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专利名称：用以评估肿瘤增生、侵犯或转移风险的生物标记及方法
技术领域：
本发明是关于一种用以评估肿瘤增生、侵犯或转移风险的生物标记及使用此生物标记评估的方法，尤其指一种可早期评估肿瘤增生、侵犯或转移风险的生物标记及使用此生物标记评估的方法。
背景技术：
近年研究发现，食物或食物添加剂、及环境污染均会直接导致癌症产生。不仅仅在台湾，世界各国的发展中国家的癌症发生率亦逐渐提升。此外，依照美国癌症协会公开数据显示，癌症可视为对人类健康造成严重威胁的因素之一。若可早期侦测到肿瘤增生、侵犯或转移，则可大幅提升癌症病患的存活率。因此，各种研究均试图找出一种可早期分析或预测癌症的方法。近年来，随着基因检测及蛋白质体学的发展，目前已发展出多种可用以分析或预测癌症的生物标记，如甲胎蛋 白(a-fetoprotein, AFP)、T 细胞侵犯和转移蛋白 I (T-cell lymphoma invasion andmetastasis 1，TIAM1)、及神经型I丐粘素(n-cadherin)。然而，上述的生物标记仍有其应用上的限制。例如，AFP为一种用于诊断肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的有效血清标记,但却有40%的伪阴性。此外，神经型钙粘素基因表现增加仅与术后癌症发生有关，且仅可于63. 8%的肝癌病患中观察到TIAMl过量表现。另一方面，由于这些蛋白质亦表现在正常肝脏组织中，故不易判定这些蛋白的病理上的过量表现。因此，目前仍需要提供一种生物标记及使用其的评估方法，以提升评估肿瘤增生、侵犯或转移的风险准确性。此外，肝癌为全世界前五大常见癌症之一，尤以亚洲及非洲更为盛行。尽管引发肝癌的病因相当广泛，其中之一明显的病症为癌细胞早期血管侵入及转移。若可早期判断出肝癌增生及侵入/转移，则可大幅降低肝癌发生率及死亡率。因此。目前亦须提供一种生物标记及使用其的评估方法，其可准确的评估肝癌肿瘤细胞增生、侵犯或转移的风险。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用以评估肿瘤增生、侵犯、或转移风险的方法，通过本发明的方法可准确评估肿瘤增生、侵入、或转移的风险。本发明的另一目的在于提供一种用以评估肿瘤增生、侵犯、或转移风险的生物标记，通过此生物标记可判断待测肿瘤区域是否为肿瘤组织。为实现上述目的，本发明提供的用以评估肿瘤增生、侵犯、或转移风险的方法，包括下列步骤(A)提供一用以评估肿瘤增生、侵犯、或转移风险的组织样品，其中组织样品包括一非肿瘤区域、及一待测肿瘤区域，且组织样品为一选自由肝脏组织、乳房组织、胰脏组织、脑组织、胸腺组织、前列腺组织、大肠组织、或其它固态组织所组成的群组的组织样品；(B)分别侦测非肿瘤区域、及待测肿瘤区域中一生物标记、及一内标准标记的表现量，其中生物标记为T细胞侵犯和转移蛋白2 ;以及(C)通过下列式(I)，比较生物标记及内标准标记于非肿瘤区域及待测肿瘤区域中的表现量式(I)数值=(待测肿瘤区域中的生物标记的表现量/待测肿瘤区域中的内标准标记的表现量)_(非肿瘤区域中的生物标记的表现量/非肿瘤区域中的内标准标记的表现量)；其中，当数值为正值时，表示具有肝癌、 乳癌、胸腺癌、前列腺癌、大肠癌、胰脏癌、或其它固态癌的肿瘤增生、侵犯、或转移风险；且当数值为负值时，表示具有脑癌的肿瘤增生、侵犯、或转移风险。此外，本发明提供的用以评估肿瘤增生、侵犯、或转移风险的生物标记，其选自由T细胞侵犯和转移蛋白 2 (T-cell lymphoma invasion andmetastasis I, TIAM2)的核苷酸链、互补核苷酸链、核苷酸链衍生物、蛋白质、蛋白质衍生物、蛋白质的肽链、及突变蛋白质所组成的群组。于本发明的方法中，是使用TIAM2蛋白作为生物标记。当使用本发明的方法评估一受试者是否有肿瘤增生、侵犯、或转移风险时，可大幅提升预测准确率。此外，本发明亦提供一种新颖的生物标记TIAM2，其特别显著表现在肿瘤细胞中。因此，当使用本发明的生物标记评估肿瘤增生、侵犯、或转移风险时，可大幅提升预测准确率。特别是，相较于公知生物标记及方法，本发明的生物标记及方法更可评估固态瘤的侵入或转移的风险。据此，本发明的生物标记及方法可于早期预测固态瘤的严重性，故医疗人员可对患者进行有效的治疗，以延缓肿瘤细胞侵入或转移至血管。于本发明的方法中，非肿瘤区域是指正常组织区域。较佳为，非肿瘤区域为待测肿瘤区域周围的组织。此外，于本发明中，「风险」是指待测肿瘤区域中细胞可能为肿瘤细胞的可能性，或受试者罹患癌症的可能性。此外，当所计算出的数值为正值时，表示待测肿瘤区域为癌细胞区域，即肿瘤组织区域，而受试者会面临肿瘤增生、侵犯、或转移的风险。再者，本发明的方法除了可用以预测肿瘤增生外，更可预测肿瘤侵犯或转移。当所计算出的数值为正值/负值时，表示肿瘤细胞可能容易侵犯或转移至血管中；而侵犯或转移的肿瘤细胞可能会导致癌症病症更加严重，且发展出转移性癌症。此外，于本发明的生物标记及方法中，TIAM2可为T细胞侵犯和转移蛋白2短型(T-cell lymphoma invasion and metastasis 2 short form,TIAM2S)、或T细胞侵犯和转移蛋白 2 长型(T-cell lymphoma invasion and metastasis 21ong form,TIAM2L) 较佳为，TIAM2为TIAM2S。再者，于本发明的生物标记及方法中，TIAM2的核苷酸链序列为SEQID NO 1 ；TIAM2S的表现核苷酸链序列为SEQ ID NO 2 ;而TIAM2S的蛋白质序列为SEQ IDNO :3。于本发明的生物标记及方法中，肿瘤可为肝癌肿瘤、乳癌肿瘤、胰脏癌肿瘤、脑癌肿瘤、胸腺癌肿瘤、前列腺肿瘤、大肠癌肿瘤、或其它固态癌症肿瘤。较佳为，肿瘤为肝癌肿瘤。此外，于本发明的生物标记及方法中，组织样品可为任一待测组织结节。例如，组织样品可为肝脏、乳房、胰脏、脑、胸腺、前列腺、大肠直肠、或其它组织的组织结节。较佳为，组织结节为肝结节。
再者，于本发明的生物标记及方法中，表现量为蛋白质表现量。当表现量为蛋白质表现量时，可通过任一公知蛋白质表现分析法进行侦测。较佳为，本发明的方法系透过西方墨点法、凝胶电泳法、酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)、免疫组织化学法(IHC)、免疫沉淀法(IP)、或质谱分析法(MS)侦测蛋白质表现量。更佳为，本发明的方法是通过西方墨点法侦测蛋白质表现量。此外，于本发明的评估方法中，内标准标记可为 a-微管蛋白(a-tubulin)、甘油醒 _3_ 憐酸脱氧酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)、或P _肌动蛋白(P-actin)。较佳为，内标准标记为a_微管蛋白、或￠-肌动蛋白。更佳为，内标准标记为a-微管蛋白。当表现量为mRNA表现量时，可通过任一公知RNA表现分析法进行侦测。较佳为，mRNA表现量可通过定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reversetranscription PCR)、或反转录聚合酶连锁反应(reverse transcription PCR)侦测 mRNA表现量。更佳为，mRNA表现量是通过定量实时反转录聚合酶连锁反应进行侦测。此外，分析mRNA表现量时，可使用18S rRNA、a -微管蛋白mRNA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA、或 & -肌动蛋白mRNA作为内标准标记。更佳为，是使用18S rRNA作为内标准标记。


图I是大脑、肝脏、胸腺、乳房、前列腺、胰脏、及大肠的正常及肿瘤组织的中TIAM2S的mRNA表现结果。图2是成对HCC细胞中TIAM2S的mRNA表现结果。图3是西方墨点测试定量分析结果。图4是不同病理时期的HCC样品的TIAM2S蛋白质表现关系图。图5是细胞增生试验结果图。图6是细胞侵犯试验结果图。图7A至图7C是活体内癌化程度分析结果图。
具体实施例方式接下来结合附图，详细描述本发明的其它目的、优点及特征。以下是由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟习此技艺的人士可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明亦可由其它不同的具体实施例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可针对不同观点与应用，在不悖离本发明的精神下进行各种修饰与变更。以半定量RT-PCR及西方墨点法鉴定正常组织与肿瘤组织中内生性TIAM2S表现量在此，是使用由Clontech(Palo Alto, CA)及 Biochain(Hayward, CA)购得的不同人类组织的cDNA样本盘，样本盘内包括正常大脑组织、大脑肿瘤组织、正常肝组织、肝肿瘤组织、正常胸腺组织、胸腺肿瘤组织、正常乳房组织、乳癌肿瘤组织、正常前列腺组织、前列腺肿瘤组织、正常胰脏组织、胰脏癌肿瘤组织、正常大肠组织、及大肠癌肿瘤组织。使用TIAM2S专一性PCR引子放大TIAM2S。PCR反应参数如下先于95°C加热5分钟，再进行放大反应共30周期(于95°C下进行30秒、64°C下进行20秒、及72°C下进行20秒)，最后再于72°C延长反应10分钟。以8%丙酰胺(acrylamide)胶体分离PCR产物。使用Alphaimage1200 (Alpha Innotech Corporation, SanLeandro, CA),利用点密度函数(spot densityfunction)，由每一 PCR产物测量TIAM2S于不同组织的相对表现量，并以IKb的DNA标记(Invitrogen)中200bp带的密度作为标准。每一组织中mRNA表现结果如图I所示。此夕卜，亦由Biochain (Hayward，CA)购得正常人类组织总体蛋白，包括正常大脑组织、正常肝组织、正常胸腺组织、正常乳房组织、正常前列腺组织、正常胰脏组织、及正常大肠组织。此夕卜，于用以进行西方墨点测试的抗体中，兔子抗-a -微管蛋白抗体是购自Cell SignalingTechnology (MA, USA),而山羊抗-TIAM2S 抗体则购自 Santa Cruz Biotech (CA, USA)。西方墨点测试是以下述方式进行。首先，将30 yg蛋白质注入置于Tris-甘胺酸缓冲溶液(IOmM Tris, 50mM glycine, 0. 1% SDS,pH 8.0)中的 6% SDS-PAGE，并以电泳进行分离。而后，将SDS-PAGE上的蛋白质转溃至PVDF膜上，并以含有5%无脂牛 奶的TBST(10mMTris-HCl,pH7. 5，150mM NaCl，and 0. 05% Tween 20)封填膜至少 I 小时，再以一级 TIAM2S抗体反应隔夜。以TBST清洗膜4次,再以辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)-共轭键结的二级抗体反应2小时。于清洗后，以增强化学发光系统(ECL system) (PerkinElmerLife Science, Waltham, MA)侦测膜上讯号。于西方墨点测试中，a_微管蛋白作为一控制组，以分析TIAM2S蛋白总量。如图I所示，于肝肿瘤组织、乳癌肿瘤组织、及胰脏癌肿瘤组织中可观察到TIAM2S的mRNA表现。然而，并未于正常肝组织、正常乳房组织、及正常胰脏组织中观察到TIAM2S的mRNA表现。反之，于正常大脑组织、正常胸腺组织、正常前列腺组织、及正常大肠组织中可观察到TIAM2S的mRNA表现，但于大脑肿瘤组织、胸腺肿瘤组织、前列腺肿瘤组织、及大肠癌肿瘤组织则未观察到TIAM2S的mRNA表现。再者，仅正常大脑组织观察到大量TIAM2S蛋白质表现，此结果表示TIAM2S蛋白质表现可能受到特殊转译调节所控制。上述结果显示，TIAM2S于许多固态肿瘤中均可观察到异常mRNA表现，表示TIAM2S为一种潜在与肿瘤相关的基因；而相较于TIAM2S的mRNA，此基因产物，即TIAM2S蛋白质更可适用于做为一生物标记。收集肝癌组织样品以手术方式，由肝癌病人身上(病人年龄介于13至85岁，且平均年龄为57.9±15. 6)收集共88组(肿瘤区域与非肿瘤区域)、及3组转移肝癌样品。其中，27组及59组样品分别由国立成功大学附设医院的外科部及中国台湾肝癌网(TLCN)取得。使用组织学检查诊断肝癌。样品收集是经由IRB委员会认可，且经病患同意进行试验。分别并切下组织中的肿瘤区域及邻近正常组织区域，于手术后随即进行冷冻，以进行后续核酸及蛋白萃取试验。另由国立成功大学附设医院病理科的癌症组织数据库中，取得从四位病患取得的另外七组肝癌转移组织，且从TLCN取得30组良性血管瘤(8位男性及22位女性)作为控制组。于91组肝癌样品中，32组样品为病理分期第I期(35%)，26组样品为病理分期第II期(29% )，而25组样品为病理分期第III期(27% )。以定量实时RT-PCR测量HCC细胞中TIAM2S的mRNA表现量依据Rezol C&T(Protech Technology, Taipei, Taiwan)使用手册，由肝癌冷冻样品中萃取总 RNA。依照 TaqMan 试验(Applied Biosystems,Foster City,CA)使用手册，以qRT-PCR分析TIAM2S及18S核糖体RNA (18S rRNA)表现量。以2_匕ACt法计量每一 HCC肿瘤样品中的TIAM2S的mRNA的相对表现量，在此同时以每一样品的18S rRNA表现量作为内标准。所有测量均重复进行三次，而所有试验均独立进行至少两次。20组HCC样品是用以测量HCC细胞中TIAM2S的mRNA异位表现，并以相对应正常组织中相对TIAM2SmRNA表现量作为内标准，以标准化(normalize)每一肿瘤细胞中TIAM2SmRNA的异位表现量。HCC细胞中TIAM2S的mRNA表现结果如图2所示。如图2所示，HCC细胞中TIAM2S的mRNA表现量相对于正常组织中TIAM2S的mRNA表现量，且由成对t值检定(paired-t test)结果显示，TIAM2S的mRNA显著表现于肿瘤细胞中:P = 0. 0043)。此外，于20组HCC细胞的TIAM2S的mRNA检测结果显示，65%(13/20)的HCC病人的肿瘤区域中，其TIAM2S的mRNA表现量相对高于正常组织(从2倍至9倍)。以西方墨点测试测量HCC细胞中TIAM2S蛋白质表现取大约150mg的上述HCC样品，并于液态氮中急速冷冻。将冷冻的样品添加至ImL的 RIPA 缓冲液中(50mM Tris, pH 8. 0、150mM NaClU% Triton X_100、0. 5%脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)、0. I % SDS、lmMPMSF、及蛋白酶抑制剂混合物)，并于冰上随即以组 织均质机将组织均质化。以ImL的RIPA缓冲液洗下细胞裂解物两次，并持续于4°C下搅拌混合20分钟以维持细胞裂解液的均质性，再于4°C以19，600Xg离心20分钟。收集上清液，并以西方墨点测试进行分析。西方墨点测试结果显示，TIAM2S蛋白仅表现在肿瘤细胞中，但不表现在正常细胞中。此外，于血管瘤中并未侦测到或少量侦测到TIAM2S蛋白表现。此结果显示，TIAM2S蛋白仅专一表现在HCC细胞中。另一方面，分别以HCC细胞及正常肝脏细胞中a-微管蛋白作为内标准，分析每一病人的HCC细胞及正常肝脏细胞的TIAM2S蛋白质表现量，而表现量分析主要根据西方墨点密度进行标准化计算。于HCC细胞及正常细胞中的TIAM2S及a-微管蛋白的西方墨点密度需由同一病患取得。在此，使用下式(II)进行标准化计算，而密度及数值整理于表I中。式(II)数值=(HCC细胞中的TIAM2S密度/HCC细胞中的a -微管蛋白密度)-(正常肝脏细胞中的TIAM2S密度/正常肝脏细胞中的a -微管蛋白密度)表I
权利要求
1.一种用以评估肿瘤增生、侵犯、或转移风险的方法，包括下列步骤 (A)提供一用以评估肿瘤增生、侵犯、或转移风险的组织样品，其中该组织样品包括一非肿瘤区域、及一待测肿瘤区域，且该组织样品为一选自由肝脏组织、乳房组织、胰脏组织、脑组织、胸腺组织、前列腺组织、大肠组织或其它固态组织所组成的群组的组织样品； (B)分别侦测该非肿瘤区域、及该待测肿瘤区域中一生物标记、及一内标准标记的表现量，其中该生物标记为T细胞侵犯和转移蛋白2 ;以及 (C)通过下列式(I)，比较该生物标记及该内标准标记于该非肿瘤区域及该待测肿瘤区域中的表现量 式⑴ 数值=(该待测肿瘤区域中的该生物标记的表现量/该待测肿瘤区域中的该内标准标记的表现量)-(该非肿瘤区域中的该生物标记的表现量/该非肿瘤区域中的该内标准标记的表现量) 其中，当数值为正值时，表示具有肝癌、乳癌、胸腺癌、前列腺癌、大肠癌、胰脏癌、或其它固态癌的肿瘤增生、侵犯、或转移风险；且当数值为负值时，表示具有脑癌的肿瘤增生、侵犯、或转移风险。
2.如权利要求I所述的方法，其中，该T细胞侵犯和转移蛋白2为T细胞侵犯和转移蛋白2短型。
3.如权利要求2所述的方法，其中，该生物标记选自由T细胞侵犯和转移蛋白2短型的核苷酸链、互补核苷酸链、核苷酸链衍生物、蛋白质、蛋白质衍生物、蛋白质的肽链、及突变蛋白质所组成的群组。
4.如权利要求I所述的方法，其中，该肿瘤为肝肿瘤。
5.如权利要求I所述的方法，其中，该组织样品为一组织结节。
6.如权利要求5所述的方法，其中，该组织样品为一肝结节。
7.如权利要求I所述的方法，其中，该表现量为蛋白质表现量。
8.如权利要求7所述的方法，其中，该蛋白质表现量是通过西方墨点法、凝胶电泳法、酵素结合免疫吸附分析法、免疫组织化学法、免疫沉淀法或质谱分析法进行侦测。
9.如权利要求8所述的方法，其中，该内标准标记为a-微管蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶或￠-肌动蛋白。
10.一种用以评估肿瘤增生、侵犯、或转移风险的生物标记，其选自由T细胞侵犯和转移蛋白2的核苷酸链、互补核苷酸链、核苷酸链衍生物、蛋白质、蛋白质衍生物、蛋白质的肽链及突变蛋白质所组成的群组。
11.如权利要求10所述的生物标记，其中，该T细胞侵犯和转移蛋白2为T细胞侵犯和转移蛋白2短型。
12.如权利要求10所述的生物标记，其中，该T细胞侵犯和转移蛋白2的核苷酸链序列为 SEQ ID NO : I。
13.如权利要求11所述的生物标记，其中，该T细胞侵犯和转移蛋白2短型的表现核苷酸链序列为SEQ ID NO :2。
14.如权利要求13所述的生物标记，其中，该T细胞侵犯和转移蛋白2短型的蛋白质序列为 SEQ ID NO :3。
15.如权利要求14所述的生物标记，其中，该肿瘤为肝癌肿瘤、乳癌肿瘤、胸腺癌肿瘤、前列腺癌肿瘤、大肠癌肿瘤、胰脏癌肿瘤或其它固态癌症肿瘤。
16.如权利要求15所述的生物标记，其中，该肿瘤为肝肿瘤。
全文摘要
一种用以评估肿瘤增生、侵犯或转移风险的生物标记及方法，其中，本发明的评估方法包括下列步骤(A)提供一用以评估肿瘤增生、侵犯、或转移风险的组织样品，其中组织样品包括一非肿瘤区域、及一待测肿瘤区域；(B)分别侦测非肿瘤区域、及待测肿瘤区域中一生物标记、及一内标准标记的表现量，其中生物标记为T细胞侵犯和转移蛋白2；以及(C)比较生物标记及内标准标记于非肿瘤区域及待测肿瘤区域中的表现量。
文档编号G01N33/68GK102768281SQ20121000151
公开日2012年11月7日 申请日期2012年1月5日 优先权日2011年5月3日
发明者孙孝芳, 陈嘉兴 申请人:孙孝芳