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专利名称：凝集素富集和¹⁸O标记结合自定义算法的糖蛋白组定量方法
技术领域：
本发明涉及一种糖蛋白组定量方法，具体涉及一种用于糖蛋白组学研究的凝集素富集和18O标记结合自定义算法的糖蛋白组定量方法，属于生物技术领域。
背景技术：
蛋白的糖基化是重要的翻译后修饰，对于蛋白的折叠、稳定性和活性都有着重要的意义。蛋白的糖基化和糖型改变在慢性炎症、免疫应答、细胞识别及细胞免疫调控等病理生理过程中均起重要作用，且在恶性肿瘤的发生过程中参与细胞的恶性转化、提示病灶周围的微环境变化并与恶性肿瘤的发展侵袭紧密相关；很多已知的癌相关生物标志物 (Biomarker)都是糖蛋白，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)等； 这些都决定着糖蛋白组学在疾病及肿瘤研究中具有重要而独特的地位。如何目的性的富集糖蛋白并进行有效识别和定量是目前糖蛋白组学研究中的主要难题。研究人员已建立很多富集技术用于N糖基化蛋白分析，但这些技术多集中于以下三种情况，I)研究糖基转移酶的改变或样品中糖蛋白/糖肽的总体糖基化程度和糖链结构改变趋势，但不能明确单个糖蛋白发生的具体糖链结构的改变情况；2)针对单独的蛋白进行糖链变化研究，如AFP异质体就是利用AFP蛋白N糖链上的a 1-6岩藻糖的增加来进行诊断，但每次实验只能选择性的研究一种或数种蛋白在特定糖链类型上的水平改变；3)研究糖链结构在不同疾病状态下的整体改变情况，但无法将这些糖链结构改变和具体的蛋白结合起来，只能孤立的进行总体糖链改变的研究。这些方法均针对于样本中的总糖蛋白或总糖链进行研究，无法实现对组织或血液等复杂生物样本中大量复杂糖蛋白的糖基化改变的高通量定量研究，而复杂样本中每个糖蛋白的糖基化改变都会导致相应糖蛋白功能的改变，从而引起人体的病理变化过程，尤其是参与肿瘤的发生和侵袭转移过程。18O标记是一种相对简单、特异和成本效益好的稳定同位素标记技术，它可以对样本中所有胰蛋白酶裂解的肽段C端羧酸进行普遍而序列独立性的标记，同时没有副反应的发生。研究者对其进行了不断的完善，LiU等富集总糖肽后在肽段C端及N糖基化位点序贯标记3个180，与18O标记的糖肽产生6Da质量差，提高了糖基化位点鉴定和相对定量研究的准确性，得到较好的结果。但这种3180的标记技术，没有成熟的计算机自动化处理算法和专用软件，只能依靠手工计算，这也是以往的开发者所特别指出的不足之处(Liu et al. Proteome Res 9，227-236，2010)，对于大样本量的复杂生物样本的数据处理显然力不从心，同时这个方法尚无法确定发生糖基化改变的糖蛋白所发生的具体糖链结构变化。本发明针对上述糖蛋白研究中富集、标记和计算等主要问题，建立了一个整体性的策略，应用凝集素层析富集不同糖链特征的蛋白样本，联合固化胰酶(Immobilized Trypsin)及N-糖酰胺酶(PNGase-F)进行序贯18O标记,将不同糖型的配对蛋白样本以液相色谱-质谱(LC-MS)进行相对定量，而且建立基于Mascot Distiller软件(版本2. 3. 2. 0， Matrix Science公司)的自定义的自动化算法进行数据处理，最终能够全面研究复杂生物样本中的不同糖链结构类型的糖蛋白改变情况。本发明在标准糖蛋白中验证了此方法的准确性和可重复性，又以健康人和肝癌患者的血清以ConA(concanavalin A)、LCH(Lens culinaris)和WGA(Wheat Germ agglutintin)三种凝集素层析后进行标记,通过自建的算法获得了定量数据，并加以验证，显示了这种方法可以高通量的获取复杂样本中糖蛋白的糖型变化，改进层析和标记方法后，这种整体性的研究策略可以应用在更广泛的组织标本或体液标本中，有利于疾病生物标志物的发现和疾病的治疗。

发明内容
本发明的目的是提供一种糖蛋白组定量方法，用于在复杂的生物样本中，进行相对定量的高通量糖蛋白组学研究，寻找疾病相关糖基化位点，分析糖基化程度改变、糖链结构变化与病变的关系，寻找疾病相关的糖生物标志物，进行相关药理学和药效学研究，以真正了解糖蛋白的糖型对于疾病发生发展的意义。为了达到上述目的，本发明提供了一种糖蛋白组定量方法，其特征在于，具体步骤为第一步将来自不同疾病或者相同疾病不同阶段患者的血清样本分为两组，(各组样本根据研究目的可以等量混合或不混合)，除去高丰度蛋白，测定蛋白浓度，取等蛋白量样本进行除盐和酶解；第二步将第一步所得的酶解产物进行凝集素亲和层析以得到相应的亚糖蛋白组，冻干;第三步分别以H218O和H216O制备的溶液重溶两组样本，联合固化胰酶进行C端标记，冻干后，再分别以H218O和H216O制备的溶液重溶两组样本，联合N-糖酰胺酶进行N糖基化位点标记，冻干；第四步将两组样本混合上样进行液相色谱-质谱检测，建立基于Mascot Distiller的自定义算法进行定量数据处理。优选地，所述的自定义定量算法采用的定量协议为前导扫描(precursor)，所述的自定义定量算法中定义了三个独有修饰组(exclusive modification groups)来进行计算，A组(Group A)定义为2个18O标记在C端及I个18O标记在N糖基化位点，B组(Group B)定义为I个18O标记在C端及I个18O标记在N糖基化位点，C组(Group C)定义为16O标记在上述位点，相对的丰度比值由以下公式计算得到ratio (180/160) = (Group A+Group B) /Group C ；其中，ratio (180/160)代表18O标记的糖肽与16O标记糖肽的丰度比值，GroupA, Group B和Group C分别代表A组、B组和C组的丰度。本发明的优点为I)本发明优化结合了最新的18O标记技术、凝集素富集技术，以及自定制的定量算法，形成了一个完整的高通量定量糖蛋白组研究技术策略。经过在标准糖蛋白和实际临床样本上的验证,此方法拥有足够的精确性和可重复性,在I : 10 10 I的范围之内能够保持线性，可精确的反应样本中不同N-糖链结构糖型的糖蛋白变化，能够可靠的应用于生物样本的糖蛋白与疾病关系的研究中。2)此方法有机地融入了凝集素层析的糖蛋白富集技术，弥补了以往研究方法中将糖蛋白和糖链结构类型的变化孤立进行研究的缺陷，并能够在一次实验中定量研究复杂生物样本中所有发生改变的糖蛋白的蛋白表达水平、糖基化位点、糖基化程度和糖链结构类型的变化。3)由于使用凝集素富集糖蛋白，将整个糖蛋白质组分成了更多的亚组进行研究， 减低了样本的复杂度，使各个凝集素水平上能够辨认到的发生改变的蛋白总数，多于单纯的全糖蛋白质组研究，这对于更好的低丰度生物标志物的发现也具有一定的意义4)在多凝集素水平同时发生不同变化的一系列糖蛋白，这种不同亚糖蛋白组的序列性改变，其本身作为疾病诊断和预后判断的生物标志物，可以较单一糖链或糖蛋白水平的生物标志物更有特异性。5)本方法应用3个18O标记糖蛋白产生足够大的质量差异(6Da)，使质谱能够更准确的识别和测量糖肽；对于复杂生物样品中得到的大量数据，自定义的自动化软件算法可以较手工计算更快更大规模的进行处理，并给出糖肽和糖蛋白的相对定量值，同时保持其准确性，可以高通量的进行试验数据的分析，能够用于手工定量计算无法处理的临床复杂样品的巨量数据的分析。


图I为本发明的具体流程图。图2为应用固化胰酶及N-糖酰胺酶在糖肽上标记3个18O的反应过程图。图3A为质谱图示18O标记后标准糖蛋白在非糖肽中所产生的不同质量差异。图3B为质谱图示18O标记后标准糖蛋白在糖肽中所产生的不同质量差异。图4A为各比率下标准糖蛋白Invertase中糖肽FATN*TTLTK的手动计算结果线性曲线图；*为N糖基化位点。图4B为各比率下标准糖蛋白Invertase中糖妝FATN*TTLTK的Mascot Distiller 计算结果线性曲线图；*为N糖基化位点。图4C为各比率下标准糖蛋白Invertase中糖肽LMTN*ETSDRPLVHFTPNK的手动计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。图4D为各比率下标准糖蛋白Invertase中糖肽LMTN*ETSDRPLVHFTPNK的Mascot Distiller计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。图4E为各比率下标准糖蛋白Fetuin中糖肽AESN*GSYLQLVEISR的手动计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。图4F为各比率下标准糖蛋白Fetuin中糖肽AESN*GSYLQLVEISR的Mascot Distiller计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。图4G为各比率下标准糖蛋白Fetuin中糖肽LAPLN*DSR的手动计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。图4H为各比率下标准糖蛋白Fetuin中糖妝LAPLN*DSR的Mascot Distiller计算结果线性曲线图，*为N糖基化位点。图5A为18O标记的样本组的样本与16O标记的样本组的样本I : I混合时来自标准糖蛋白Invertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。图5B为18O标记的样本组的样本与16O标记的样本组的样本I : 2混合时来自标准糖蛋白hvertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。图5C为1セ标记的样本组的样本与1fiO标记的样本组的样本21混合时来自标 准糖蛋白hvertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。图5D为1セ标记的样本组的样本与1fiO标记的样本组的样本15混合时来自标 准糖蛋白hvertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。图5E为1セ标记的样本组的样本与1fiO标记的样本组的样本51混合时来自标 准糖蛋白hvertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。图5F为1セ标记的样本组的样本与1fiO标记的样本组的样本101混合时来自标 准糖蛋白hvertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。图5G为1セ标记的样本组的样本与1fiO标记的样本组的样本110混合时来自标 准糖蛋白hvertase中的糖肽FATN*TTLTK的质谱图，*为N糖基化位点。图6A为MascotDistiller得出的标准糖蛋白Invertase在各混合比率下的蛋白 标准曲线。图6B为MascotDistiller得出的标准糖蛋白！^etuin在各混合比率下的蛋白标 准曲线。图7A为ConA富集的血清糖蛋白Clusterin的去糖基化肽LAN*LTQGEDQYYLR的质 谱图；图7B为ConA富集的血清糖蛋白Clusterin的糖肽的b、y离子序列谱图；图7C为ConA富集的血清糖蛋白Clusterin的非糖肽的b、y离子序列谱图；图8A为肝癌患者组和对照组间对应ConA、LCH、WGA水平发生不同丰度变化的糖肽。图8B为肝癌患者组和对照组间对应ConA、LCH、WGA水平发生不同丰度变化的糖蛋白。
9A ^ イ吏 M Trans-Proteomic Pipel ine Ver. 4. 5 (TPP, Seattle ProteomeCenter)中的自定义定量工具XPRESS，对实验数据进行处理所得结果图。图9B 为使用 Trans-Proteomic Pipeline Ver. 4. 5(TPP, Seattle Proteome Center)中的自定义定量工具ASAP ratio，对实验数据进行处理所得结果图。
具体实施例方式本发明提供了ー种凝集素富集1%标记结合自定义算法的糖蛋白组定量方法， 其特征在于，应用凝集素层析将具有不同糖链特征的糖蛋白样本分离成相应的亚糖蛋白 组，联合固化胰酶及N-糖酰胺酶进行序贯~标记，将不同糖型的配对蛋白样本以液相色 谱-质谱进行相对定量，建立基于Mascot Distiller的自定义算法进行定量数据处理，最 终能够实现高通量的研究复杂生物样本中的与某一病理过程，如肿瘤的侵袭转移密切相关 的多种糖蛋白糖基化改变，包括糖基化位点、糖基化程度及糖链结构的定量和定性改变。下面结合实施例来具体说明本发明。实施例1方法学的建立如图1所示，本发明的糖蛋白定量方法的具体步骤为第一歩标准糖蛋白样本制备
将标准糖蛋白牛胎球蛋白(Bovine fetuin, Sigma公司)200ug和酵母转化酶 (Yeast invertase, Sigma 公司)200ug,分别用 50mM NH4HCO3 溶解后得到浓度为 lug/uL 的蛋白样本；第二步蛋白样本酶解将第一步所得的浓度为lug/uL的蛋白样本在100°C水浴10分钟，恢复至室温后， 加入二硫苏糖醇(Dithiothreitol, Sigma公司)，所加入的二硫苏糖醇的量为IOmM(在蛋白样本溶液中的浓度)，在57 °C孵育30分钟，再加入碘乙酰胺(Iodoacetamide，GE Healthcare公司)，所加入的碘乙酰胺的量为30mM (在蛋白样本溶液中的浓度)，室温避光孵育60分钟，最后再加入二硫苏糖醇，所加入的二硫苏糖醇的量为IOmM(在蛋白样本溶液中的浓度)，57°C孵育10分钟。将所得的混合物用3kDa截留分子量(MWCO)的 Spin column (Pierce公司)除盐后,将所得的除盐混合物按照I : 80的质量比加入胰酶 (Trypsin, Sigma公司)，37°C孵育4小时,将所得的部分酶解混合物再按照I : 80的质量比加入胰酶，37°C孵育12小时，酶解后的样本100°C水浴10分钟并立即置于冰上5分钟，以充分萃灭胰酶得到酶解后的肽样本，防止后步操作中回标的发生。整个方法中，各步骤各组均同步进行，以避免组间差异。第三步、凝集素亲和层析选用ConA凝集素进行亲和层析。以固定ConA的树脂装柱,并以Binding Buffer 洗柱3次，将第一步所得的酶解后的肽样本以Binding Buffer稀释(按体积稀释，比例 5X Binding Buffer/样本=1/4),上柱,使用颠倒混勻的摇床孵育10分钟，再以Binding Buffer清洗柱床4次，使用Elution Buffer孵育5分钟，离心洗脱目的糖肽，重复使用 Elution Buffer孵育、洗脱一次。合并洗脱液后上C18小柱(Waters公司)，以除去洗脱液中的杂质和糖分，冻干样本。上述的固定ConA的树脂、Binding Buffer以及Elution Buffer均来自 Glycoprotein 工 solation Kit, Pierce 公司生产。第四步、同位素标记将第三步所得的冻干样本加入20% (slurry v/w,胶体态的固化胰酶的体积和蛋白冻干样本的质量之比)的固化胰酶(Immobilized Trypsin, ABI公司)，轻摇20分钟然后冻干，以100 ii L含20% (体积浓度)乙腈的50mM NH4HCO3 (pH6. 8)溶液重溶样本，两组样本的NH4HCO3溶液分别以H218O (Cambridge Isotope公司)和H216O制备，于37°C下酶催化进行C端标记24小时。以MicroSpin column (Pierce公司)除去固化胰酶。加入5iiL 甲酸，以萃灭可能残留的胰酶活性，冻干，以H218O和H216O分别配置的IOOmM NH4HCO3溶液重溶(H218O和H216O与固化胰酶标记时对应)，以I U L/mg(以初始蛋白量为基准)的量加入 PNGase-F (New England Biolabs公司)，37°C孵育过夜。样本冻干后，将18O标记的样本组的样本与16O标记的样本组的样本分别按照I : 1，1 : 2，2 : 1，1 : 5，5 : 1，1 : 10，10 : I 的体积比例进行混合上样进行液相色谱-质谱检测。第五步、质谱数据处理和分析质谱所得数据由手动计算,并于Mascot Distiller软件搜库并应用如表I所示的自定义定量算法得到定量结果。其中定量协议为前导扫描(precursor)，为了防止C端不完全标记和回标现象对定量结果的干扰，本发明在自定义定量算法中定义了三个独有修饰组(exclusive modification groups)来进行计算，A 组(Group A)定义为 2 个 18O 标记在 C端及I个18O标记在N糖基化位点，B组(Group B)定义为I个18O标记在C端及I个18O 标记在N糖基化位点，C组(Group C)定义为16O标记在上述位点。因为在本发明的实验中，各组样本是独立处理的，所以在一组样本中只会出现给定的一组修饰，不可能出现各组修饰混合出现的情况，所以本发明应用了独有修饰组(exclusive modification groups) 的定义方式以避免可变修饰(variable modifications)所造成的过于复杂的计算。自定义算法中按照本发明应用的H218O的纯度定义了 18O同位素的纯度为97%，以进一步减小误差。相对的丰度比值由以下公式计算得到ratio (180/160) = (Group A+Group B) /Group C ；式中，其中，ratio (180/160)代表18O标记的糖肽与16O标记糖肽的丰度比值， GroupA、Group B和Group C分别代表A组、B组和C组的丰度。表I、自定义算法具体设定
权利要求
1.一种糖蛋白组定量方法，其特征在于，具体步骤为第一步将来自不同疾病或者相同疾病不同阶段患者的血清样本分为两组，除去高丰度蛋白，测定蛋白浓度，取等蛋白量样本进行除盐和酶解；第二步将第一步所得的酶解产物进行凝集素亲和层析以得到相应的亚糖蛋白组，冻干;第三步分别以H218O和H216O制备的溶液重溶两组样本，联合固化胰酶进行C端标记， 冻干后，再分别以H218O和H216O制备的溶液重溶两组样本，联合N-糖酰胺酶进行N糖基化位点标记，冻干；第四步将两组样本混合上样进行液相色谱-质谱检测，建立基于Mascot Distiller 的自定义算法进行定量数据处理。
2.如权利要求I所述的糖蛋白组定量方法，其特征在于，所述的自定义定量算法采用的定量协议为前导扫描，所述的自定义定量算法中定义了三个独有修饰组来进行计算，A组定义为2个18O标记在C端及I个18O标记在N糖基化位点，B组定义为I个18O标记在C端及I个18O标记在N糖基化位点，C组定义为16O标记在上述位点，相对的丰度比值由以下公式计算得到ratio (180/160) = (Group A+Group B) /Group C ；其中，ratio (180/160)代表18O标记的糖肽与16O标记糖肽的丰度比值,GroupA、Group B 和Group C分别代表A组、B组和C组的丰度。
全文摘要
本发明提供了一种糖蛋白组定量方法，具体步骤为将来自不同疾病或者相同疾病不同阶段患者的血清样本分为两组，除去高丰度蛋白，测定蛋白浓度，取等蛋白量样本进行除盐和酶解；将所得的酶解产物进行凝集素亲和层析以得到相应的亚糖蛋白组，冻干；分别以H218O和H216O制备的溶液重溶两组样本，联合固化胰酶进行C端标记，冻干后，再以H218O和H216O制备的溶液重溶两组样本，联合N-糖酰胺酶进行N糖基化位点标记，冻干；将两组样本混合上样进行液相色谱-质谱检测，建立基于Mascot Distiller的自定义算法进行定量数据处理。本发明拥有足够的精确性和可重复性，在1∶10～10∶1的范围之内能够保持线性，可精确的反应样本中不同N-糖链结构糖型的糖蛋白变化。
文档编号G01N30/08GK102590376SQ201210022570
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月1日 优先权日2012年2月1日
发明者周海军, 周闯, 王骥, 董琼珠, 钦伦秀 申请人:复旦大学附属中山医院