分析的影响



滴加受测者血液于特定试纸后，阴干约2小时后形成干血点(步骤4)，将之裁下收于包装袋中，保存于4℃下备用，可保存约2个月。由图4可看出特定试纸上的干血点的稳定性。为溶出试纸上的干血点，将之裁下置于具U形底的微盘(U bottom shapemicroplate)中，添加50μL的检测试剂，例如3％(重量百分比)三氯乙酸(TCA)(步骤5)，以400rpm振荡30分钟后，取40μL置于平底盘中；再添加100μL酶溶液(步骤6)(working enzyme reagent)后，仍以400rpm振荡30分钟，最后添加100μL呈色剂(color reagent)(步骤7)制成血液检测样品(步骤8)。上述酶溶液可以75％(体积百分比)的辅酶溶液(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+，stockcoenzyme reagent)、1.25％(体积百分比)的半乳糖去氢酶(D(+)Galactose Dehydrogenasesuspension)溶液及23.75％(体积百分比)的稀释液(enzyme diluent)配制。
(二)半乳糖浓度的测定肝功能的检验是以一微盘读取器(microplate reader)，选择在570nm吸收波长下，测定以上述方法制作的血液检测样品的吸光值，配合半乳糖浓度-吸光值的标准曲线，换算得到半乳糖浓度。
如图5所示，为一条半乳糖浓度-吸光值的标准曲线，分别配制浓度为100、300、500、600、800、1000μg/ml的半乳糖标准溶液，测其相对应的吸光值，所绘制的半乳糖浓度-吸光值的标准曲线的相关系数可达0.9990以上。
另以已知浓度为100、200、450、900μg/ml半乳糖溶液作为质控管，以测试操作人员的检验技术，确保所制作的标准曲线的准确度。
(三)实施人体肝功能检验选择34位受测者实施人体肝功能检验，检验方法包含以上述方法制作的血液检测样品以及进行血液检测样品中半乳糖浓度的测定，并与常规的半乳糖单点法检验结果相比较。
表2显示已知浓度的半乳糖溶液以常规的半乳糖单点法及本发明方法检验数据，常规半乳糖单点法的误差范围为0～14％，而本发明方法的误差范围为2～11％。
表2配制已知浓度检测样品以常规半乳糖单点法或本发明方法进行分析比较


表3显示以常规半乳糖单点法及本发明方法检验受测者血液中半乳糖浓度，两者的相关性如图6所示，呈显著正相关。
表3受试者血中半乳糖浓度以常规半乳糖单点法或本发明方法分析的比较

权利要求
1.一种肝功能测定的血液检测样品的制作方法，包括如下步骤步骤一，提供一种半乳糖组合物；步骤二，注射适量该半乳糖组合物进入受测者体内；步骤三，经一段间隔时间，抽取受测者血液，滴加适量于特定采样试纸上阴干；步骤四，将采样试纸上的阴干血液溶出，制成血液检测样品。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于步骤一所述半乳糖组合物包含有1wt％至5wt％半乳糖粉末，缓冲液及抗氧化剂；其pH值为4.0至9.0；其中，所述抗氧化剂为亚硫酸氢钠，所述缓冲液选自下列任一种或一种以上的缓冲液柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸缓冲液及三乙醇胺缓冲液。
3.根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于所述半乳糖含量为总量的4wt％至40wt％。
4.根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于所述缓冲液添加量为总量的0.001wt％至5wt％。
5.根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于所述抗氧化剂添加含量为总量的0.001wt％至5wt％。
6.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于步骤二所述半乳糖组合物注射量为每人每公斤体重注入0.5g。
7.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于步骤三所述受测者血液滴加量优选为50～200微升，更优选为100微升。
8.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于步骤三所述滴加受测者血液时需一次滴加完毕，不可于阴干后再重复滴加。
9.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于步骤三所述间隔时间为60分钟。
10.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于步骤四所述溶出过程的溶出液包含检测试剂、酶制剂及呈色剂。
11.根据权利要求10所述的制作方法，其特征在于所述检测试剂为三氯乙酸。
12.根据权利要求10所述的制作方法，其特征在于所述酶制剂包含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)辅酶溶液和半乳糖去氢酶溶液。
13.根据权利要求10所述的制作方法，其特征在于所述酶制剂包含体积百分比为75％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)辅酶溶液、体积百分比为1.25％的半乳糖去氢酶溶液和体积百分比23.75％的稀释液。
14.一种肝功能测定的血液检测样品的采样试纸，是为纸浆制作的特定滤纸，所述纸张厚度达0.4mm以上，应用于权利要求1中所述的肝功能测定的血液检测样品制作方法上，用以制作肝功能测定的血液检测样品。
全文摘要
本发明公开了一种肝功能测定的血液检测样品的制作方法及采样试纸。本发明的方法是注射一种半乳糖组合物进入受测者体内；经一段间隔时间后，适量取受测者血液滴于滤纸上阴干；将滤纸上阴干血液利用三氯乙酸溶出，并以一种酶溶液溶出，制成血液检测样品，最后再以微盘分析仪分析此血液检测样品中的半乳糖浓度。
文档编号G01N33/66GK1786683SQ20041009844
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者胡幼圃, 熊正辉, 薛孟娟, 鲍力恒 申请人:雅各生技有限公司