专利名称：具有抗糖尿病作用的物质的探索方法
技术领域：
本发明涉及糖尿病治疗剂和胰岛素促泌剂的治疗方法。
背景技术：
糖尿病为由于胰岛素分泌不足或其靶细胞侧的感受能力低下等导致的以糖代谢为中心的代谢异常，它的最大特征是引起高血糖。高血糖如果长期持续，就会产生以血管障碍为主要原因的，视网膜症、肾病、神经障碍等各种脏器或神经的严重的并发症。因此，糖尿病的治疗中控制血糖值使其维持在正常值极为重要，长期以来就致力于研究其实现方法。
糖尿病中，发病迟缓，并不一定必须采用胰岛素治疗来维持生命的类型(II型糖尿病)，可以通过运动疗法或食物疗法和药物组合来控制血糖值进行治疗。作为药物，作为口服降糖剂之一的磺酰脲类胰岛素促泌剂在临床上得到广泛应用。此外，那格列奈或瑞格列奈之类的所谓非磺酰脲K+ATP通道阻滞剂类的胰岛素促泌剂也在市售。
磺酰脲类药物是通过促进胰脏β细胞的胰岛素分泌来降低血糖值的II型糖尿病的治疗药，降糖作用的强弱和作用持续时间等各异的多种磺酰脲类药物已广为人知[Joslin’s Diabetes Mellitus 13thEdition，29，505-525(1994)]。
但磺酰脲类药物共有的副作用或并发症，或对磺酰脲类药物的无效症也被发现[Joslin’s Diabetes Mellitus 13thEdition，29，505-525(1994)]。
使用磺酰脲类药物时主要的并发症可列举出如低血糖症[Bio.Med.J.，296，949-950(1988)、Joslin’s Diabetes Mellitus13thEdition，29，505-525(1994)]。
现有可利用的磺酰脲类药物或那格列奈和瑞格列奈的所谓非磺酰脲K+ATP通道阻滞剂均为非血糖值依赖性促胰岛素分泌，如果用量错误则会导致严重的低血糖，或出现不能充分控制血糖值等问题，因而不一定能满足要求。有报道说，在以往的6个月内，接受过磺酰脲类药物的患者的20.2％出现低血糖症状[Acta.Med.Scand.Supp1.605，7-48(1977)、Joslin’s Diabetes Mellitus 13thEdition，29，505-525(1994)]。另外，上述患者中有6％每月都会经历低血糖。
由上述理由来看，期待能开发出与磺酰脲类药物或那格列奈和瑞格列奈的所谓非磺酰脲K+ATP通道阻滞剂不同的，不会引起低血糖等并发症的糖尿病治疗剂。
有报道，具有与上述非磺酰脲K+ATP通道阻滞剂不同结构的稠合嘌呤衍生物、稠环吡嗪衍生物等能够成为可以相应于血糖值促进胰岛素分泌的降糖剂[WO00/01388、WO01/47931、特开2000-154139]。但是相应于血糖值促进胰岛素分泌的降糖剂效率高的发现方法还未可知。
稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的特异结合，及该结合活性与稠合嘌呤衍生物的血糖低下作用之间的关系也未可知。
具有用序列号1～3表示的氨基酸序列的蛋白质(以下也称p31)均以具有NADPH依赖性的视黄醇和短链醇的氧化还原酶活性的酶而众所周知[Biochimica et Biophysica Acta，1338，47(1997)]，但该酶与糖尿病的相关性尚无报道。
三嗪衍生物具有激酶抑制作用，可以用于糖尿病的治疗是已知的(WO01/47921)，但未表现出有具体的糖尿病治疗作用。并且三嗪衍生物具有促胰岛素分泌作用也属未知。
发明内容
本发明的目的是提供一种不引起低血糖等并发症的糖尿病治疗药及胰岛素促泌剂的探索方法。
本发明等人深入研究的结果发现，稠合嘌呤衍生物的胰岛素促泌活性与稠合嘌呤衍生物和与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质的结合活性相关，从而实现了本发明。
即，本发明涉及以下的(1)～(24)项。
(1)具有抗糖尿病作用物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质存在下，选自下述通式(I)或通式(II)表示的化合物中的化合物(以下简称稠合嘌呤衍生物)和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量的步骤；[2]测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而阻碍稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物结合的物质的步骤。
(式(I)中，R1A表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族杂环基，R2A表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族杂环基，R3A表示氢原子、低级烷基或取代或非取代芳烷基，X1和X2分别独立地表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基，n表示0～3的整数) {式(II)中，X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳香族杂环基)或N＝C-W[式中，W表示卤原子、取代或非取代芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基、-NR4R5(式中，R4和R5相同或不同，表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳烷基，或者R4和R5与相邻的氮原子一起形成杂环基)、-OR6(式中，R6表示取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳烷基)、-SR6a(式中R6a与上述R6同义)、取代或非取代低级烷基或氰基]，R2表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代的芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基、卤原子、低级烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分别与上述R4和R5同义)、-CO2H、低级烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示卤原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分别与上述R4和R5同义)、或-CHO，R3表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、或低级烷氧基烷基，n表示0～3的整数，V1表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代芳香族杂环基，V2表示取代低级烷基、或取代或非取代芳香族杂环基；V1表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基、且(a)X...Y...Z表示R1aN-C＝O(式中，R1a表示在上述R1的定义中除取代低级烷基以外的基团)，R2表示取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代脂环式杂环基、卤原子、低级烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分别与上述同义)、-CO2H、低级烷氧羰基、-COHal(式中，Hal与上述同义)、-CONR9R10(式中，R9和R10分别与上述R4和R5同义)、或-CHO，或者(b)X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1与上述同义)，R3表示低级烷氧基烷基，或者(c)X...Y...Z表示R1bN-C＝O(式中，R1b表示取代低级烷基)，或者(d)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W与上述同义)，R2表示取代或非取代低级烷基，取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基、卤原子、低级烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分别与上述同义)、或-CO2H、低级烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示卤原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分别与上述同义)、或-CHO，或者(e)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W与上述同义)，R3表示低级烷基，取代或非取代芳烷基、低级烷氧基烷基时，V2也可以表示低级烷基，取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基}(2)具有抗糖尿病作用物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质存在下，上述(1)的稠合嘌呤衍生物和与该稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质接触时，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合量的步骤；[2]测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质接触时，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而阻碍该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质结合的物质的步骤。
(3)与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相结合的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质存在下，上述(1)的稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，该稠合嘌呤衍生物与胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量的步骤；[2]测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而阻碍稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物结合的物质的步骤；[5]利用[4]得到的物质，选择与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相结合的物质的步骤。
(4)与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相结合的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质存在下，上述(1)的稠合嘌呤衍生物和该稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质接触时，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合量的步骤；[2]测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质接触时，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而阻碍稠合嘌呤衍生物和该蛋白质结合的物质的步骤。
(5)使与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质活性变化的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质与上述(1)的稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相接触时，该蛋白质的活性的步骤；[2]测定与被检物质不接触时该蛋白质的活性的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而使该蛋白质活性变化的物质的步骤。
(6)抑制与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质活性的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质与上述(1)的稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相接触时，该蛋白质的活性的步骤；[2]测定与被检物质不接触时该蛋白质的活性的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而抑制该蛋白质活性的物质的步骤。
(7)使与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质功能变化的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质和表达与上述(1)的稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的转化体相接触时，该转化体的细胞应答的步骤；[2]测定被检物质不存在下的该转化体的细胞应答的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而使该转化株的细胞应答发生变化的物质的步骤。
(8)使编码与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质的基因的表达量变化的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质和表达与上述(1)的稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的转化体相接触时，编码该转化体的该蛋白质的基因的表达量的步骤；[2]测定被检物质不存在下编码该转化体的该蛋白质的基因的表达量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而使编码该蛋白质的基因的表达量发生变化的物质的步骤。
(9)使与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质的表达量变化的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质和表达与上述(1)的稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质的转化体相接触时，该转化体的该蛋白质的表达量的步骤；[2]测定被检物质不存在下该转化体的该蛋白质的表达量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而使该蛋白质的表达量发生变化的物质的步骤。
(10)上述(1)～(9)的任意一项的探索方法，稠合嘌呤衍生物为下述式(III)表示的化合物。
(11)上述(2)和(4)～(9)的任意一项探索方法，其特征在于，使用固定了上述(1)的稠合嘌呤衍生物的载体。
(12)上述(11)的探索方法，载体为琼脂糖凝胶颗粒。
(13)上述(11)或(12)的探索方法，稠合嘌呤衍生物为下述式(IV)表示的化合物。
(14)固定了上述(1)的稠合嘌呤衍生物的载体。
(15)上述(14)的载体，稠合嘌呤衍生物为上述(13)的式(IV)表示的稠合嘌呤衍生物。
(16)上述(14)或(15)的载体，载体为琼脂糖凝胶颗粒。
(17)上述(2)及(4)～(13)的任意一项所述的探索方法，与上述(1)的稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质为选自下述[i]～[iii]中的任意一种蛋白质。
具有用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列的蛋白质。
在用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列中，由1个以上的氨基酸被缺失、置换、插入或添加而成的氨基酸序列组成，且与上述(1)的稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质。
由具有与用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列60％以上相同性的氨基酸序列组成，且与上述(1)的稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质。
(18)由上述(1)～(13)和(17)的任意一项探索方法得到的物质或该物质的可药用盐。
(19)含有以上述(18)的物质或该物质的可药用盐为有效成分的药物。
(20)含有以上述(18)的物质或该物质的可药用盐为有效成分的糖尿病治疗药。
(21)含有以上述(18)的物质或该物质的可药用盐为有效成分的胰岛素促泌剂。
(22)含有用下述通式(V)表示的化合物或其可药用盐为有效成分的胰岛素促泌剂。
[式中，R1B、R2B、R3B相同或不同，表示氨基、单或二取代氨基、或含有N的取代或非取代杂环基(该杂环基通过N原子与三嗪环结合)](23)促进胰岛素分泌的方法，包括以上述(22)的通式(V)表示的化合物或其可药用盐的有效量给药的步骤。
(24)在制造胰岛素促泌剂中应用的上述(22)的通式(V)表示的化合物或其可药用盐的使用。
以下详细说明本发明。
1.用于本发明探索方法的稠合嘌呤衍生物用于本发明探索方法的稠合嘌呤衍生物是指下述通式(I)或通式(II)表示的化合物。
(式(I)中，R1A表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族杂环基，R2A表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族杂环基，R3A表示氢原子、低级烷基或取代或非取代芳烷基，X1和X2分别独立的表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基，n表示0～3的整数) {式(II)中，X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳香族杂环基)或N＝C-W[式中，W表示卤原子、取代或非取代芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基、-NR4R5(式中，R4和R5相同或不同，表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳烷基，或者R4和R5与相邻的氮原子一起形成杂环基)、-OR6(式中，R6表示取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳烷基)、-SR6a(式中R6a与上述R6同义)、取代或非取代低级烷基或氰基]，R2表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代的芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基、卤原子、低级烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分别与上述R4和R5同义)、-CO2H、低级烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示卤原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分别与上述R4和R5同义)、或-CHO，R3表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、或低级烷氧基烷基，n表示0～3的整数，V1表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代芳香族杂环基，V2表示取代低级烷基、或取代或非取代芳香族杂环基；当V1表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基、且(a)X...Y...Z表示R1aN-C＝O(式中，R1a表示在上述R1的定义中除取代低级烷基以外的基团)，R2表示取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代脂环式杂环基、卤原子、低级烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分别与上述同义)、-CO2H、低级烷氧羰基、-COHal(式中，Hal与上述同义)、-CONR9R10(式中，R9和R10分别与上述R4和R5同义)、或-CHO，或者(b)X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1与上述同义)，R3表示低级烷氧基烷基，或者(c)X...Y...Z表示R1bN-C＝O(式中，R1b表示取代低级烷基)，或者(d)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W与上述同义)，R2表示取代或非取代低级烷基，取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基、卤原子、低级烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分别与上述同义)、或-CO2H、低级烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示卤原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分别与上述同义)、或-CHO，或者(e)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W与上述同义)，R3表示低级烷基，取代或非取代芳烷基、低级烷氧基烷基时，V2也可以表示低级烷基，取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基}。
式(I)的各基团定义中，作为低级烷基或包括低级烷基部分的取代基(例如芳烷基)的低级烷基部分，可使用碳原子数1～9个左右的烷基，烷基这一用语中包括由直链状、支链状、环状及由它们的组合构成的烷基。
环状烷基或烷基中的环状烷基部分可具有1或2个以上的环，作为R1A表示的低级烷基，优选为直链或支链状的低级烷基、1～3个环形的环状低级烷基(例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、3-去甲金刚烷等)，作为R2A表示的低级烷基，优选为直链或支链状的低级烷基、或单环性的环状低级烷基。
作为直链或支链状的低级烷基，可列举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基，或正壬基等。作为环状的低级烷基，可列举出例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、去甲金刚烷基、金刚烷基等。其中优选叔丁基或环戊基。
作为芳基或包括芳基部分的取代基(芳烷基等)中的芳基部分，可使用由单环性或2个以上的稠合环组成的芳香基。更具体来说优选为构成环的碳原子数6～14个左右的芳基，例如适宜使用苯基、萘基、茚基或蒽基等。作为芳烷基可使用例如碳原子数7～15个的芳烷基，更具体来说优选为苄基、苯乙基、二苯甲基、萘甲基等。
作为芳香族杂环基，可使用由单环性或由2个以上的稠合环组成的芳香族杂环基。对含于芳香族杂环的杂原子的种类和个数没有特殊限定，例如可含有1个或2个以上选自氮原子、硫原子及氧原子中的杂原子。更具体来说优选为成环原子数6～14个左右的芳香族杂环基，例如适宜选用呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、噻唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基，或嘌呤基等。
芳环或芳香族杂环上存在取代基时，其取代基的种类和个数没有特殊限定，当存在2个以上的取代基时，它们可以相同或不同。例如环上可有1～3个左右的取代基。作为芳环或芳香族杂环上的取代基，可列举出例如取代或非取代低级烷基、取代或非取代低级链烯基、取代或非取代低级炔基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、羟基、取代或非取代低级烷氧基、取代或非取代芳烷氧基、取代或非取代芳氧基、取代或非取代芳酰基、低级烷氧羰基、取代或非取代低级烷硫基、取代或非取代低级烷基磺酰基、羧基、取代或非取代氨基甲酰基、取代或非取代低级烷酰基、卤素(本说明书中所说的卤素可以指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任意一种)、硝基、氨基、单或二低级烷基取代氨基、氰基等。
上述官能基中，作为低级烷基或包括低级烷基部分的官能基(例如芳烷基、低级烷氧基、芳烷氧基、低级烷氧羰基、低级烷硫基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、单或二低级烷基取代氨基等)的低级烷基，可使用上述说明的基团。低级烷基或低级烷基部分有取代基时，其取代基的个数和种类没有特殊限定，当存在2个以上的取代基时，它们可以相同或不同。例如可有1～3个左右的取代基。这样的取代基可列举出例如羟基、卤原子、羧基、磺基、磷酰基、及由这些酸性基衍生而来的酯(低级烷酯、芳烷基酯、芳基酯等)等。作为有取代基的烷基的例子，更具体来说有羟乙基、三氟甲基等。而低级烷基取代氨基中的2个烷基可以相同或不同。
此外，上述官能基中，芳烷基或芳烷氧基的芳烷基部分与上述芳烷基同义，芳基、芳氧基、芳酰基的芳基部分与上述芳基同义。作为低级链烯基，可使用直链或支链状的碳原子数2～6的链烯基。可使用例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、甲基丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、戊烯基、己烯基等。作为低级炔基，可使用直链或支链状的碳原子数2～6的炔基。可使用例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。低级链烯基或炔基中的不饱和键的个数没有特殊限定，但优选为1个。
上述低级链烯基、低级炔基、芳烷基、芳基、芳烷氧基、芳氧基、芳酰基具有取代基时，取代基的个数、种类或取代位置没有特殊限定，当含有2个以上的取代基时，它们可以相同或不同。例如可有1～3个左右的取代基，作为取代基，作为关于低级烷基的取代基可采用举例说明的基团。
此外，在上述的通式(I)中，X1和X2的取代位置没有特殊限定，分别可以取代环上的任意位置。并且，当X1和X2为除氢原子以外的取代基时，它们结合的碳原子的立体构型为S型或R型均可。n优选为0。
式(II)的各基团定义中，作为低级烷基、低级烷硫基、低级烷氧羰基和低级烷氧基烷基的低级烷基部分，包括碳原子数1～10个左右的直链状、支链状、环状和由它们的组合构成的烷基。环状的低级烷基可具有1个或2个以上的环。作为直链或支链状的低级烷基，可列举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。作为环状的低级烷基，可列举出例如环丙基、环丙甲基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、1-甲基环己基、4-甲基环己基、去甲金刚烷基、金刚烷基、二环[2.2.1]庚基、二环[2.2.2]辛基、二环[3.3.0]辛基、二环[3.3.1]壬基等。
低级烷氧基烷基和芳烷基的亚烷基部分，与上述直链状或支链状的低级烷基中去掉一个氢原子者同义。
芳基和芳烷基的芳基部分由单环性或2个以上的稠合环构成，可列举出构成环的碳原子数6～14个左右的例如苯基、萘基、茚基或蒽基等。
作为芳香族杂环基，可列举出例如含有至少1个选自氮原子、氧原子及硫原子中的原子的5元环或6元环的单环性芳香族杂环基、3～8元的环稠合而成的二环或三环性环中含有至少1个选自氮原子、氧原子及硫原子中的原子的稠环性芳香族杂环基等。更具体来说可列举出构成环的碳原子数为5～14个左右的，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、噻唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基，或嘌呤基等。
作为脂环式杂环基，可列举出例如含有至少1个选自氮原子、氧原子及硫原子中的原子的5元环或6元环的单环性脂环式杂环基、3～8元的环稠合而成的二环或三环性环中含有至少1个选自氮原子、氧原子及硫原子中的原子的稠环性脂环式杂环基等。更具体来说可列举出吡咯烷基、2，5-二氧吡咯烷基、噻唑烷基、噁唑烷基、2-氧基噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、吗啉基、硫代码啉基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢呋喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、四氢喹喔啉基、八氢喹啉基、二氢吲哚基、1，3-二氧异吲哚基、1，3-二氧杂戊环、1，3-二氧杂戊环基-2-螺环戊基等。
作为与相邻的氮原子一起形成的杂环基，可列举出例如含有至少1个氮原子的5元或6元的单环性杂环基(该单环杂环基也可含有其它的氮原子、氧原子或硫原子)、3～8元的环稠合而成的二环或三环性环中含有至少1个选自氮原子、氧原子及硫原子中的原子的稠环性脂环式杂环基(该单环杂环基也可含有其它的氮原子、氧原子或硫原子)等。更具体来说可列举出吡咯烷基、噻唑烷基、噁唑烷基、哌啶基、高哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、吗啉基、硫代码啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、八氢喹啉基、苯并咪唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基、嘌呤基、二氢吲哚基、吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、咪唑基等。
作为卤素，可列举出氟、氯、溴、碘的各原子。
作为取代芳基、取代芳烷基、取代芳香族杂环基和取代脂环式杂环基的取代基，可相同或不同，可列举出取代数1～3的取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳氧基、取代或非取代芳酰基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳烷氧基、取代或非取代低级链烯基、取代或非取代低级炔基、取代或非取代低级烷氧基、取代或非取代低级烷氧羰基、取代或非取代低级烷硫基、取代或非取代低级烷基磺酰基、取代或非取代低级烷酰基、单或二低级烷基取代氨基甲酰基、单或二低级烷基取代氨基、卤原子、羧基、羟基、硝基、氨基、氰基等。此处，作为低级链烯基，可列举出直链状或支链状的碳原子数2～6的，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、甲基丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、戊烯基、己烯基等。作为低级炔基，可列举出直链或支链状的碳原子数2～6的，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。低级链烯基和低级炔基中的不饱和键的个数没有特殊限定，但优选为1个。低级烷基、低级烷氧基、低级烷氧羰基、低级烷硫基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、单或二低级烷基取代氨基甲酰基及单或二低级烷基取代氨基的低级烷基部分与上述低级烷同义。芳烷基和芳烷氧基的亚烷基部分与上述亚烷基部分同义。芳基、芳氧基和芳酰基的芳基部分与上述芳基同义。卤素与上述卤素同义。作为取代低级烷基、取代芳基、取代芳氧基、取代芳酰基、取代芳烷基、取代芳烷氧基、取代低级链烯基、取代低级炔基、取代低级烷氧基、取代低级烷氧羰基、取代低级烷硫基、取代低级烷基磺酰基和取代低级烷酰基中的取代基，可列举出相同或不同的取代数1～3的羟基、与上述同义的卤素、羧基、磺基、磷酰基、及由这些酸性基衍生而来的酯(低级烷酯、芳烷基酯、芳基酯等；这些酯的低级烷基部分、芳烷基部分和芳基部分分别与上述同义)、二低级烷基取代氨基甲酰和二低级烷基取代氨基中，分别与氨基甲�：桶被岷系�2个低级烷基可以相同也可以不同。
作为取代低级烷基的取代基，可列举出相同或不同的取代数1～3的低级烷氧基、羟基、氰基、迭氮基、羧基、磷酰基或由这些酸性基衍生而来的酯(低级烷酯、芳烷基酯、芳基酯等；这些酯的低级烷基部分、芳烷基部分和芳基部分分别与上述同义)、低级烷硫基、低级烷氨基羰基、低级烷氧羰基、取代或非取代芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基、-NR11R12(式中，R11和R12相同或不同，表示氢原子、低级烷基、低级烷酰基、芳基、芳烷基或芳烷氧基，或者R11和R12与相邻的氮原子一起形成杂环基)、卤素、可被低级烷基取代的芳基磺酰氧基、低级烷基磺酰基、低级烷基磺酰氧基、三氟甲基磺酰氧基等。
这里，低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、低级烷氨基羰基、低级烷氧羰基、低级烷酰基、可被低级烷基取代的芳基磺酰氧基、低级烷基磺酰基和低级烷基磺酰氧基的低级烷基部分与上述低级烷基同义。芳基、芳烷基、芳烷氧基和芳基磺酰氧基的芳基部分与上述芳同义。芳烷基的亚烷基部分与上述亚烷基部分同义。卤素、芳香族杂环基、脂环式杂环基和与相邻的氮原子一起形成的杂环基与上述同义。取代芳香族杂环基和取代脂环式杂环基的取代基与上述同义。
此外，式(II)中，V1或V2的取代位置没有特殊限定，分别可以在环上的任意位置取代。并且，当V1或V2为除氢原子以外的取代基时，它们结合的碳原子的立体构型为S型或R型均可。n优选为0。
作为可用于本发明的化合物，可列举出优选为，式(I)中，R1为氢原子、低级烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族杂环基，R2为低级烷基，或取代或非取代芳基，R3为氢原子，或取代或非取代芳烷基，X1为氢原子、低级烷基、或取代或非取代芳烷基，和X2为氢原子，n为0的化合物，或者式(II)中，X...Y...Z为R1N-C＝O(式中，R1表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳香族杂环基)，R2为氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代的芳香族杂环基，R3为氢原子或低级烷基，V1为氢原子，V2为取代低级烷基，n为0的化合物；更优选为，式(I)中，R1为氢原子、正丙基、环戊基或叔丁基，R2为正丙基、乙基或苄基，R3为氢原子、甲基或苄基，X1为氢原子、低级烷基，或取代或非取代芳烷基，X2为氢原子，n为0的化合物，或者式(II)中，X...Y...Z为R1N-C＝O(式中，R1表示乙基、正丙基、环丙基甲基或苄基)，R2为正丙基、环丁基或环戊基，R3为氢原子，V1为氢原子，V2为吡啶甲基，n为0的化合物。
作为用于本发明的更优选的稠合嘌呤衍生物，具体来说，可列举如下述表1中的化合物。
表1-1 化合物号R1R2R3X11 (CH2)2CH3H 2 (CH2)2CH3H 3 (CH2)2CH3H 4 (CH2)2CH3H 5 (CH2)2CH3HH6 (CH2)2CH3H 7 (CH2)2CH3H 8 (CH2)2CH3H 9 (CH2)2CH3H 10(CH2)2CH3H 11(CH2)2CH3H 12(CH2)2CH3H 13(CH2)2CH3H 14(CH2)2CH3H
表1-2 化合物号 R1R2R3X115 (CH2)2CH3H 16 (CH2)2CH3H 17 (CH2)2CH3H 18 (CH2)2CH3H 19 (CH2)2CH3H 20 (CH2)2CH3H 26 (CH2)2CH3H
表1-3 化合物号 R1R2R3X127 (CH2)2CH3H 28 (CH2)2CH3H 29 (CH2)2CH3CH3 30 (CH2)2CH3H 31 (CH2)2CH3H 32
表1-4 化合物号 R1R2R3X133 H (CH2)2CH3H 34 H (CH2)2CH3 35(CH2)2CH3H 36 (CH2)2CH3H 37(CH2)2CH3H 38 (CH2)2CH3H 39 (CH2)2CH3H 40(CH2)2CH3H 41 (CH2)2CH3H 42 (CH2)2CH3H 43(CH2)2CH3H 44 (CH2)2CH3H 45 (CH2)2CH3H
表1-5 化合物号R1R2R3X146 (CH2)2CH3H 47(CH2)2CH3H 48 (CH2)2CH3H 49 (CH2)2CH3H 50(CH2)2CH3H 51 (CH2)2CH3H 52 (CH2)2CH3H 53 (CH2)2CH3H 54 (CH2)2CH3H 55 (CH2)2CH3H 56 (CH2)2CH3H 57 (CH2)2CH3H
表1-6 化合物号R1R2R3X158 (CH2)2CH3H 59(CH2)2CH3H 60 (CH2)2CH3H 61(CH2)2CH3H 62(CH2)2CH3H 63(CH2)2CH3H 64(CH2)2CH3H 65(CH2)2CH3H
表1-7 化合物号R1R2R3X166 (CH2)2CH3H 67(CH2)2CH3H 68(CH2)2CH3H 69(CH2)2CH3H 70(CH2)2CH3H 71 (CH2CH3H 72 H73 (CH2)2CH3H 74 (CH2)2CH3H
表1-8 化合物号 R1R2R3X175 (CH2)2CH3H 76 (CH2)2CH3H 77 (CH2)2CH3H 78 (CH2)2CH3H 79 (CH2)2CH3H 80 (CH2)2CH3H 81 (CH2)2CH3H 82 (CH2)2CH3H 83 (CH2)2CH3H 84 CH3H 85 C6H5H
表1-9 化合物号 R1R2R3X1X286(CH2)2CH3H H87(CH2)2CH3H H88(CH2)2CH3H H89(CH2)2CH3H H90(CH2)2CH3H H91(CH2)2CH3HH92(CH2)2CH3H H93(CH2)2CH3H H
表1-10 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物号R1R2R3Va94 CH3(CH2)2 H 95 CH3(CH2)2 H 96 CH3(CH2)2 H 97 CH3(CH2)2 H 98 CH3(CH2)2 H 99 CH3(CH2)2 H 100 CH3(CH2)2 H 101 CH3(CH2)2CH3(CH2)2H 102 CH3(CH2)2H 103 CH3(CH2)2 H 104 CH3(CH2)2(CH3)3CH 105 CH3(CH2)2 H 106 CH3(CH2)2H H
表1-11 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物号 R1R2R3Va107 H108 (CH3)3C H109 CH2CH3 H110 (CH2)2CH3111 (CH2)2CH3 112 (CH2)2CH3 113 (CH2)2CH3 H114 (CH2)2CH3 H115 (CH2)2CH3 H116 (CH2)2CH3 H117 (CH2)2CH3 H118 (CH2)2CH3 H
表1-12 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物号R1R2R3Va119(CH2)2CH3 H 120(CH2)2CH3 H 121(CH2)2CH3 H 122(CH2)2CH3 H 123(CH2)2CH3 H 124(CH2)2CH3 H 125(CH2)2CH3 H 126(CH2)2CH3 H 127(CH2)2CH3 H 128 CH3(CH2)2Br 129 CH3(CH2)2SCH3 130 CH3(CH2)2
表1-13 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物号R1R2R3Va131(CH2)2CH3 H 132(CH2)2CH3H 133(CH2)2CH3 H 134(CH2)2CH3CHO135(CH2)2CH3ClCH2 136(CH2)2CH3(CH3)2NHCH2H 137(CH2)2CH3 H 138(CH2)2CH3CH3CH2OCH2H 139(CH2)2CH3 H 140(CH2)2CH3CO2CH3 141(CH2)2CH3142(CH2)2CH3 H 143(CH2)2CH3H
表1-14 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物号R1R2R3Va144 CH3(CH2)2 H 145 CH3(CH2)2 H 146 CH3(CH2)2H 147 CH3(CH2)2 H 148 CH3(CH2)2 H 149 CH3(CH2)2 H 150 CH3(CH2)2 H 151 CH3(CH2)2H 152 CH3(CH2)2 H
表1-15 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物号R1R2R3Va153 CH3(CH2)2 H 154 CH3(CH2)2 H 155 CH3(CH2)2H 156 CH3(CH2)2 H 157 CH3(CH2)2CH3CH2SCH2H 158 CH3(CH2)2H
表1-16 (X--Y--Z＝N＝C-W)化合物号 WR2R3Va159 Cl 160 H 161 H 162H163 (CH3)3C H 164 H 165 H 166 SCH3(CH3)3C H 167 CH2CH3 H 168 C≡N H 169 H
表1-17 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物号R1R2R3Va170 H 171 H 172 H 173 H 174 H 175H 176 (CH3)3C H 177 H 178H 179 (CH3)3C H
表1-18 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物号R1R2R3V1V2180 CH3(CH2)2CH3CH2OCH2H H181 CH3(CH2)2CH3CH2OCH2H H182 CH3(CH2)2 H H
表1-19 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物号R1R2R3Va183CH3(CH2)2CH3H 184CH3(CH2)2CH3(CH2)3H 185CH3(CH2)2CH3(CH2)2H 186CH3(CH2)2 H 187CH3(CH2)2 H 188CH3(CH2)2 H 189 H 190 H 191 H 192CH3(CH2)2 H
作为更优选的化合物，可列举用下述通式(III)表示的上述表1中的化合物编号16表示的化合物(以下有时称化合物16)。
用于本发明探索方法的稠合嘌呤衍生物的制备方法上述式(I)所表示的化合物的代表化合物的制备方法，具体的记载于WO98/15555中，并且在特开平3-204880、WO00/01388、J.Med.Chem.，35，3578(1992)、J.Med.Chem.，36，2508(1993)、J.Heteocyclic Chem.，30，241(1993)等中也有说明。
上述式(II)所表示的化合物的代表化合物的制备方法，具体的记载于WO01/47931等中。
此外，原料化合物和中间体化合物中的各官能基的转变和取代基所含的官能基的转变，可以根据上述文献记载的方法以外的公知的其它方法(例如，Comprehensive Organic Transformations，secondedition，R.C.Larock，John Wiley & Sons Inc.(1999)中记载的方法等)进行。
通过适当组合上述方法，且根据必要对这些方法加以修饰和改变，也可以制造出上述式(I)和式(II)所包含的任意的化合物。
在上述制备方法中得到的中间体化合物和目标化合物可以通过有机合成化学中常用的精制方法，例如中和、过滤、提取、清洗、干燥、浓缩、重结晶、各种色谱法等方法进行分离·精制。并且中间体化合物不需要特殊精制也可供用于后面的反应。
制造用式(I)和式(II)表示的化合物的盐时，将游离形态的化合物溶解或混悬于适当的溶剂后，加入适当的酸或碱形成盐，根据必要可进行分离·精制。将所得目标物质以盐的形式转换为游离形式后，可以转变为所希望的盐。
3.用稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的具有抗糖尿病作用的物质的探索方法通过①测定被检物质存在下，使上述1.所述的稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量；和②测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量；③比较被检物质存在下和不存在下的该测定值；④通过选择因被检物质而阻碍稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物结合的物质，能够选择具有抗糖尿病作用的物质。
标记化稠合嘌呤衍生物的制备方法上述探索方法也可以直接使用上述1的稠合嘌呤衍生物，优选使用被标记的该稠合嘌呤衍生物。
作为被标记的该化合物，可列举出例如用3H、125I、13C等放射标记、用FITC(异硫氰酸荧光素)等荧光标记、被生物素标记的该稠合嘌呤衍生物等，优选用3H放射标记的该稠合嘌呤衍生物。
上述1的稠合嘌呤衍生物可以参照公知的方法进行标记，例如放射标记时，合成上述2的本发明的探索方法所用的稠合嘌呤衍生物时，可列举出使用市售的被放射标记的原料的方法，例如通过使官能基中有卤基的稠合嘌呤衍生物和有放射性同位素的氢直接接触反应，将该放射性元素导入上述1的稠合嘌呤衍生物的方法。
具体来说，即在上述探索方法中使用化合物16的标记物时，通过将用表1中的化合物编号23表示的化合物的R体在钯存在下、3H气氛下催化氢化，能够得到化合物16的3H标记物。
胰脏β细胞或该细胞的处理物的调制方法用于本发明探索方法的胰脏β细胞或该细胞的处理物，可为任何来自动物的细胞或该细胞的处理物，可列举出优选的来自大鼠、小鼠、狗、人等的该细胞或该细胞的处理物。
此外，本发明的探索方法中，只要发现与稠合嘌呤衍生物的特异性结合，也可以使用含有胰脏β细胞的脏器或组织。
具体来说，本发明的探索方法可使用能从大鼠、小鼠、狗、人等的动物的胰脏、胰岛、胰脏中分离出来的胰脏β细胞本身、或培养该细胞所得的细胞培养物或它们的处理物。
作为胰脏β细胞，可以使用根据常规方法从胰脏中能够分离出的胰脏β细胞本身，优选使用不死化或细胞株化的细胞。
作为不死化或细胞株化的胰脏β细胞具体来说可列举出BRIN-BD11细胞〔Diabetes，45，1132-1140(1996)〕、INS-1细胞〔Endocrinology，130，167-178(1992)〕、βTC细胞〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，9037-9041(1988)〕、或、MIN6细胞〔Endocrinology，127，126-132(1990)〕、RINm5F〔Diabetes，31，521-531(1982)〕、HIT-T15细胞(ATCC CRL-1777)等，更优选为MIN6细胞。
作为胰脏β细胞的处理物可列举出，从胰脏β细胞或含有该细胞的组织的表面活性剂处理物、超声波处理物、机械磨碎处理物、溶剂处理物、酶处理物、胰脏β细胞或含有该细胞的组织的固定化物、胰脏β细胞或含有该细胞的组织中，根据常规方法能够调制的细胞膜级分、蛋白质级分物、酶标准品等。
上述表面活性剂处理物，可以使用例如Trition X-100、NP-40、毛地黄皂苷(洋地黄皂苷)、蔗糖单己酸酯(sucrose monocapronate)等的一般用于动物细胞膜的可溶化的表面活性剂来进行调制。
机械磨碎处理物可使用均化器、超声波、法式压力机等进行调制。
蛋白质级分物和酶标准品，可以从细胞或组织的机械磨碎处理物中，单独或组合使用溶剂提取法、采用硫铵等的盐析法、脱盐法、采用有机溶剂等的沉淀法，采用二乙基氨基乙基(DEAE)琼脂糖凝胶、DIAION HPA-75(三菱化学社制)等树脂的阴离子交换色谱法，采用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等树脂的阳离子交换树脂法，采用丁基纤维素、苯基纤维素等树脂的疏水性色谱法，使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、色素聚焦等，等电点电泳等的电泳法等方法，进行调制。
标记化稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或其处理物的结合物的检出方法标记化稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或其处理物的结合物，可以通过将与胰脏β细胞或其处理物结合的标记化稠合嘌呤衍生物和未结合的标记化稠合嘌呤衍生物分离后，检出标记化稠合嘌呤衍生物的方法来测定。
作为与胰脏β细胞或其处理物结合的标记化稠合嘌呤衍生物和未结合的标记化稠合嘌呤衍生物的分离方法，采用胰脏β细胞或非溶解性胰脏β细胞的处理物进行结合实验时，可列举出利用离心分离的分离方法。可列举出，当胰脏β细胞的处理物为蛋白质级分或酶标准品等可溶性物质时，通过凝胶过滤分离出含有蛋白质或酶标准品等级分的方法。
对于标记化稠合嘌呤衍生物，当该衍生物用放射性同位素标记时用液体闪烁计数器，当用荧光物质标记时用荧光检测器等，当用生物素标记时，使其与适当的酶结合的抗生物素蛋白反应后，可以通过测定该酶活性进行检出、测定。并可以由该测定值确定标记化稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或其处理物的结合物的量。
胰岛素促泌活性的测定方法可以确认通过上述方法，作为阻碍稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或其处理物的结合的物质而选择的物质为具有抗糖尿病作用的物质，例如可根据，使胰脏β细胞或含有该细胞的组织和上述选择出的物质在葡萄糖存在下接触时，通过与该物质的接触，胰脏β细胞的胰岛素分泌被促进而得以确认[Diabetorogia，36，1139(1993)]。
以稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合活性为指标，以选择阻碍其结合的物质为特征的具有抗糖尿病作用物质的探索方法的上述[1]～[3]的探索方法，与以胰脏β细胞的胰岛素促泌活性为指标，直接促进该活性的物质的探索方法相比较，是一种在操作性、迅速性等方面格外优良的方法。
4.使用与稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的具有抗糖尿病作用的物质的探索方法[1]与稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的选择方法作为用于本发明的与稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的选择方法，只要是与稠合嘌呤衍生物特异性结合的蛋白质的选择方法，可以采用任何公知的方法，可列举出例如，将稠合嘌呤衍生物固定化在称作载体的不溶性的高分子上，与用于结合活性评价的细胞提取液混合后，洗净、鉴定与稠合嘌呤衍生物相结合的分子的亲和层析法[CurrentProtocols in Protein Science(Chapter 9)，John Wiley & Sons(2001)]。
(1)载体的调制方法用于选择与本发明所用的稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的载体，只要是能够固定化稠合嘌呤衍生物的载体，可使用任意载体。期待优选在载体表面有能够通过与稠合嘌呤衍生物的化学反应而结合的官能基，且蛋白质的非特异性吸附�。刹僮餍杂乓斓脑靥�。
具体来说，作为载体材料可列举出例如琼脂糖、葡聚糖、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯等。作为载体的大�。闪芯俪鲋本段�10nm～1mm，优选50nm～100μm的颗粒。作为载体的形状，可列举出多孔质、贯通孔质、无孔质等。作为用于本发明更优选的载体，可列举出例如，NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences公司制)、Affi-Gel 10(Bio-Rad公司制)等。
本发明中能够固定化于载体的稠合嘌呤衍生物，只要是能够固定化于载体的稠合嘌呤衍生物，可使用任何稠合嘌呤衍生物。能够固定化于载体的稠合嘌呤衍生物的具体例子可列举出如下述式(IV)所表示的化合物(以下称为化合物155)。
使稠合嘌呤衍生物与载体结合的化学反应，只要在本发明的使用中没有阻碍，则可采用任何反应。
通过使载体上的官能基与稠合嘌呤衍生物反应，能够制作稠合嘌呤衍生物固定化载体。例如，可以使具有作为官能基的羧酸琥珀酰亚胺的载体与稠合嘌呤衍生物的溶液接触，使载体上的羧酸琥珀酰亚胺和稠合嘌呤衍生物发生反应。此时的溶剂和反应条件为上述的固定化反应进行的溶剂和反应条件的组合，含有羧酸琥珀酰亚胺的载体、稠合嘌呤衍生物在进行上述的固定化反应以外的分解反应或缩合反应时，只要是不引起阻碍本发明的目的的溶剂和反应条件的组合，任意的溶剂和反应条件的组合均可。具体来说，可以使含有羧酸琥珀酰亚胺的载体和含有1μmol/l～1mol/l稠合嘌呤衍生物的溶液相接触，静置，或一边用旋转机、搅拌器等平稳搅拌，一边在0℃～100℃下反应1秒～1000小时，调制成稠合嘌呤衍生物固定化载体。作为溶剂可列举出例如含有盐、表面活性剂、缓冲成分的水溶液、水、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、二氧六环、甲醇等。
反应结束后，为了除去未反应的稠合嘌呤衍生物，洗净稠合嘌呤衍生物被固定化的载体。洗涤方法只要是能够使固定化稠合嘌呤衍生物的载体被稳定有效的回收、且未反应的稠合嘌呤衍生物被有效除去的方法，就可以使用任何公知的方法。例如，如果载体为颗粒，可以在反应结束后，通过离心分离(15000rpm、5分钟、室温)，除去上清液后，在溶剂中混浊，重复同样的离心分离、除去上清液的操作，进行清洗。如果载体为板时，板可以用溶剂洗净。此外，根据必要，利用相同的方法，可以置换为适于保存或与细胞提取液相混合的溶剂。作为溶剂，可列举出例如含有盐、表面活性剂、缓冲成分的水溶液、水、DMF、DMSO、THF、二氧六环、甲醇等。
稠合嘌呤衍生物固定化载体上残留有未反应的官能基时，根据必要，可封闭未反应的官能基。封闭可通过使与官能基反应、且与被固定于载体的稠合嘌呤衍生物不反应的化合物和稠合嘌呤衍生物固定化载体发生反应而进行。封闭中，只要是与官能基反应、且与被固定于载体的稠合嘌呤衍生物不反应的化合物均可使用。例如，如果载体的官能基为羧酸琥珀酰亚胺，可以使用tris-乙醇胺封闭稠合嘌呤衍生物固定化载体上的未反应的羧酸琥珀酰亚胺基。
用于本发明的稠合嘌呤衍生物可通过间隔化合物在载体上固定化。间隔化合物只要在本发明的使用中没有障碍即可采用任何化合物，可列举出例如，Pierece公司、Molecular Probe公司和ShearWater公司等销售的间隔化合物。具体来说可列举出琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶二硫基)丙酰胺基]己酸酯(LC-SPDP)(Pierece公司制)、3-(2-吡啶二硫基)丙酸(S-1531)琥珀酰亚胺酯(Molecular Probe公司制)等间隔化合物。此外，也可使用6-氨基己酸、4-氨基正酪酸等间隔化合物。
通过间隔化合物中介的稠合嘌呤衍生物与载体的结合方法，只要在本发明的使用中没有障碍，采用任何方法均可。可列举出例如，向载体导入间隔化合物后，使稠合嘌呤衍生物与该间隔化合物结合的方法，或间隔化合物在稠合嘌呤衍生物上结合后，在载体上固定化该间隔化合物的方法。
此外，也可以化学保护这些间隔化合物的一个官能基，与载体或稠合嘌呤衍生物反应后，使产物脱保护，再与稠合嘌呤衍生物或载体反应，调制而成稠合嘌呤衍生物固定化载体。
在载体上导入间隔化合物后，与稠合嘌呤衍生物结合的方法，例如，通过含有作为官能基的羧酸琥珀酰亚胺基的载体和含有伯胺或仲胺的羧酸化合物的间隔化合物反应，能够在载体表面做成带有羧基的载体。作为具有伯胺或仲胺的羧酸化合物，可列举出例如6-氨基己酸、4-氨基正丁酸等。
此时的溶剂和反应条件为上述的固定化反应进行的溶剂和反应条件的组合，载体、间隔化合物在进行上述的固定化反应以外的分解反应或缩合反应时，只要是不引起阻碍该固定化反应的溶剂和反应条件的组合，任意的溶剂和反应条件的组合均可。具体来说，可以使载体与含有1μmol/l～50mol/l的具有伯胺或仲胺的化合物，例如6-氨基己酸、4-氨基正丁酸等的溶液相接触，静置，或一边用旋转机、搅拌器等平稳搅拌，一边在0℃～100℃下反应1秒～1000小时，调制成在表面带有羧基的载体。作为溶剂，可列举出例如水、DMF、DMSO、THF、二氧六环、甲醇等。
反应结束后，为了除去未反应的间隔化合物，洗净载体。洗净方法只要是能够使固定化间隔化合物的载体被稳定有效的回收、且未反应的间隔化合物被有效除去的方法，就可以使用任何公知的方法。例如，如果载体为颗粒，反应结束后，可以通过离心分离(15000rpm、5分钟、室温)，除去上清液后，在溶剂中混悬，重复同样的离心分离、除去上清液的操作，能够洗净。如果载体为板时，板可以用溶剂洗净。此外，根据必要，利用相同的方法，可以置换为适于以后反应的溶剂。
通过由此得到的载体上的羧基和稠合嘌呤衍生物反应，能够制造出稠合嘌呤衍生物固定化载体。具体来说，使固定化间隔化合物的载体和稠合嘌呤衍生物溶液相接触，能够使载体上的羧基与稠合嘌呤衍生物发生反应。
此时的溶剂和反应条件为上述的固定化反应进行的溶剂和反应条件的组合，固定化间隔化合物的载体、稠合嘌呤衍生物在进行上述的固定化反应以外的分解反应或缩合反应时，只要是不引起阻碍该固定化反应的溶剂和反应条件的组合，任意的溶剂和反应条件的组合均可。具体来说，可以使固定化间隔化合物的载体与含有1μmol/l～50mol/l的稠合嘌呤衍生物相接触，静置，或一边用旋转机、搅拌器等平稳搅拌，一边在0℃～100℃下反应1秒～1000小时，能够在载体表面调制成固定化稠合嘌呤衍生物的载体。作为溶剂，可列举出例如含有盐、表面活性剂、缓冲成分的水溶液、水、DMF、DMSO、THF、二氧六环、甲醇等。
反应结束后，为了除去未反应的稠合嘌呤衍生物，通过上述方法洗净稠合嘌呤衍生物固定化载体。
稠合嘌呤衍生物固定化载体上残留有未反应的官能基时，根据必要，可通过上述方法封闭未反应的官能基。
此外，作为其它的稠合嘌呤衍生物固定化载体的制备方法，可列举出使稠合嘌呤衍生物与间隔化合物反应，合成为用于稠合嘌呤衍生物与载体结合的间隔化合物—稠合嘌呤衍生物复合体，使该化合物与载体结合的方法。
间隔化合物—稠合嘌呤衍生物复合体可通过间隔化合物与稠合嘌呤衍生物复合体反应而调制。此时的溶剂和反应条件为上述反应进行的溶剂和反应条件的组合，间隔化合物、稠合嘌呤衍生物、间隔化合物—稠合嘌呤衍生物复合体，在进行上述结合反应以外的分解反应或稠合反应时、只要是不引起阻碍间隔化合物和稠合嘌呤衍生物的复合体形成的溶剂和反应条件的组合，任何溶剂和反应条件的组合均可。
具体来说，例如，可以混合含有1μmol/l～1mol/l羧酸琥珀酰亚胺的间隔化合物和含有1μmol/l～1mol/l稠合嘌呤衍生物，静置，或一边用旋转机、搅拌器等平稳搅拌，一边在0℃～100℃下反应1秒～1000小时，制备成间隔化合物——稠合嘌呤衍生物复合体。作为溶剂可列举出例如含有盐、表面活性剂、缓冲成分的水溶液，水、DMF、DMSO、THF、二氧六环、甲醇等。
所生成的间隔化合物——稠合嘌呤衍生物复合体可通过薄层色谱、HPLC、二相分离等方法分离、精制。
通过将载体和使用上述方法调制而成的间隔化合物——稠合嘌呤衍生物复合体反应，可调制成稠合嘌呤固定化载体。
此时的溶剂和反应条件为上述的固定化反应进行的溶剂和反应条件的组合，载体、间隔化合物——稠合嘌呤衍生物复合体，在进行上述的固定化反应以外的分解反应或稠合反应时、只要是不引起阻碍该复合体与单体的结合反应的溶剂和反应条件的组合，任何溶剂和反应条件的组合均可。
具体来说，使载体与含有1μmol/l～1mol/l的间隔化合物——稠合嘌呤衍生物复合体的溶液相接触，可列举出与将上述间隔化合物固定化于载体同样的方法的固定化方法。
使由此得到的稠合嘌呤衍生物固定化载体与溶剂接触，可以进行保存。此时的溶剂和保存条件只要使稠合嘌呤衍生物固定化载体稳定，任何溶剂和保存条件的组合均可。具体来说，作为溶剂可列举出例如含有盐、表面活性剂、缓冲成分的水溶液、水、DMF、DMSO、THF、二氧六环、甲醇等。优选保存在室温下，更优选在遮光下，用氦、氩等惰性气体置换。
(2)含有结合稠合嘌呤衍生物的蛋白质(以下称为稠合嘌呤衍生物结合蛋白质)的细胞提取液的调制方法。
用于本发明探索方法的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，只要是与稠合嘌呤衍生物特异性结合的蛋白质，就没有来源上的限定，可列举出，优选源自真核生物的蛋白质，更优选源自动物的蛋白质，进一步优选为源自哺乳动物的器官、脏器、组织或细胞的蛋白质。
作为器官、脏器或组织，可以是公知的任何组织，优选胰脏、胰岛等脏器或组织。作为细胞，可以是公知的任何细胞，优选胰脏β细胞株、胰脏β细胞初次培养细胞等脏器或组织。具体来说，作为β细胞株可列举出BRIN-BD11细胞[Diabetes，45，1132-1140(1996)]、INS-1细胞[Endocrinology，130，167-178(1992)]、βTC细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，9037-9041(1988)]、MIN6细胞[Endocrinology，127，126-132(1990)]、HIT-T15细胞(ATCC CRL-1777)、及RINm5F[Diabetes，31，521-531(1982)]等的细胞。作为β细胞初次培养细胞，可列举出对从胰脏、胰导等的组织中回收的细胞进行短期培养的细胞。
这些细胞可以参照《动物细胞培养法入门》[学会出版中心(1993)]中记载的方法进行培养。
从上述的器官、脏器、组织或细胞中，调制含有稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的试剂的方法，只要是能够回收蛋白质的方法，即可采用公知的方法，例如可采用《蛋白质·酶的基础实验法》修订第2版(南江堂，1994)等记载的方法进行调制。作为器官、脏器、组织或细胞的破碎方法，可采用公知的任何方法，可通过将使用Waring混合机、Polytron粉碎机、Dounce型均化器或超声波粉碎机等装置的机械性破碎、使用低渗溶液的物理性破碎、使用表面活性剂的可溶化、离心分离等操作进行组合，调制该蛋白质试样。
该蛋白质试剂可以在冷藏状态或冰冻状态下保存。
(3)用于本发明的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的探索方法用于本发明的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质可使用上述(1)的方法制备的稠合嘌呤衍生物固定化载体及上述(2)的方法调制的蛋白质试剂来进行探索。
稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的探索方法只要是能够探索稠合嘌呤衍生物的方法，可采用公知的任何方法，例如可采用《蛋白质·酶的基础实验法》修订第2版(南江堂，1994)等记载的方法进行探索。
具体来说，可以使上述(1)的方法制备的稠合嘌呤衍生物固定化载体分散在上述(2)的方法调制的蛋白质试样液中，静置或一边用旋转搅拌器等平稳搅拌，一边在0℃～50℃下反应1秒～1000小时，使稠合嘌呤衍生物结合蛋白质吸附在稠合嘌呤衍生物固定化载体上。该结合反应后，通过洗涤稠合嘌呤衍生物固定化载体除去非特异性吸附在稠合嘌呤衍生物固定化载体上的蛋白质。结合或洗涤所用的溶液只要是本方法可以使用的，即可采用任何溶液，可列举出例如《蛋白质·酶的基础实验法》修订第2版(南江堂，1994)等记载的溶液。
吸附在稠合嘌呤衍生物固定化载体上的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，通过减弱与稠合嘌呤衍生物的结合的方法，可以从稠合嘌呤衍生物固定化载体上洗脱。减弱稠合嘌呤衍生物与该蛋白质结合的方法，只要是本方法可以使用的，即可采用任何方法，可列举出例如添加变性剂、增加盐浓度、加热、添加表面活性剂等方法。作为变性剂可列举出SDS、尿素、盐酸胍等，作为盐可列举出氯化钠、氯化钾等，作为表面活性剂可列举出Nonidet P40、Triton、Tween、洋地黄皂苷等。此外，加热是指例如升温至30～100℃。如此精制而成的结合蛋白质可通过SDS-PAGE、二维电泳、质谱分析等的蛋白质分析方法进行检出。
通过比较该结合蛋白对稠合嘌呤衍生物固定化载体和只实施了封闭的载体的结合性，可以探索出与稠合嘌呤衍生物特异性结合的蛋白。
(4)稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的鉴定方法稠合嘌呤衍生物结合蛋白质通过SDS-PAGE法进行分离，用考马斯亮蓝(CBB)染色后，可以从凝胶中切出。凝胶中的蛋白质可以通过具有赖氨酰内肽酶(lysyl endo peptidase)或以胰蛋白酶等特异性切断点的内蛋白水解酶的处理，被分成肽片段。所得肽片段经过反相HPLC精制后，可以采用气相蛋白序列分析仪或质谱仪研究该蛋白质的部分氨基酸序列。使用这部分氨基酸序列的信息，通过在PIR、SwissProt等氨基酸序列数据库或GenBank等碱基序列数据库中进行同源性检索，可以知道该蛋白质与公知蛋白质的同源性。
作为用上述方法鉴定的蛋白质，可列举出具有如序列号2表示的氨基酸序列的蛋白质。该蛋白质作为NADPH依赖性的具有视黄醇或短链醇氧化还原酶活性的酶而众所周知[Biochimica et BiophysicaActa，1338，47(1997)]。
(5)用于本发明探索方法的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质作为用于本发明探索方法的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，只要是能通过上述(3)和(4)的方法鉴定的蛋白质，可使用任意蛋白质，且它的来源也没有特殊限制，具体来说，可列举出(i)具有用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列的蛋白质；(ii)在用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列中，由1个以上的氨基酸缺失、置换、插入或添加的氨基酸序列形成的，且与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质；(iii)由具有与用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列有60％以上的同源性的氨基酸序列形成的，且与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质。
在用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列中，由1个以上的氨基酸缺失、置换、插入或添加的氨基酸序列形成的蛋白质可使用《分子克隆实验手册》第三版(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press)(2001)(以下简称分子克隆第3版)、《最新分子生物学实验方法汇编》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons(1987-1997)(以下简称最新分子生物学实验方法)、Nucleic AcidsResearch，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、Nucleic Acids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等记载的部位特异性突变导入法，例如可以通过在编码用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列形成的蛋白质的DNA中导入部位特异性突变，获得该蛋白质。
缺失、置换、插入或添加的氨基酸的数量没有特别限定，可以是通过上述的部位特异性突变法能够缺失、置换、插入或添加的数量，即1至数十个，优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个。
用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列中，1个以上的氨基酸缺失、置换、插入或添加是指，在同一序列中的任意位置出现1个或多个氨基酸缺失、置换、插入或添加，缺失、置换、插入或添加可同时发生，置换、插入或添加的氨基酸序列可以是天然型或非天然型的。作为天然型氨基酸残基，可列举出L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L--半胱氨酸等。
以下所示为可以相互置换的氨基酸残基的例子。在同一组中含有的氨基酸残基可以相互置换。
A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸C组天冬酰胺、谷氨酰胺D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸G组苯丙氨酸、酪氨酸上述所得用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列中，为使由1个以上的氨基酸缺失、置换、插入或添加的氨基酸序列形成的蛋白质成为可与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质，应与用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列的同源性在60％以上，通常为80％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上。
氨基酸序列或碱基序列的同源性可以采用Karlin and Altschul的算法BLAST〔Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)〕或FASTA〔Methods Enzymol.，183，63(1990)〕来确定。以算法BLAST为基础开发出了名为BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。以BLAST为基础通过BLASTN解析碱基序列时，参数例如Score＝100，wordlength＝12。以BLAST为基础通过BLASTX解析氨基酸序列时，参数例如Score＝50，wordlength＝3。使用BLAST和GappedBLAST程序时，采用各程序的默认参数。这种解析方法的具体操作是公知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
上述所得的用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列中，由1个以上的氨基酸缺失、置换、插入或添加的氨基酸序列形成的蛋白质是否为能够与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质，可通过以下方法来确认。
使上述(1)的方法中得到的固定了稠合嘌呤衍生物的载体和蛋白质在不阻碍稠合嘌呤衍生物和该蛋白质结合的溶剂中以充分时间接触。反应后，通过离心分离分离该载体，将该载体混悬于对该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质没有解离作用的溶剂中。可通过重复同样操作以清洗该载体。
与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质，通过弱化与该稠合嘌呤衍生物结合的方法，可以从该稠合嘌呤衍生物固定化载体中洗脱。作为弱化稠合嘌呤衍生物与结合蛋白质结合的方法，可采用上述(3)的方法。将洗脱的蛋白质供用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过该电泳可以确认该蛋白质的谱带时，可判定该蛋白质为与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质。
用于本发明探索方法的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的调制方法(1)从脏器等中的调制可用于本发明探索方法的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，只要是可采用本发明的方法，即可使用公知的任何方法进行调制，例如可采用《蛋白质·酶的基础实验法》(日文)修订第2版(南江堂，1994)等记载的方法进行调制。
本发明探索方法所用的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质可通过破碎真核生物的器官、脏器、组织或细胞，作为未精制级分、部分精制级分、精制级分调制。作为真核生物，可以是公知的任意生物，优选哺乳动物。作为器官、脏器或组织，可以是公知的任意器官、脏器或组织，可列举出例如胰脏、胰岛等。作为细胞可列举出例如BRIN-BD11细胞[Diabetes，45，1132-1140(1996)]、INS-1细胞[Endocrinology，130，167-178(1992)]、βTC细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，9037-9041(1988)]、MIN6细胞[Endocrinology，127，126-132(1990)]、HIT-T15细胞(ATCC CRL-1777)、及RINm5F[Diabetes，31，521-531(1982)]等的细胞。作为器官、脏器、组织或细胞的破碎方法，可采用公知的任何方法，可通过将使用Waring混合机、Polytron粉碎机、Dounce型均化器或超声波粉碎机等装置的机械性破碎、使用低渗溶液的物理性破碎、使用表面活性剂的可溶化、离心分离等操作进行组合，调制含有稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的蛋白质级分。
该蛋白质试剂可以在冷藏状态或冰冻状态下保存。
作为从该蛋白质级分中精制稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的方法，可采用将离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤、使用稠合嘌呤衍生物的载体的亲和层析等方法单独或组合来进行精制的方法。
稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的量，通过使用与该稠合嘌呤衍生物结合蛋白质反应的抗体的免疫蛋白印迹法等来测定。
对精制蛋白质对稠合嘌呤衍生物的结合活性的程度可使用上述[1](1)的方法调制而成的固定了稠合嘌呤衍生物的载体来测定。具体来说，例如，对稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的结合复合体，通过弱化该结合的方法可以从该结合复合体中洗脱稠合嘌呤衍生物结合蛋白质。作为弱化稠合嘌呤衍生物与结合蛋白质结合的方法，可采用上述[1](3)的方法。将洗脱的蛋白质供用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过该电泳能够确认该蛋白质的谱带时，可测定被分级的级分中含有该蛋白质的结合活性的程度。
此外，该稠合嘌呤结合蛋白质的活性已知的情况下，可通过测定该蛋白质的活性来评价结合活性。
例如，具有用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质(以下称为p31蛋白)可参照Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons(2001)中记载的方法测定该蛋白质的活性，以测定它和稠合嘌呤衍生物的结合活性。
此外，作为从上述调制而成的蛋白质级分中精制稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的方法，可列举通过使用与该蛋白质反应的抗体的亲和层析进行精制的方法。即，获得与该蛋白质反应的单克隆抗体或多克隆抗体后，可采用Harlow，E.and Lane，D.Using antibodiesAlaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，USA(1999)等中记载的方法等使该载体与色谱载体交联，调制亲和柱，使用该柱从蛋白质级分或部分精制级分中精制稠合嘌呤衍生物结合蛋白质。
(2)使用重组细胞的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的调制用于本发明的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质可使用编码该蛋白质的DNA进行调制。该DNA可根据上述[1](4)鉴定的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的氨基酸序列来制备，可通过使用编码该氨基酸序列的合成DNA，对从生产该蛋白质的细胞、组织等中调制而成的cDNA文库，进行菌落杂交、噬菌斑杂交等方法来获得(《分子克隆》第三版)。
此外，以该氨基酸序列为检索项，通过检索公知的数据库也可以获得编码具有该氨基酸序列的蛋白质的DNA的碱基序列。
作为能够由上述方法获得的DNA，具体来说可列举出例如(i)具有用序列号4～6中任一项表示的碱基序列的DNA；(ii)编码上述[1](5)的(i)～(iii)的任一项记载的蛋白质的DNA；(iii)与具有用序列号4～6中任一项表示的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，且编码与稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的DNA。
在严格条件下可以杂交的DNA是指例如，通过以具有用序列号4～6中任一项表示的碱基序列的DNA的全部或用限制酶消化该DNA得到的DNA片段等作为探针，用菌落杂交、噬菌斑杂交法或Southern印迹杂交法等方法得到的DNA。具体来说，为通过使用固定化来自菌落或噬菌斑的DNA，在0.9mol/l的氯化钠存在下，在65℃下进行杂交后，用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mmol/l氯化钠和15mmol/l的柠檬酸钠)，在65℃下洗涤滤膜得到的能够鉴定的DNA。杂交可参照分子克隆第3版，最新分子生物学实验方法、DNA Cloning 1Core Techniques，A Practical Approach，SecondEdition，Oxford University(1995)等记载的方法进行。
作为可以杂交的DNA，具体来说可列举出，用上述BLAST或FASTA等和上述的参数计算时，与用序列号4～6中任一项表示的碱基序列至少有60％以上的同源性的DNA，优选有80％以上的同源性的DNA，更优选有95％以上的同源性的DNA，再优选有98％以上的同源性的DNA。
稠合嘌呤衍生物结合蛋白质可参照分子克隆第3版或最新分子生物学实验方法等记载的方法，例如可通过以下方法，在宿主细胞中表达编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的DNA来制备。
以全长cDNA为基�。菪枰髦坪斜嗦敫玫鞍字什糠值氖实背ざ鹊腄NA片段。
并且根据需要调制可置换碱基，使编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质部分的碱基序列成为最适于宿主细胞表达的密码子的DNA。该DNA对有效制备稠合嘌呤衍生物结合蛋白质是有用的。
通过在适当的表达载体的启动子下游插入该DNA片段或全长cDNA，制备重组载体。
将该重组载体导入适合于该表达载体的宿主细胞。
作为宿主细胞，是细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等只要能表达目的基因的物质均可使用。
作为表达载体，可采用在上述宿主细胞中可自主复制乃至整合入染色体中的，在能够转录编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的DNA的位置上含有启动子的物质。
将细菌等的原核生物作为宿主细胞使用时，含有编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的DNA而形成的重组载体在原核生物中可自主复制的同时，优选由启动子、核糖体结合序列、本发明的DNA、转录终止序列等构成的载体。也可含有控制启动子的基因。
作为表达载体，可列举出例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均为Boehringer Mannheim公司制)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(QIAGEN公司制)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200〔Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)〕、pLSA1〔Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)〕、pGEL1〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985)〕、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制)、pTrs30〔自大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)调制〕、pTrs32〔自大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)调制〕、pGHA2〔自大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)调制、特开昭60-221091〕、pGKA2〔自大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)调制、特开昭60-221091〕、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J.Bacteriol.，172，2392(1990)〕、pGEX(Pharmacia公司制)、pET system(Novagen公司制)等。
作为启动子，只要是在宿主细胞中发挥功能的物质均可。可列举出例如，trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等的来自大肠杆菌或噬菌体的启动子。或也可以使用使Ptrp两个串联的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、lacT7启动子、letI启动子这样的人工设计改变的启动子。
优选使用作为核糖体结合序列的SD(Shine-Dalgarno)序列和起始密码子之间调节至适当距离(例如6～18碱基)的质粒。
作为本发明的重组载体的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的DNA的表达中转录终止序列并不一定是必须的，但优选在结构基因的正下方配置转录终止序列。
作为宿主细胞，可列举出属于埃希杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、微杆菌属、假单胞菌属的微生物，例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌GI698、大肠杆菌TB1、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短杆菌ATCC14066(Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066)、黄色短杆菌ATCC14067(Brevibacterium flavum ATCC14067)、乳发酵短杆菌ATCC13869(Brevibacterium lactofermentum ATCC13869)、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869(Corynebacterium glutamicumATCC13869)、嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870(Corynebacteriumacetoacidophilum ATCC13870)、嗜氨微杆菌ATCC15354(Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌属D-0110(Pseudomonas sp.D-0110)等。
作为重组载体的导入方法，只要是能向上述宿主细胞导入DNA的方法均可使用。例如使用钙离子的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)〕，裸细胞法(特开昭63-2483942)，或Gene，17，107(1982)或Molecular & General Genetics，168，111(1979)中记载的方法等。
使用酵母作为宿主细胞时，作为表达启动子，可列举出例如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作为启动子，只要是能在酵母菌株中发挥功能的物质均可使用。可列举出例如己糖激酶等的糖酵解系统的基因的启动子、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等。
作为宿主细胞，可列举出属于糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、克雷维氏酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)等的微生物，例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳克雷维氏酵母(Kluyveromyceslactis)、茁芽丝孢酵母属(Trichosporon pullulans)、河岸许旺氏酵母(Schwanniomyces alluvius)、产朊假丝酵母(Candida utilis)等。
作为重组载体的导入方法，只要是能向上述酵母导入DNA的方法均可使用。例如使用电穿孔法[Methods Enzymol.，194，182(1990)]、原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)]、醋酸锂法[J.Bacteriology，153，163(1983)]、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)中记载的方法等。
使用动物细胞作为宿主时，作为表达载体，可列举出例如pcDNAI、pCDM8(Invitrogen公司制)、pAGE107〔特开平3-22979、Cytotechnology，3，133(1990)〕、pAS3-3(特开平2-227075)、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pAGE103〔J.Biochem.，101，1307(1987)〕、pAGE210等。
作为启动子，只要是能在动物细胞中发挥功能的物质均可使用。可列举出例如巨细胞病毒(CMV)的IE(immediate early)基因的启动子，SV40的初期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRa启动子等。并且可将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。
作为宿主细胞，可列举出人细胞的类淋巴(Namalwa)细胞、猴细胞的COS细胞、中国仓鼠细胞的CHO细胞、HBT5637(特开昭63-299)等。
作为向动物细胞导入重组载体的方法，只要是能向动物细胞导入DNA的方法均可使用。可列举出例如电穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸钙法(特开平2-227075)、脂转染法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)〕、Virology，52，456(1973)等。
使用昆虫细胞作为宿主细胞时，例如通过最新分子生物学实验方法、Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)、Bio/Technology，6，47(1988)等中记载的方法能够表达多肽。
即，向昆虫细胞中共同导入重组基因导入载体和杆状病毒，从昆虫细胞培养上清液中得到重组病毒后，进一步使昆虫细胞感染该重组病毒，能够表达多肽。
作为该方法所用的基因导入载体，可列举出例如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(均为Invitorogen公司制)等。
作为杆状病毒，可使用例如感染夜盗蛾科昆虫的病毒——苜蓿夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus)等。
作为昆虫细胞，可使用秋粘虫的卵巢细胞Sf9、Sf21〔Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)〕、Trichoplusiani、粉纹夜蛾的卵巢细胞High 5(Invitrogen公司制)等。
作为调制重组病毒用的、向昆虫细胞共同导入上述重组基因导入载体和杆状病毒的方法，可列举出例如磷酸钙法(特开平2-227075)、脂转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等。
使用植物细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，可列举出例如Ti质粒、烟草花叶病毒等。
作为启动子，只要是能在植物细胞中发挥功能的物质均可使用。可列举出例如菜花样花叶病毒(CaMV)的35S启动子、水稻肌动蛋白1启动子等。
作为宿主细胞，可列举出烟草、马铃薯、西红柿、胡萝卜、大豆、油菜、紫花苜蓿、稻子、小麦、大麦等的植物细胞等。
作为重组载体的导入方法，只要是能向植物细胞中导入DNA的方法均可使用，可列举出例如使用土壤杆菌属(Agrobacterium)(特开昭59-140885、特开昭60-70080、特开昭WO94/00977)、电穿孔法(特开昭60-251887)、粒子枪(基因枪)的方法(日本特许第2606856、日本特许第2517813)等。
在培养基中培养以上所得转化体，使培养物中蓄积生成稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，通过从该培养物中采集的方法，能够制备稠合嘌呤衍生物结合蛋白质。
在培养基中培养该转化体的方法，可参照培养宿主所用的常规方法来进行。
该转化体为以大肠菌等原核生物或酵母等真核生物为宿主时得到的转化体时，作为培养该转化体的培养基，只要是含有使该转化体可以利用的碳源、氮源、无机盐类等、并能有效进行该转化体的培养的培养基，使用天然培养基、合成培养基均可。
作为碳源，只要是能使该转化体可以利用的物质均可，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等的碳水化合物、乙酸、丙酸等的有机酸、乙醇、丙醇等的醇类等。
作为氮源，可使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐，其他的含氮化合物，以及胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆糟及大豆糟水解物、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机盐，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养应在振荡培养或深部通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度可为15～40℃，培养时间通常为16小时～7天。培养中的pH优选保持在3.0～9.0。PH的调整可用有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、铵等。
并且根据需要，也可在培养时向培养基中添加氨苄青霉素或四环素等抗生素。
在用诱导性启动子作启动子的重组载体上培养转化的微生物时，根据需要，可向培养基中添加诱发因子。例如，通过使用lac启动子的重组载体培养转化的微生物时可向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷等，通过使用trp启动子的重组载体培养转化的微生物时可向培养基中添加吲哚丙烯酸。
作为培养以动物细胞为宿主得到的转化体的培养基，可使用常用的RPMI1640培养基[The Journal of the American MedicalAssociation，199，519(1967)]、Eagle氏MEM培养基[Science，122，501(1952)]、Dulbecco改良MEM培养基[Virology，8，396(1959)]、199培养基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950)]或向这些培养基中添加胎牛血清等的培养基。
培养通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在的条件下进行1～7天。
并且根据需要，也可在培养时向培养基中添加卡那霉素或青霉素等抗生素。
作为培养以昆虫细胞为宿主得到的转化体的培养基，可使用常用的TNM-FH培养基(Pharmingen公司制)、Sf-900 II SFM培养基(Life Technologies公司制)、ExCell400、ExCell405(均为JRHBiosciences公司制)、Grace′s Insect Medium〔Nature，195，788(1962)〕等。
培养通常在pH6～7、25～30℃等的条件下进行1～5天。
并且根据需要，也可在培养时向培养基中添加庆大霉素等抗生素。
以植物细胞为宿主得到的转化体作为细胞，可使植物的细胞或器官分化进行培养。作为培养转化体的培养基，可使用常用的Murashige&Skoogl(MS)培养基、怀特(White)培养基、或向这些培养基中添加植物生长素、细胞分裂素等植物激素的培养基等。
培养通常在pH5～9、20～40℃等的条件下进行3～60天。
并且根据需要，也可在培养时向培养基中添加卡那霉素或潮霉素等抗生素。
如上所述，通过对源自具有整合入编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的DNA的重组载体的微生物、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞的转化体采用常规方法进行培养，使稠合嘌呤衍生物结合蛋白质生成蓄积，由该培养物中收集稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，可制备稠合嘌呤衍生物结合蛋白质。
通过酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞表达时，能够得到添加有糖或糖链的蛋白质。
作为生产稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的形态，除了以原结构制备稠合嘌呤衍生物结合蛋白质以外，参照分子克隆第3版所记载的方法，可以作为连接标记肽的融合蛋白质，或作为连接信号序列的分泌蛋白质来制备。
作为融合标记肽，可列举出myc多肽、β-半乳糖苷酶、蛋白质A、蛋白质A的IgG结合领域、氯霉素·乙酰基转移酶、聚(精氨酸)、聚(谷氨酸)、蛋白质G、麦芽糖结合蛋白质、谷胱甘肽-S-转移酶、聚组氨酸链(His-tag)、S肽、DNA结合蛋白质区、Tac抗原、硫氧还蛋白、绿荧光蛋白、FLAG肽及任意抗体的表位等。作为信号序列，可列举出任意的分泌蛋白质的信号序列〔山川彰夫，实验医学，13，469-474(1995)〕。
作为稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的生产方法，有宿主细胞内生产的方法、宿主细胞外分泌的方法、或宿主细胞外膜上生产的方法，通过改变使用的宿主细胞或生产的宿主细胞的结构可以选择该方法。
稠合嘌呤衍生物结合蛋白质在宿主细胞内或宿主细胞外膜上生产时，通过参照Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.，264，17619(1989)]、Lowe等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，8227(1989)、Genes Develop.，4，1288(1990)]、或特开平5-336963、WO94/23021等中记载的方法，可以使稠合嘌呤衍生物结合蛋白质向宿主细胞外积极的分泌。
即，使用基因重组的方法，通过在含有稠合嘌呤衍生物结合蛋白质活性部位的多肽的前端添加信号肽的形式表达，可以使稠合嘌呤衍生物结合蛋白质向宿主细胞外积极的分泌。
此外，参照特开平2-227075记载的方法，通过使用二氢叶酸还原酶的基因等的基因扩增系统，也可以提高生产量。
并且，通过导入基因的动物或植物细胞的再分化，制造导入基因的动物个体(转基因非人动物)或植物个体(转基因植物)，利用该个体也可以制备稠合嘌呤衍生物结合蛋白质。
当转化体为动物个体或植物个体时，参照常规方法饲养或栽培，使该蛋白质蓄积生成，通过从该动物个体或植物个体中采集该蛋白质，可以制备稠合嘌呤衍生物结合蛋白质。
作为使用动物个体的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的制备方法，可列举出例如可参照公知的方法[American Journal of ClinicalNutrition，63，639S(1996)、American Journal of ClinicalNutrition，63，627S(1996)、Bio/Technology，9，830(1991)]导入基因而形成的动物中稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的制备方法。
动物个体情况下，例如，饲养导入编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的DNA的转基因非人动物，使该蛋白质在动物中生成蓄积，通过从该动物个体中采集该蛋白质，可以制备稠合嘌呤衍生物结合蛋白质。作为在该动物中生成蓄积的部位，可列举出例如动物的乳(特开昭63-309192)、卵等。此时作为所用的启动子，只要是能在动物中表达的启动子均可使用，例如优选使用乳腺细胞特异性启动子的α酪蛋白启动子、β酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子等。
作为使用植物个体的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的制备方法，可列举出例如参照公知的方法[组织培养，20(1994)、组织培养，21(1995)、Trends in Biotechnology，15，45(1997)]栽培导入编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的DNA的转基因植物，使稠合嘌呤衍生物结合蛋白质在该植物中生成蓄积，通过从该植物个体中采集稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，可以制备稠合嘌呤衍生物结合蛋白质。
为分离精制由上述转化体制备的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，可使用通常的酶的分离精制法。例如，稠合嘌呤衍生物结合蛋白质在细胞内以溶解状态表达时，培养终止后，通过对细胞离心分离进行回收，在水系缓冲液中进行混悬、通过超声波粉碎机、涂刮机、Manton·Gaulin式均化器、细胞粉碎机(dynomill)进行破碎细胞，得到无细胞提取液。从离心分离该无细胞提取液得到的上清液中，使用通常的酶的分离精制法，即单独或组合使用溶剂提取法、采用硫铵等的盐析法、脱盐法、采用有机溶剂等的沉淀法，采用二乙氨基乙基(DEAE)琼脂糖凝胶、DIAION HPA-75(三菱化学公司制)等树脂的阴离子交换色谱法，采用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等树脂的阳离子交换色谱法，采用丁基纤维素、苯基纤维素等树脂的疏水性色谱法，使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、层析聚焦等，等电点电泳等的电泳法等方法，能够得到精制标准品。
此外，当稠合嘌呤衍生物结合蛋白质在细胞内形成不溶物而表达时，通过进行同样的细胞回收后，破碎、离心分离，回收作为沉淀级分的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的不溶物。回收的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的不溶物用蛋白质改性剂变为可溶化。稀释且透析该可溶性溶液，通过降低该可溶性溶液中的蛋白质改性剂的浓度，使稠合嘌呤衍生物结合蛋白质恢复正常的立体结构。该操作后，通过与上述相同的分离精制法，可得到稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的精制标准品。
稠合嘌呤衍生物结合蛋白质或稠合嘌呤衍生物结合蛋白质中添加有糖链的该蛋白质的衍生物在细胞外分泌时，可以从培养上清液中回收该蛋白质或该蛋白质的衍生物。即，通过用与上述相同的方法对该培养物进行离心分离处理获得上清液，通过用与上述相同的分离精制法从该培养上清液中，可以得到精制标准品。
并且，稠合嘌呤衍生物结合蛋白质可以使用编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的DNA在体外的转录-翻译系统来制造。
作为体外转录-翻译系统，可参照公知的方法[Kigawa T.等，J.Biomol.NMR，6，129(1998)、Spirin A.S.等，Science，242，1162(1988)、Kigawa T.&Yokoyama S.，J.Biochem.，110，166(1991)]使用体外转录·翻译系统。即，将编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的DNA连接在SP6、T7、T3等启动子的下游处，通过与各自的启动子特异性RNA聚合酶反应，在体外合成大量的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质RNA后，利用无细胞系的翻译系统，例如使用兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取液或大肠杆菌提取液等的翻译系统，可以生成稠合嘌呤衍生物结合蛋白质。从该反应液中，通过同样的分离精制法，可以得到精制标准品。
此外，用于本发明探索方法的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质可通过Fmoc法(芴基甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法进行制造。或者，也可利用Advanced ChemTech公司、PerkinElmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所等的肽合成仪进行化学合成。
作为如此取得的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，可列举出例如含有用序列号1～3任一可表示的氨基酸序列的蛋白质。
具有用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质抗糖尿病作用的物质的探索方法。
具有抗糖尿病作用的物质可通过以下步骤获得①测定被检物质存在下，稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质接触时的该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合量；②测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质接触时的该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合量；③比较被检物质存在下和不存在下的该测定值；④选择因被检物质而阻碍该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合的物质。
作为上述方法所使用的稠合嘌呤衍生物，可列举出用上述2的方法制备的上述1的化合物，作为稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，可列举出如上述4[2]的方法制备的上述4[1]的蛋白质。具体来说，可列举出上述4[1](5)的(i)～(iii)的蛋白质。
作为测定稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的结合体的量的方法，可列举出例如通过结合介入特异性识别选自将稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的任意一方的分子通过物理吸附、共价键结合等在多孔板、色谱载体或胶乳等的珠、表面胞质团共振测定用的芯片或质量测定用的靶等的固相或与稠合嘌呤衍生物结合蛋白质反应的抗体等、标记肽、肽标记物和信号肽中的肽的分子，根据需要实施抑制非特异性吸附的封闭等的处理后，添加其他分子，进一步清洗除去未被吸附的其他分子，根据作为其他分子的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质或稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的活性、结合特性、表面胞质团共振的发生、或质量分析的信号强度等检出结合的其他分子，来检出稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的结合量的方法。
通过用上述方法的任意一种比较被检物质存在下的稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的结合量和被检物质不存在下的该结合量，可以从被检物质中选择以稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的结合的阻碍活性为指标的具有抗糖尿病作用的物质。
该物质为具有抗糖尿病作用，例如具有胰岛素分泌促进作用的物质可通过使胰脏β细胞或含有该细胞的组织与上述被选物质在葡萄糖存在下接触时，由该物质使胰脏β细胞的胰岛素分泌被促进的方法来确认〔Diabetorogia，36，1139(1993)〕。
使用稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质结合的物质的探索方法与稠合嘌呤衍生物结合蛋白质结合的物质可通过以下步骤获得①测定被检物质存在下，稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时的该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量；②测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时的该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量；③比较被检物质存在下和不存在下的该测定值；④选择因被检物质而阻碍稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合的物质后，⑤利用④的步骤得到的物质，选择与稠合嘌呤衍生物结合蛋白质相结合的物质。
上述①～④的步骤可依据上述3的方法进行。作为用上述①～④的步骤从被选物质中选择出与稠合嘌呤衍生物结合蛋白质相结合的物质的方法，可列举出例如根据标记测定、比较使标记化的该物质与胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，标记化的该物质和来自胰脏的细胞或组织或它们的处理物以外的细胞等相接触时的该物质的活性，通过选择胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合性高的物质，选择与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相结合的物质的方法。结合活性可参照上述3[3]的方法测定。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的与稠合嘌呤衍生物结合蛋白质相结合的物质的探索方法。
在上述4[4]的方法中，代替胰脏β细胞或该细胞的处理物，使用由上述4[1]和[2]的方法得到的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，通过用上述4[4]①～④的步骤选择的物质，参照上述4[3]的方法，可获得与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相结合的物质。
此外，稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的结合可作为稠合嘌呤衍生物结合蛋白质与其他的蛋白质的融合蛋白质来制备，也可通过使用带有与被融合的蛋白质的亲和性的物质特异性检出选自标记肽、肽标记物或信号肽的肽来测定。例如，作为被融合的肽使用β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白等时以该酶活性为指标，使用绿荧光蛋白(GFP)等时以荧光为指标，使用蛋白质A、蛋白质A的IgG结合领域、聚(精氨酸)、聚(谷氨酸)、蛋白质G、麦芽糖结合多肽、聚组氨酸链(His-tag)、DNA结合多肽区等时以与其特异性结合分子的结合为指标，使用myc多肽、S肽、Tac抗原、FLAG肽、任意抗体的表位等时以与特异性抗体的结合为指标，能够检出。
β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、绿荧光蛋白(GFP)、蛋白质A、蛋白质A的IgG结合领域、聚(精氨酸)、聚(谷氨酸)、蛋白质G、麦芽糖结合多肽、聚组氨酸链(His-tag)、DNA结合多肽片段等与它们的特异性抗体结合为指标也能检出。
此外，将稠合嘌呤衍生物结合蛋白质和稠合嘌呤衍生物的任意一方或双方在与生物素的结合中具有特异性的分子或荧光试剂、RI标记试剂等修饰后，通过使用上述反应系，使用生物素等的结合特异性结合固相，或以生物素等的结合特异性或荧光、放射性等为指标也能检出相互作用。
并且，将蛋白质和多肽用适当的荧光色素标记，通过荧光能量共振转移(FRET)，利用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质结合时的只发出的荧光，可以在溶液系中检出稠合嘌呤衍生物结合蛋白质和稠合嘌呤衍生物的相互作用。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的使与稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的活性变化的物质的探索方法使与稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质活性变化的物质可通过以下步骤获得①测定被检物质和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质接触时的该蛋白质的活性；②测定不接触被检物质时的该蛋白质的活性；③比较被检物质存在下和不存在下的该测定值；④选择因被检物质而使该蛋白质活性变化的物质。
作为上述方法使用的稠合嘌呤衍生物，可列举出用上述2的方法制备的上述1的化合物，作为稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，可列举出用上述4[2]的方法制备的上述4[1]的蛋白质。
在该蛋白质的活性公知的情况下可参照公知的方法测定该酶的活性。
例如，作为该蛋白质，使用含有用序列号1表示的氨基酸序列的蛋白质时，该活性可参照Biochem.Biophys.Acta，1338，47(1977)记载的方法进行测定。
具体来说，可使用成为该蛋白质的底物的NADP、NADPH或视黄醛、视黄醇、对氯苯甲醛等的醇、醛[Biochimica et Biophysica Acta，1338，47(1997)]等，通过用分光光度测定、荧光光度测定、或高效液相色谱等监测蛋白质引起的底物消失速度或产物的分解速度，可以测定该蛋白质的活性。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的抑制稠合嘌呤衍生物结合蛋白质活性的物质的探索方法。
抑制稠合嘌呤衍生物结合蛋白质活性的物质可以从使上述[6]的方法得到的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的活性发生变化的物质中选择作为使该蛋白质的活性降低的物质。
此外，抑制稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的活性的物质可通过以下步骤获得调制稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的基质衍生物，向两者结合的检出体系中添加被检物质，以被检物质引起的该结合的阻碍为指标，选择作为阻碍稠合嘌呤衍生物结合蛋白质和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的基质衍生物相结合的化合物。
具体来说，可以从根据上述[3]的方法所选择的与稠合嘌呤衍生物结合蛋白质相结合的化合物中，选择抑制稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的活性的物质。
此外，通过①测定被检物质存在下，稠合嘌呤衍生物结合蛋白质和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的底物衍生物的结合量；②测定被检物质不存在下，该蛋白质和该蛋白质的底物衍生物的结合量；③比较被检物质存在下和不存在下的该测定值；④通过选择因被检物质而阻碍该蛋白质和该蛋白质的底物衍生物的结合的物质，也可以选择抑制稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的活性的物质。
这里，稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的基质衍生物是指从可成为稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的基质而得到的物质中衍生出的物质，具体来说，例如作为稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，使用序列号1表示的氨基酸序列构成的蛋白质时，作为该蛋白质基质衍生物，可列举出NADP、NADPH的衍生物或视黄醛、视黄醇、对氯苯甲醛等的醇、醛等的成为该蛋白质的基质而得到的物质的衍生物[Biochimica et BiophysicaActa，1338，47(1997)]。
作为更具体的方法，可以通过结合介入特异性识别选自将稠合嘌呤衍生物结合蛋白质和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的基质衍生物的任意一方的分子通过物理吸附、共价键结合等在多孔板、色谱载体或乳胶等的珠、表面胞质团共振测定用的芯片或质量测定用靶等的固相或与稠合嘌呤衍生物结合蛋白质反应的抗体等、标记肽、肽标记物和信号肽中的肽的分子，根据需要实施抑制非特异性吸附的封闭等的处理后，添加其他分子，进一步清洗除去未吸附的其他分子，根据作为其他分子的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的活性、结合特性、表面胞质团共振的发生、或质量分析的信号强度等检出结合的其他分子，来检出稠合嘌呤衍生物结合蛋白质和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的基质衍生物的结合量。
通过从[5]～[7]的任意方法中选出2种以上的方法进行组合，可以从由[5]～[7]的方法所选的物质中，获得作为胰岛素促泌剂的具有优选活性的化合物。此外，根据需要，通过下述[11]的方法，能够获得作为胰岛素促泌剂的具有更优选活性的化合物。
作为胰岛素促泌剂具有良好活性的化合物是指例如作为胰岛素促泌剂的不良活性低的化合物。可列举出例如，以往的胰岛素促泌剂具有的副作用——体重减少、骨髓抑制、肝脏损害、肾毒性、神经毒性等减轻的化合物。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的使稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的功能变化的物质的探索方法使稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的功能变化的物质可通过以下步骤获得①测定被检物质和表达稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的转化体接触时的该转化体的细胞应答；②测定被检物质不存在下的该转化体的细胞应答；③比较被检物质存在下和不存在下的该测定值；④选择因被检物质而使该转化体的细胞应答发生变化的物质。
表达稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的转化体可通过上述4[2](2)的方法进行调制。
作为被检物质和该转化株接触时的该转化株的细胞应答，可列举出例如细胞内信息传递、基因转录、糖的摄取、增殖等的变化等，这些变化可用公知的方法进行检出。
作为更具体的细胞的应答，可列举出例如花生四烯酸游离、乙酰胆碱游离、细胞内Ca2+游离，细胞内cAMP生成，细胞内cGMP生成，肌醇磷酸产生、细胞膜电位改变、细胞内蛋白质的磷酸化、c-fos活化、pH的降低，黑色素的凝集或扩散，胰岛素的分泌促进等。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的使编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的基因的表达量变化的物质的探索方法。
使编码与稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的基因的表达量变化的物质可通过以下步骤获得①测定被检物质和表达稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的转化体接触时的该转化体的编码该蛋白质的基因的表达量；②测定被检物质不存在下的该转化体的编码该蛋白质的基因的表达量；③比较被检物质存在下和不存在下的该测定值；④选择因被检物质而使编码该蛋白质的基因的表达量发生变化的物质。
作为具体的方法，表达与被检物质接触和不接触的稠合嘌呤衍生物结合蛋白质，根据常规方法从上述4[2](2)的方法可以调制的各种转化细胞中调制总RNA或聚(A)+RNA，使用从编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的DNA中调制而成的引物DNA，通过RT-PCR[PCRProtocols、Academic Press(1990)]测定编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的基因的表达量，通过比较各表达量，获得使编码稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的基因的表达量变化的物质。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的使稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的表达量变化的物质的探索方法。
使与稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的表达量变化的物质可通过以下步骤获得①测定被检物质和表达稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的转化体接触时的该转化体的蛋白质的表达量；②测定被检物质不存在下的该转化体的该蛋白质的表达量；③比较被检物质存在下和不存在下的该测定值；④选择因被检物质而使该蛋白质的表达量发生变化的物质。
表达与稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的转化体可通过上述4[2](2)的方法进行调制。
作为测定稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的表达量的方法可举出免疫学定量法。
作为免疫学定量法，可列举出例如使用在液相中和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质反应的抗体中表位不同的2种的单克隆抗体的夹心ELISA法，使用125I等的放射性同位素标记的识别稠合嘌呤衍生物结合蛋白质和该蛋白质的抗体的放射免疫分析法等。
与稠合嘌呤衍生物结合蛋白质反应的抗体，使用该蛋白质或该蛋白质的部分片段肽的精制品，通过公知的方法可以制备为多克隆抗体、单克隆抗体等。
胰岛素分泌促进活性评价作为胰岛素分泌促进活性的评价体系，也可以利用公知的任何方法。
作为使用动物的方法，可列举出例如采用Wistar系大鼠给药被检物质时，进行口服糖负荷试验，选择有血糖抑制效果但又不引起低血糖的被检物质的方法(WO00/01388)。
使用摘除组织或培养组织的方法，使用作为在胰脏胰岛、初代培养细胞胰脏β细胞、培养β细胞之中显示相应于5～10mmol/l的葡萄糖浓度的生理变化显示胰岛素分泌功能的培养β细胞BRIN-BD11细胞[Diabetes，45，1132-1140(1996)]、INS-1细胞[Endocrinology，130，167-178(1992)]、βTC细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，85，9037-9041(1988)]、或MIN6细胞[Endocrinology，127，126-132(1990)]，选择在低葡萄糖浓度下即使添加被检物质也不会促进胰岛素分泌，而在高葡萄糖浓度下添加被检物质也只有高葡萄糖单独促进胰岛素分泌的被检物质的方法(特开昭2000-154139)。
在培养β细胞株中，胰脏β细胞MIN6细胞[Endocrinology，127，126-132(1990)]胰岛素含量和受葡萄糖刺激而使胰岛素分泌量近似于生物体内的胰脏β细胞，在应答葡萄糖浓度、胰岛素分泌上升这一点上良好的保存了生物体内的胰脏β细胞的性质[Endocrinology，127，126-132(1990)]。此外，MIN6细胞从对作为糖尿病治疗药而使用的磺酰脲类药物，例如从格列本脲的应答、促进胰岛素分泌这一点上来看而更优选〔Cellular Signalling，5，777-786(1993)〕。
MIN6细胞的培养和使用MIN6细胞的胰岛素分泌试验可参照Diabetologia，36，1139-1145(1993)中记载的方法进行。
此外，化合物对胰岛素分泌活性的影响，如下述那样，可通过测定收集的细胞培养上清液中的胰岛素含量而求出。
将24孔板中培养的MIN6细胞，用1ml含有2mmol/l葡萄糖的缓冲液A[119mmol/l氯化钠、4.74mmol/l氯化钾、2.54mmol/l氯化钙、1.19mmol/l硫酸镁、1.19mmol/l磷酸二氢钾、10mmol/l2-[4-(2-羟乙基)-1-哌啶基]乙磺酸、0.1％牛血清白蛋白pH7.3]清洗2次后，在1ml的含有2mmol/l葡萄糖的缓冲液A中，在37℃下温育45分钟。温育后，将培养上清液和各种浓度的试验化合物和含有8.4mmol/l的葡萄糖缓冲液A(1ml)交换，再在37℃下温育45分钟，收集培养上清液。从培养上清液中分泌出的抗体反应性胰岛素用含有1％牛血清白蛋白、0.1％Tween20、0.12％EDTA·2Na、0.1％迭氮化钠的磷酸缓冲液稀释后，用放射免疫分析法定量。以人胰岛素为标准品做出标准曲线，可以由曲线算出各自的胰岛素的含量。并且，能够以添加代替试验化合物的溶剂——二甲基亚砜时得到的胰岛素值为100％，计算各自的测定值的相对量(％)。
通过本发明方法选择的具有胰岛素分泌促进活性的化合物作为通过本发明方法选择的具有胰岛素分泌促进活性的化合物，可举出如下述通式(V)所表示的化合物。
[式中，R1B、R2B、R3B相同或不同，表示氨基、单或二取代氨基、或含有N的取代或非取代杂环基(该杂环基通过N原子与三嗪环结合)]作为通过N原子与三嗪环结合的杂环基，可列举出吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、嘌呤基、吡咯烷基、2，5-二氧基吡咯烷基、噻唑烷基、噁唑烷基、2-氧基噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、吗啉基、硫代码啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、四氢喹喔啉基、八氢喹啉基、二氢吲哚基、1，3-二氧异吲哚基等。
上述式(V)的各基的定义中，取代的意义是指例如由取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基而发生的取代等。
这里，取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基分别与上述式(II)的定义中的取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基同义。
更具体的说，可列举出如下述表2中记载的化合物编号193～200所表示的化合物。
表2 上述化合物可参照WO01/47921中记载的方法和公知的普通合成方法来合成。也可由ChemBrige公司购入。
含有通过本发明方法所选物质的药物含有由本发明方法所选物质为有效成分的药物，虽可以单独给药该有效成分，但通常希望提供作为将该有效成分与药理学允许的一种或一种以上的载体一起混合，用制剂学技术领域中熟知的任意方法制备的药品。优选使用水或食盐、甘氨酸、葡萄糖、人白蛋白等的水溶液的水性载体中溶解的无菌溶液。此外，也可添加使制剂溶液接近生理条件的缓冲剂或等渗剂那样的药用添加剂，例如醋酸钠、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、柠檬酸钠等。并且，冷冻干燥而储藏，在使用时也可添加适当溶剂使其溶解。
给药途径期望采用治疗时最有效果的给药途径，可列举出口服给药或口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌内和静脉内等的非口服给药。给药剂型可列举出喷雾剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏、贴剂等。
作为口服给药的适当制剂，可列举乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂等。例如乳剂和糖浆剂这样的液体调制物可使用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等的糖类；聚乙二醇、丙二醇等的二元醇类；芝麻油、橄榄油、大豆油等的油类；对羟基苯甲酸酯类等的防腐剂；草莓香料、薄荷香料等的香料类等作为添加剂来制造。胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂等可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等的赋形剂、淀粉、藻酸钠等的崩解剂、硬脂酸镁、滑石粉等的润滑剂、聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等的粘合剂、脂肪酸酯等的表面活性剂、甘油等的增塑剂等作为添加剂来制造。
作为非口服给药的适当剂型，可列举出注射剂、栓剂、喷雾剂等。例如，注射剂使用盐溶液、葡萄糖溶液或以上两者的混合物组成的载体来调制。栓剂使用可可豆脂、氢化脂肪或羧酸等的载体来调制。此外，喷雾剂使用该物质本身乃至那些不刺激服药者的口腔和气管粘膜，并且可使该物质以细小颗粒分散而容易吸收的载体进行调制。作为载体具体可举例乳糖、甘油等。根据该物质和使用载体的性质不同，可以是气溶胶剂、干粉剂等的制剂。此外，在这些非口服制剂中也可添加作为口服制剂中的添加剂而举例的成分。
给药剂量或给药次数以治疗效果为目的，根据给药方法、治疗期间、年龄、体重等而不同，通常成人为每日10μg/kg～8g/kg。
图1的A表示使用胰脏β细胞时的用3H标记的化合物16所表示的化合物的结合饱和曲线图。图中，○-○表示总结合量，○----○表示非特异性结合量，●-●表示特异性结合量。
图1的B为上述A的斯卡查德曲线图。
图2表示对于使用胰脏β细胞时的用3H标记的化合物16所表示的化合物的特异性结合，稠合嘌呤衍生物的阻碍作用和胰岛素分泌促进作用的相关性图。
图3的A表示使用胰脏β细胞膜级分时的用3H标记的化合物16所表示的化合物的结合饱和曲线图。图中，▲----▲表示总结合量，○---○表示非特异性结合量，●-●表示特异性结合量。
图3的B为上述A的斯卡查德曲线图。
图4表示对于使用胰脏β细胞膜级分时的用3H标记的化合物编号16所表示的化合物的特异性结合，稠合嘌呤衍生物的阻碍作用和胰岛素分泌促进作用的相关性图。图的标记位置的数字表示化合物的编号。化合物编号中，95*表示化合物95的酒石酸盐。
图5表示使用胰脏β细胞的可溶性级分时的用3H标记的化合物16所表示的化合物的结合图。
图6表示用9％的丙烯酰胺凝胶对重组His-p31进行SDS-PAGE的结果图。条1为精制的重组His-p31，条M为电泳分子量标记物的条。箭头表示重组His-p31蛋白质的位置。
图7表示使用各化合物的BIAcore计算出的His-p31蛋白质和化合物155所表示的化合物(以下称化合物155)的结合阻碍作用和胰岛素分泌促进活性的相关性图。图的曲线上的数字表示化合物编号。
图8表示使用MIN6细胞的细胞提取液和稠合嘌呤衍生物固定化颗粒的探索胰岛素促泌剂的图。表示使用9％的丙烯酰胺凝胶进行的SDS-PAGE图。条1为使用未固定化合物155的颗粒从MIN6细胞提取液中精制出的蛋白质，条2为使用化合物155固定化颗粒从MIN6细胞提取液中精制出的p31蛋白质，条3为使用化合物155固定化颗粒，用化合物16表示的化合物从预处理过的MIN6细胞提取液中精制的蛋白质，条4为使用化合物155固定化颗粒，用化合物17表示的化合物从预处理过的MIN6细胞提取液中精制出的蛋白质，条M表示电泳分子量标记物。箭头表示p31蛋白质的位置。
具体实施例方式
以下根据实施例、试验例说明本发明，但本发明并不限于这些实施例、试验例。
实施例1 标记化稠合嘌呤衍生物的合成如下式(VI)所示的化合物16的3H标记物(以下称为[3H]标记化合物16)能够以参照WO00/01388记载的方法合成的上述表1中化合物编号23表示的化合物的R体为原料，通过3H-gas法，由AmershamPharmacia公司合成。
实施例2 胰脏β细胞的破碎液的调制将MIN6细胞〔Endocrinology，127，126-132(1990)〕置于细胞培养用烧瓶(182cm2、Gliner公司制)中，在37℃、5％CO2气氛下，用含15％胎牛血清和5g/l葡萄糖的DMEM培养基(Dulbecco改良Eagle氏培养基，日水制药公司制)培养，直至汇合。并且以下操作均在冰上进行。
MIN6细胞汇合后，除去培养基，用30ml冰冷却过的磷酸缓冲生理盐水(PSS)清洗2次。然后，添加用冰冷却后的Tris-HCl缓冲液[10mmol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/l氯化钠(NaCl)、2mmol/l乙二胺四乙酸(EDTA)、10μg/ml亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、1mmol/l苯甲基磺酰氟(PMSF)、pH7.4]3ml，用细胞刮板剥离贴着烧杯的细胞，再用巴氏吸量管回收细胞。通过再重复一遍该操作，从182cm2烧瓶中得到6ml的细胞混悬液，将该细胞混悬液用匀桨机破碎细胞后，用离心分离机Himac CF7D2(日立公司制)，在4℃、10分钟、每分3500转下离心分离，回收其上清液作为细胞破碎液。
实施例3 胰脏β细胞的膜级分的调制将实施例2得到的细胞破碎液用离心分离机Himac CP100α(日立制作所制)、用转头RP50T(日立制作所制)在4℃、30分钟、每分35000转下离心分离后，废弃上清液，向残留的沉淀中加入冰冷却过的上述Tris-HCl缓冲液，用带有18G(Terumo社制)针头的注射器(Terumo社制)混悬。再用离心分离机Himac CP100α、转头RP50T(日立制作所社制)在4℃、30分钟、每分35000转下离心分离后，弃去上清液，向沉淀中加入适量的冰冷却过的Tris-HCl缓冲液，用带有25G(Terumo社制)针头的注射器(Terumo社制)混悬而得的物质作为MIN6细胞的膜级分。
实施例4 胰脏β细胞的可溶化膜级分的调制将实施例3的膜级分加入冰冷却过的可溶性缓冲液〔20mmol/lTris-HCl、500mmol/l氯化钾(KCl)、2mmol/l EDTA、10μg/mLleupeptin、1mmol/l PMSF、1w/v％洋地黄皂苷(digitonin)、pH7.4〕6ml进行混悬。用匀浆器均化后，直接在冰上放置30分钟。然后用离心分离机Himac CP100α(日立制作所社制)、转头RP50T在4℃、60分钟、每分35000转下离心分离，回收所得上清液作为可溶化膜级分。再向沉淀中加入冰冷却过的可溶性缓冲液3ml，再重复上述操作2次，将所得上清液全部混合作为可溶化膜级分。
实施例5 使用胰脏β细胞和标记化稠合嘌呤衍生物的结合实验将在细胞培养用24孔板(Corning公司制)上培养至大致汇合状态的MIN6细胞用KRH缓冲液(119mmol/l NaCl、4.74mmol/l KCl、2.54mmol/l氯化钙(CaCl2)、1.19mmol/l硫酸镁(MgSO4)、1.19mmol/l磷酸二氢钾(KH2PO4)、10mmol/l HEPES、2mmol/l葡萄糖、0.1w/v％牛血清白蛋白(BSA)、pH7.3)清洗2次后，向每个孔中添加KRH缓冲液1ml，在37℃下预温育45分钟。预温育后除去上清液，添加0.15ml的KRH缓冲液和10nmol/l的[3H]标记化合物16和被检物质使其浓度为1μmol/l，在4℃下至反应到达平衡时为止温育1小时以上后，使用KRH缓冲液清洗细胞2次。向每个孔中添加KRH缓冲液2ml，在室温下放置20分钟后，再用KRH缓冲液进行清洗，通过使用液体闪烁计数器测定各孔中残留的放射活性来求出结合量。
将不添加被检化合物条件下的[3H]标记化合物16的结合量(总结合量)和10μmol/l化合物16存在下的[3H]标记化合物16的结合量(非特异性结合量)的差作为特异性结合量。
将图1A中的结合饱和曲线表示为图1B中的斯卡查德曲线图。由图可知，使用胰脏β细胞能够检出与稠合嘌呤衍生物的特异性结合。此外，表3中由稠合嘌呤衍生物引起的[3H]标记化合物16结合阻碍作用和胰岛素分泌促进活性的测定值表示为图2中的该阻碍作用和胰岛素分泌促进作用的相关性。可知两作用的相关系数为0.679，为有统计学意义相关。
表3
实施例6 使用胰脏β细胞的膜级分和标记化稠合嘌呤衍生物的结合实验向细胞培养用24孔板(Corning公司制)中加入膜级分(150μg/ml)、[3H]标记化合物16和含有未放射标记的被检化合物的如实施例2所述的Tris-HCl缓冲液，在室温下温育1小时。再通过用采集器Filtermate 196-UniFilter 24(Packard公司制)抽滤，在UniFilter-24GF/B filter plate(Packard公司制)上回收膜级分，将该膜级分用1ml的洗涤缓冲液(10mmol/l Tris-HCl、100mmol/l NaCl、2mmol/l EDTA 0.1w/v％BSA、pH7.4)清洗4次，干燥后，以150μl/孔添加Microscinti 20(Packard公司制)，使用微板闪烁计数器Top Count(Packard公司制)测定放射活性。以不添加化合物16时的放射活性作为总结合量，以添加10μmol/l化合物16时的放射活性作为非特异性结合量，用总结合量减去非特异性结合量的差作为特异性结合量。
将图3A中的结合饱和曲线表示为图3B中的斯卡查德曲线图。由结果可知，通过使用胰脏β细胞的膜级分，可以检出与稠合嘌呤衍生物的特异性结合。此外，图4显示了由稠合嘌呤衍生物引起的[3H]标记化合物16结合阻碍作用和胰岛素分泌促进作用的相关性。可知两作用的相关系数为0.705，为有统计学意义相关。
实施例7 使用胰脏β细胞的可溶化膜级分的结合实验除了使用蛋白质浓度为500μg/ml的可溶化膜级分以外，用与上述实施例6相同的方法进行实验。此外，在调制溶解液为目标浓度时，可使用不含表面活性剂的可溶化缓冲液，稀释至溶解液中表面活性剂的浓度为0.1w/v％。因此，温育溶液的组成为0.1w/v％の洋地黄皂苷、20mmol/l Tris-HCl、500mmol/l KCl、2mmol/l EDTA、10μg/mL亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、1mmol/l PMSF、pH为7.4。
以不添加化合物16表示的化合物时的放射活性作为总结合量，以添加10μmol/l该化合物时的放射活性作为非特异性结合量，用总结合量减去非特异性结合量的差作为特异性结合量。
图5表示总结合量和非特异性结合量。由结果可知，通过使用胰脏β细胞的可溶化膜级分，可检出稠合嘌呤衍生物的特异性结合。
实施例8 胰岛素分泌量的测定MIN6细胞的培养和使用MIN6细胞的胰岛素分泌试验参照Diabetorogia，36，1139-1145(1993)中记载的方法进行。
即，在14.5mmol/l的葡萄糖存在下，化合物对胰岛素分泌活性的影响可通过测定用下述方法收集的细胞培养上清液中的胰岛素的量来评价。
将在24孔板上培养的MIN6细胞用含2mmol/l葡萄糖的缓冲液A(119mmol/l NaCl、4.74mmol/l KCl、2.54mmol/l CaCl2、1.19mmol/l MgSO4、1.19mmol/l KH2PO4、10mmol/l 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、0.1％BSA、pH7.3)清洗2次后，在1ml的含2mmol/l葡萄糖的缓冲液A中，在37℃温育45分钟后，将培养上清液与各种浓度的试验化合物和含8.4mmol/l葡萄糖的缓冲液A(1ml)交换，再在37℃温育45分钟，收集培养上清液。
从培养上清液中分泌出的抗体反应性胰岛素用含有1％BSA、0.1％Tween20、0.12％EDTA·2Na、0.1％迭氮化钠的磷酸缓冲液稀释后，用放射免疫分析法〔Methods in Investigative and DiagnosticEndocrinology，Vol.2A，2B，North-Holland Publishing Co.，Amsterdam(1973)〕定量。以人胰岛素为标准品做出标准曲线，可以由该曲线算出各自的胰岛素的含量。
实施例9 以微生物的培养液为探索源的具有抗糖尿病作用物质的探索方法。
依据实施例6的方法，可以使用胰脏β细胞膜级分，从微生物的培养液中选择出具有抗糖尿病作用的物质。
采用平板稀释法将从土壤中分离出来的微生物在装有由0.5％葡萄糖、3.0％可溶性淀粉、2.0％大豆粉、0.5％酵母提取物、0.5％玉米浆、0.3％碳酸钙(CaCO3)(蒸煮前pH7.2)组成的培养基的试管中，在28℃、搅拌机上培养4天。培养结束后，添加与培养液同量的二甲基亚砜进行充分搅拌，用离心分离机将固体成分和上清液分离。向2μl上清液中添加如实施例6所述的胰脏β细胞的膜级分0.15ml和含有10nmol/l的[3H]标记化合物16的溶液，在室温下温育1小时。同时制作含有添加50％二甲基亚砜代替培养上清液的胰脏β细胞膜级分0.15ml和含有10nmol/l的[3H]标记化合物16的溶液以及制作了再向其中添加10μomol/l非标记化合物16的溶液，进行同样的温育。
温育结束后，以实施例6记载的方法回收、洗涤膜级分，测定膜中残留的放射活性。以添加非标记化合物16时得到的放射活性作为非特异性结合量，以不添加化合物16时的放射活性作为总结合量，以实施例6记载的方法计算各自的特异性结合量。采用计算出的结合量，由下式求出各自的培养上清液的结合阻碍率。
结合阻碍率(％)＝(50％二甲基亚砜存在下的特异性结合量-培养上清液存在下的特异性结合量)/50％二甲基亚砜存在下的特异性结合量×100实施例10 用化合物库作为探索源的具有抗糖尿病作用的物质的探索方法按实施例5记载的方法，探索以对胰脏β细胞和[3H]标记化合物16的结合的阻碍作用为指标的具有抗糖尿病作用的物质。将被检物质溶解在二甲基亚砜中，添加至最终浓度为1μmol/l。以添加非标记化合物16时得到的放射活性作为非特异性结合量，以不添加化合物16时的放射活性作为总结合量，按实施例6记载的方法计算各自的特异性结合量，用下式求出结合阻碍率。
结合阻碍率(％)＝(50％二甲基亚砜存在下的特异性结合量-培养上清液存在下的特异性结合量)/50％二甲基亚砜存在下的特异性结合量×100探索了7000种化合物的结果，显示可以选择在10μmol/l浓度下有84％的阻碍率的具有如下式(VII)所表示的结构的化合物。
具有式(VII)所表示的结构的化合物(用表4的化合物编号193表示的化合物。以下称为化合物193)的胰岛素分泌促进作用可根据实施例8记载的方法进行测定。其结果显示，以化合物16引起的分泌促进量为100％时，该化合物的胰岛素分泌促进量为195％(表4)。
此外，当化合物193的类似物——下述表4的化合物编号194～199表示的化合物为10μmol/l的浓度时，化合物编号200表示的化合物为1μmol/l的浓度时，确认有胰岛素分泌促进活性(表4)。
表4
综上所述，本发明的探索方法显示有用性。
上述化合物除了可以从ChemBrige公司购入外，也可参照WO01/47921中记载的方法和公知的一般合成方法进行合成。
实施例11 稠合嘌呤衍生物固定化颗粒的制备作为稠合嘌呤衍生物，选择上述表1中化合物155表示的化合物用于实验。
离心分离(1000rpm，1分钟，室温)1ml的NHS活化琼脂糖凝胶颗粒混悬液(Amersham Pharmacia Bio-tech公司制)，向除去上清液的小球加入5ml的THF使颗粒分散后，离心分离颗粒除去上清液。将此操作反复进行3次。
在置换溶剂为THF的500μl的NHS活化琼脂糖凝胶颗粒的小球上加入化合物196的溶液，使NHS活化琼脂糖凝胶颗粒分散。此时的溶剂为THF，体积为500μl，化合物155的浓度为6mmol/l。一边不时搅拌一边使其在室温下反应过夜，反应结束后，离心分离(1000rpm，1分钟，室温)颗粒，除去上清液。
为除去未反应的化合物155，加入5ml的THF使颗粒分散后，离心分离颗粒(1000rpm，1分钟，室温)除去上清液，将此操作反复进行3次。为使没有反应的颗粒状反应点失活，加入5ml含有200mmol/l单乙醇胺的THF溶液使颗粒分散，静置10分钟。反应结束后，通过离心分离(1000rpm，1分钟，室温)除去上清液。为除去未反应的单乙醇胺，加入5ml的THF使颗粒分散后，离心分离(1000rpm，1分钟，室温)颗粒除去上清液。将此操作反复进行3次。
将由此所得化合物155固定化颗粒分散到THF中至浓度为500μl颗粒/ml后，在遮光条件、4℃下保存。
实施例12 细胞提取液的调制小鼠胰脏β细胞MIN6的培养为在425ml的Dulbecco改良Eagle培养基(日水制药社制)中加入FBS 75ml、7.5％碳酸氢钠(NaHCO3)8.5ml、200mmol/l的L-谷氨酰胺5ml、青霉素(Penicillin)-链霉素(Streptomycin)(分别为10000单位/ml和10mg/ml的混合液)2.5ml的培养基中使用培养皿，在37℃的温育中静置培养。
MIN6汇合后，用37℃的PBS清洗细胞2次，用4℃的缓冲液A[20mmol/l HEPES，pH7.4，2mmol/l EDTA，1mmol/l PMSF，1μg/ml抑肽酶]剥离细胞。在4℃下用旋转机平稳搅拌30分钟。然后通过离心分离(12000rpm，5分钟，4℃)使不溶性级分沉淀，以上清液作为可溶级分。将小球在缓冲液B[20mmol/l HEPES，pH7.4，2mmol/l EDTA，150mmol/l NaCl，1％洋地黄皂苷，1mmol/l PMSF，1μg/ml抑肽酶]中混悬，在4℃下用旋转机平稳搅拌30分钟。然后通过离心分离(12000rpm，5分钟，4℃)使不溶性级分沉淀，以上清液作为可溶化膜级分。用该方法得到了蛋白质浓度约3mg/ml的可溶级分和可溶化级分。将可溶级分和可溶化级分在-80℃下保存。
实施例13 稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的获得将实施例12制备的MIN6的可溶化膜级分用缓冲液B稀释10倍的溶液1ml加入500μmol/l的化合物编号16表示的化合物(以下称为化合物16)，在4℃下平稳搅拌2小时。作为对照将不加入化合物16的MIN6的可溶化膜级分用缓冲液C〔20mmol/l HEPES(pH7.4)、2mmol/l EDTA、150mmol/l NaCl、1％洋地黄皂苷、1mmol/l PMSF、1μg/ml抑肽酶〕稀释10倍的溶液1ml在4℃下平稳搅拌2小时。然后在加入化合物16的可溶化膜级分和不加入被检物质的可溶性膜级分溶液中加入固定了实施例8制作的化合物编号155表示的化合物的颗粒(以下称化合物155固定化颗粒)，在4℃下平稳搅拌30分钟。然后通过离心分离(12000rpm，1分钟，4℃)使颗粒沉淀除去上清液。然后加入750μl缓冲液C，搅拌3秒钟，通过离心分离(12000rpm，1分钟，4℃)使颗粒沉淀除去上清液。然后再加入750μl缓冲液D[20mmol/l HEPES(pH7.4)、2mmol/l EDTA]，搅拌3秒钟，通过离心分离(12000rpm，1分钟，4℃)使颗粒沉淀除去上清液。然后加入含β-巯基乙醇的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液30μl，进行与化合物155固定化颗粒结合的蛋白质的洗脱，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过由加入化合物16的细胞提取液中的化合物155固定化颗粒来精制，发现了化合物16表示的化合物引起的对化合物155固定化颗粒的特异性结合受阻的p31蛋白质。
使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳从凝胶中切出已分离的p31蛋白质，在25mmol/l Tris-盐酸缓冲液(pH8.5)中，与0.3μg的赖氨酰肽链内切酶(和光纯药社制)一起在37℃下反应13个小时。回收由赖氨酰肽链内切酶消化得到的含有肽片段的反应上清液。用反相HPLC分离肽。柱子使用Magic C18(0.2mm I.D.×5cm、MichromBioResources公司制)，通过使乙腈浓度从5％直线上升到60％的梯度来洗脱肽。分离出的肽分取于试管中，用气相蛋白序列分析仪Procise492cLC(Applied Biosystems公司制)确定氨基酸序列。序列号11表示确定的氨基酸序列。
将含有赖氨酰肽链内切酶消化后的p31蛋白质的凝胶片再放在100mmol/l Tris-盐酸缓冲液(pH8.8)中，与0.3μg的胰蛋白酶(序列级，Roche Diagnostics公司制)一起在37℃下反应13个小时。胰蛋白酶消化后得到的肽片段与上述相同的方法用反相HPLC分离，确定其氨基酸序列。序列号12表示确定的氨基酸序列。
序列号11和12表示的氨基酸序列，对PIR蛋白质数据库实施同源性检索的结果，确定由来自序列号2表示的小鼠NADPH依赖性视黄醇脱氢酶/还原酶的氨基酸序列的N末端起第199个氨基酸残基到第209个氨基酸残基构成的序列与N末端起第34个氨基酸残基到第40个氨基酸残基构成的序列一致。
实施例14 p31蛋白质的调制[1]从小鼠胰脏β细胞株(MIN6)中制备p31 cDNA克隆化和His-p31蛋白质表达质粒。
以对从小鼠胰脏β细胞株(MIN6)中提取出的总RNA为模板，将寡dT为引物合成单链cDNA。以该单链cDNA作为模板，采用聚合酶链反应(polymerase chain reactionPCR)法调制编码全长p31蛋白质的基因部分，通过重组由NOVAGEN公司购买的大肠杆菌表达载体pET-14b，构建在N末端添加了His标记的His-p31蛋白质表达质粒。以下详细说明。
用MIN6细胞，根据常规方法[Biochemistry，18，5294(1977)]从提取的总RNA1μg中，使用单链cDNA合成试剂盒SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(GIBCO BRL公司制)，以寡dT作为引物合成单链cDNA。将上述得到的单链cDNA的0.4％作为PCR的模板使用。
作为PCR用的引物组，使用GENSET公司合成的由序列号7和8表示的碱基序列构成的合成DNA。
设计在由序列号7表示的碱基序列构成的DNA中导入NdeI位点，在由序列号8表示的碱基序列构成的合成DNA中导入BamHI位点。
PCR使用Pyrobest DNA聚合酶(宝酒造社制)进行。反应液参照该聚合酶的使用说明书进行调制，使用GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems)，在95℃下温育5分钟后，进行94℃下30秒，65℃下1分钟和72℃下2分钟的反应30次循环后，再在72℃、7分钟温育进行反应。反应结束后，使用DNA精制试剂盒Prep-A-GeneDNA Purification Systems(BIO-RAD公司制)精制DNA。
将上述DNA溶解在10μl的NEB2缓冲液(New England Biolab公司制)中，加入10个单位的NdeI和10个单位的PstI，在37℃下进行2小时的消化反应。将该反应液进行琼脂糖凝胶电泳后，回收约0.8kb的DNA片段。
将pET-14b 1μg溶解在20μl的NEB2缓冲液中，加入20个单位的NdeI和20个单位的PstI，在37℃下进行2小时的消化反应。将该反应液进行琼脂糖凝胶电泳后，回收约3.4kb的DNA片段。
将pET-14b 1μg溶解在20μl的NEB2缓冲液中，加入20个单位的PstI和20个单位的BamHI，在37℃下进行2小时的消化反应。将该反应液进行琼脂糖凝胶电泳后，回收约1.3kb的DNA片段。
将上述所得的来自用PCR扩增的DNA的NdeI-BamHI片段(0.8kb)0.1μg，来自pET-14b的NdeI-PstI片段(3.4kb)0.03μg和PstI-BamHI片段(1.3kb)0.05μg溶解在10μl的T4 DNA连接酶缓冲液中，加入400个单位的T4 DNA连接酶，在16℃下进行16小时的结合反应。
用该反应液将大肠杆菌BL21株(Stratagene公司制)用Cohen等人的方法进行转化，得到转化体。参照公知的方法分离该转化体保有的质粒，通过限制酶消化来确定其结构。将该质粒命名为pET-14b-p31。
将上述获得的质粒pET-14b-p31的碱基序列用AppliedBiosystems公司制的碱基序列确定试剂盒(BigDye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0)来确定。
其结果表明，本实施例中被克隆的基因编码序列号2表示的260氨基酸构成的蛋白质，该氨基酸序列与GenBank Accession No.AB045132.1中记载的来自小鼠的蛋白质的氨基酸序列一致。
用大肠杆菌对His-p31蛋白质的表达上述[1]中获得的质粒pET-14b-p31在大肠杆菌BL21株中用Cohen等人的方法进行转化，获得转化株BL21/pET-14b-p31。将BL21/pET-14b-p31在装有5ml的含有氨苄青霉素的L-肉汤〔10g/l细菌胰蛋白胨(DIFCO公司制)、5g/l酵母提取物(DIFCO公司制)、5g/lNaCl、75μg/ml氨苄青霉素〕的15ml容积的试管中，在37℃下振荡培养8小时(220rpm)。然后，在加入50ml含有氨苄青霉素的L-肉汤的300ml容积的带挡板的三角烧瓶中添加2.5ml上述培养液，在37℃下振荡培养(220rpm)至OD(590nm)达到1.0为止，在4℃下保存。然后，在加入500ml含有氨苄青霉素的L-肉汤的2个2升容积的三角烧瓶中分别添加20ml上述培养液，在37℃下通气搅拌培养(220rpm)至OD(590nm)达到0.9的时刻，添加表达诱导剂IPTG(异丙基-□-D-硫代半乳糖苷)至浓度为0.2mmol/l，诱导His-p31蛋白质的表达。表达诱导后4小时结束培养，离心分离培养液，获得约6.6g(湿重)的菌体。
小鼠His-p31的调制从实施例5得到的培养基中的小鼠His-p31精制全部都在0～4℃的条件下，按以下方法进行。
将上述[2]得到的培养菌体6.6g(湿重)在20ml匀浆液(20mmol/l磷酸钠缓冲液，500mmol/l NaCl，5mmol/l咪唑，10mmol/l二硫苏糖醇，pH7.4)中悬浮后，用超声波粉碎机(家田贸易社制，Vibra-Cell，振幅水平70)在5秒钟，破碎大肠杆菌10次左右，将破碎液在9000rpm下离心分离15分钟，用滤膜过滤上清液(Millipore公司制；Millex-GV；0.22μm)，在下述条件下用金属螯合物亲和层析法精制滤液。
金属螯合物亲和层析条件柱子以24ml/小时的流速在20分钟流过200mmol/l硫酸锌水溶液后，再以6ml/小时的流速2小时流过，使锌配位的ChelatingSepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech公司制，10×100mm)洗脱液A液(20mmol/l磷酸钠缓冲液，500mmol/l NaCl，5mmol/l咪唑，pH7.4)1000ml、B液(20mmol/l磷酸钠缓冲液，500mmol/l NaCl，500mmol/l咪唑，pH7.4)1000ml。
流速6ml/小时洗脱从A液到B液的直线浓度梯度洗脱洗脱液分成每级分1.3ml，各级分用巯基乙醇还原下的SDS-聚丙烯酰胺电泳分析，收集含有分子量31kDa附近的小鼠His-p31谱带的级分，作为锌螯合层析小鼠His-p31级分。
脱盐处理锌螯合层析小鼠p31级分，脱盐处理按如下条件进行。
柱子PD-10(Amersham Pharmacia Biotech公司制)洗脱液400mmol/l磷酸钾缓冲液，pH7.4洗脱液分成每级分0.5ml，各级分用巯基乙醇还原下的SDS-聚丙烯酰胺电泳分析，收集含有分子量31kDa附近的小鼠His-p31谱带的级分，作为PD-10小鼠His-p31级分。获得的His-p31的SDS-PAGE解析结果如图6所示。
小鼠His-p31的结构确认用上述[3]得到的小鼠His-p31蛋白质解析通过凝血酶消化除去N末端的组氨酸标记物后的N末端氨基酸序列。即对约10μg的His-p31添加100mU的生物素修饰凝血酶(biotinylated human thrombin；Novagen公司制)，在反应液(20mmol/l Tris-HCl缓冲液，pH8.4，1.5mol/l NaCl，2.5mmol/l CaCl2)中，20℃、反应15小时。将反应液在2-巯基乙醇还原下进行SDS-PAGE后，参照J.Biol.Chem.，262，10035-10038(1987)中记载的方法，向PVDF膜(proBlott；Applied Biosystems公司制)进行电转印。将转印的膜用考马斯蓝染色，切出分子量约31kDa的带，通过气相蛋白序列分析仪(PPSQ-10；岛津制作所制)用厂家推荐的方法解析N末端氨基酸序列。所得氨基酸序列正如序列号9表示的那样，与从基因序列推定出的序列号2记载的氨基酸序列的从N末端起的第1个残基开始的序列一致。确认序列号9表示的氨基酸序列中N末端起的第1个残基到第3个残基与来自pET-14b的载体的氨基酸序列一致，第4个残基以后的序列与来自小鼠p31的氨基酸序列一致。
实施例15 使用p31蛋白质的结合实验使用在实施例14精制而成的His-p31按如下方式进行结合实验。
将传感器芯片CM5(BIAcore公司制)装在BIAcore2000(BIAcore公司制)上，使用HBS-EP缓冲液(100mmol/l HEPES，5mmol/l NaCl，500mmol/l EDTA，0.005％聚山梨糖醇酯20v/v，pH7.4，0.22μm滤膜过滤)，并参照操作手册，将该传感器芯片在10℃下平衡化。
混合配基固定化用EDC试剂(N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，BIAcore公司制)和NHS试剂(N-羟基琥珀酰亚胺；BIAcore公司制)各50μl，将70μl以10μl/分的流速流入到传感器芯片上使芯片表面活化。在固定化用缓冲液(20mmol/l碳酸钠缓冲液，pH8.5)中溶解上述表1中的化合物编号155表示的化合物至100μl/ml。以10μl/分的流速注入到传感器芯片上，固定至约50RU。
然后以10μl/分的流速注入70μl的1mol/l的乙醇胺，使传感器芯片上未反应的羧基反应后，用10μl的100mol/l盐酸清洗2次。
将在HBS-EP缓冲液中溶解实施例12精制而成的小鼠His-p31至100nmol/l的溶液作为His-p31溶液，将向His-p31溶液中加入各被检物质溶液至被检物质浓度为500μmol/l的溶液作为His-p31/被检物质溶液，用于结合实验。此外，将上述表1中的化合物编号16、17、36、38、103或144表示的化合物分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)中至50mmol/l浓度的溶液，和表1中的化合物编号94或183表示的化合物分别溶解于DMSO中至10mmol/l浓度的溶液作为被检物质溶液使用。
使被检物质以20μl/分的流速用300秒流入传感器芯片，流入结束15秒后测定结合量(RU)。传感器芯片表面各120秒分别流入2mmol/l-盐酸胍(guanidine-HCl)和10mmol/l甘氨酸-盐酸(Glycine-HCl)而再生。
以p31溶液流入前的结合量(RU)为100％，以流入代替被检物质添加了DMSO的His-p31溶液时的结合量(RU)为0％，由流入His-p31/被检物质溶液时的结合量(RU)来换算因各被检物质引起的与固定化化合物155的结合阻碍率(％)。
各被检物质的His-p31和固定化合物155表示的化合物的结合阻碍率(％)与用试验例1记载的方法测定的各被检物质的胰岛素分泌促进活性的相关性如图7所示。可知被检物质的His-p31和固定化合物编号155表示的化合物间的结合阻碍率(％)与该物质的胰岛素分泌促进活性的相关系数为0.78，有统计学意义相关。
此外，上述被检物质参照WO00/01388、WO01/47931中记载的方法合成。
实施例16 使用细胞提取液和固定了化合物编号155表示的化合物的颗粒的胰岛素分泌促进活性的探索将实施例12制备的MIN6的可溶化膜级分用缓冲液B稀释10倍的溶液1ml加入500μmol/l的被检物质(化合物编号16或17表示的化合物)，在4℃下平稳搅拌2小时。作为对照将不加入被检物质的MIN6的可溶化膜级分用缓冲液C〔20mmol/l HEPES(pH7.4)、2mmol/lEDTA、150mmol/l NaCl、1％洋地黄皂苷、1mmol/l PMSF、1μg/ml抑肽酶〕稀释10倍的溶液1ml在4℃下平稳搅拌2小时。然后在加入被检物质的可溶化膜级分和不加入被检物质的可溶化膜级分溶液中加入固定了实施例8制作的化合物编号155表示的化合物的颗粒(以下称化合物155固定化颗粒)，在4℃下平稳搅拌30分钟。然后通过离心分离(12000rpm，1分钟，4℃)使颗粒沉淀除去上清液。然后加入750μl缓冲液C，搅拌3秒钟，通过离心分离(12000rpm，1分钟，4℃)使颗粒沉淀除去上清液。然后再加入750μl缓冲液D[20mmol/l HEPES(pH7.4)、2mmol/l EDTA]，搅拌3秒钟，通过离心分离(12000rpm，1分钟，4℃)使颗粒沉淀除去上清液。然后加入含β-巯基乙醇的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液30μl，进行与化合物155固定化颗粒结合的蛋白质的洗脱，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果如图8所示。
由不加入被检化合物的对照实验中能够确认有p31蛋白质的谱带而加入被检物质化合物16的实验中不能确认有p31蛋白质的谱带表明，化合物16阻碍化合物155固定化颗�：蚿31蛋白质的结合。另一方面，在使用化合物17作为被检物质的实验中，可确认有p31蛋白质的谱带表明，化合物17不能阻碍化合物155固定化颗�：蚿31蛋白质的结合。
实施例17 使用His-p31蛋白质的胰岛素促泌剂的探索(1)使用96孔板的结合竞争实验向96孔ELISA板的各孔中添加含有10μg实施例12调制的His-p31蛋白质的PBS溶液100μl，在4℃放置过夜而吸附，向各孔中添加300μl的1％的BSA/PBS，在4℃放置1小时而封闭。
用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate，FITC)标记的化合物编号155表示的化合物(以下称FITC标记化合物155)可通过市售的NHS-荧光素和上述表1中的化合物155表示的化合物在DMSO、室温下混合3小时调制而成。
可以通过在100μmol/l的被检物质存在下或不存在下、使5μmol/l的FITC标记化合物155 100μl接触上述His-p31蛋白质、除去上清液后、用含0.05％Tween20的PBS清洗、用荧光板读数计测定残存的FITC标记化合物155，选择对稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的结合有阻碍作用的物质。
该物质的胰岛素分泌促进活性可通过上述实施例8的方法来确认。
实施例18 使用His-p31蛋白质的胰岛素促泌剂的探索(2)使用螯合琼脂糖凝胶珠的结合竞争实验。
使表达实施例14调制的His-p31蛋白质的基因重组大肠杆菌的培养物的破碎物上清液400μl和Zn2+离子螯合琼脂糖凝胶10μl混合，结合该蛋白质后，用PBS清洗，做成亲和性小珠。该亲和性小珠在500μmol/l的被检物质存在下或不存在下、与含有1μmol/l的FITC标记化合物155的溶液1ml混合，除去上清液。洗净该亲和性小珠后，用1％SDS水溶液100μl提取残存的FITC标记化合物155，通过用分光荧光光度计测定提取液的荧光强度，可以选择对稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物结合蛋白质的结合有阻碍的物质。
该物质的胰岛素分泌促进活性可通过上述实施例8的方法来确认。
实施例19 使用His-p31蛋白质的胰岛素促泌剂的探索(3)酶活性阻碍实验将实施例12调制的His-p31蛋白质1μg/ml加入到含有250μmol/l对氯苯甲醛的10mmol/l Tris-HCl、100mmol/l NaCl、2mmol/l EDTA(pH7.4)溶液1ml中至NADPH的浓度为5μmol/l，在37℃下温育，在被物质存在下和不存在下，用在340nm的吸光度检出伴随对氯苯甲醛分解的NADPH的减少。
测定使用化合物编号16或17表示的物质作为被检物质时的His-p31蛋白质的酶活性阻碍的结果，化合物编号16表示的化合物比化合物编号17表示的化合物更强地阻碍该蛋白质的活性。
实施例20 使用His-p31蛋白质的胰岛素促泌剂的探索(4)
酶活性阻碍实验将实施例12中调制的His-p31蛋白质1μg/ml加入到含有250μmol/l对氯苯甲醛的10mmol/l Tris-HCl、100mmol/l NaCl、2mmol/l EDTA(pH7.4)溶液150μl中至NADPH的浓度为5μmol/l，在37℃下温育5分钟。向该反应溶液中加入由0.2mol/l氰化钾(KCN)、0.06mol/l氢氧化钾(KOH)、1mol/l Bathophenanthrolinedisulfonic acid组成的溶液150μl，在室温下放置5分钟。再加入氯仿800μl混合后，在4℃、150000rpm下离心分离5分钟。将上清液用0.2mol/l醋酸铵(pH6.0)稀释4倍后，向HPLC中注入250μl。可以通过在被检物质存在下和不存在下，用荧光检测仪(330/460nm)检出伴随由p31引起的底物分解的NADPH的减少〔AnalyticalBiochemistry，228，312(1995)〕，选择因被检物质而阻碍His-p31的活性的物质。
所选物质的胰岛素分泌促进活性可通过上述实施例8的方法来确认。
实施例21 使用His-p31蛋白质的胰岛素促泌剂的探索(5)酶活性阻碍实验将实施例12调制的His-p31蛋白质做成浓度为0.1μg/ml的溶液A〔1％牛血清白蛋白、20％甘油、含1％CHAPS的20mmol/lHEPES-NaOH、50mmol/l KCl、3mmol/l MgCl2(pH7.5)〕和溶液B〔40μmol/l全反式视黄醛、25μmol/l NADPH、0.1％牛血清白蛋白、2％甘油、含0.1％CHAPS的40mmol/l HEPES·NaOH、100mmol/l KCl、6mmol/lMgCl2(pH7.5)〕。可以通过混合0.2ml溶液A和0.2ml溶液B，在32℃下温育10分钟，在被物质存在下和不存在下，在340nm的吸光度下检出伴随视黄醛分解的NADPH的减少[Biochimica et BiophysicaActa，1338，47(1997)]，选择因被检物质而阻碍His-p31蛋白质的NADPH氧化活性的物质。
所选物质的胰岛素分泌促进活性可通过上述实施例8的方法来确认。
工业实用性本发明提供一种使用稠合嘌呤衍生物的、不引起低血糖等的并发症的糖尿病治疗药和胰岛素促泌剂的探索方法。
序列表<110>协和发酵工业株式会社<120>具有抗糖尿病作用的物质的探索方法<130>11486WO1<140>
<141>
<150>JP 2002-143599<151>2002-5-17<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>260<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Ala Ser Ser Gly Met Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val1 5 10 15Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg20 25 30Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45Gln Asn Val Asp Gln Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser50 55 60Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg65 70 75 80Leu Val Ala Thr Ala Val Lys Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val85 90 95Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Ser Ile Met Asp Val Thr100 105 110
Glu Glu Val Trp Asp Lys Thr Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Pro Ala115 120 125Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140Ser Val Val Ile Val Ser Ser Ile Ala Ala Phe Ser Pro Ser Pro Gly145 150 155 160Phe Ser Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys165 170 175Thr Leu Ala Ile Glu Leu Ala Pro Arg Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu180 185 190Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Arg Met Leu Trp Met Asp195 200 205Lys Glu Lys Glu Glu Ser Met Lys Glu Thr Leu Arg Ile Arg Arg Leu210 215 220Gly Glu Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu225 230 235 240Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr245 250 255Pro Ser Arg Leu260<210>2<211>260<212>PRT<213>Mus musculus<400>2Met Ala Ser Ser Gly Leu Thr Arg Arg Asn Pro Leu Ser Asn Lys Val1 5 10 15Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg20 25 30
Arg Leu Ala Glu Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser50 55 60Val Thr Gly Ile Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Lys65 70 75 80Leu Ile Thr Thr Ala Leu Lys Arg His Gln Gly Ile Asp Ile Leu Val85 90 95Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Asn Leu Met Asp Val Thr100 105 110Glu Glu Val Trp Asp Lys Val Leu Ser Ile Asn Val Thr Ala Thr Ala115 120 125Met Met Ile Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140Ser Val Val Ile Val Gly Ser Val Ala Gly Phe Thr Arg Phe Pro Ser145 150 155 160Leu Gly Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys165 170 175Asn Phe Ala Ala Glu Leu Ala Pro Lys Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu180 185 190Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Arg Phe Ser Ser Val Leu Trp Glu Glu195 200 205Lys Ala Arg Glu Asp Phe Ile Lys Glu Ala Met Gln Ile Arg Arg Leu210 215 220Gly Lys Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu225 230 235 240Asp Ala Ser Tyr Ile Asn Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr245 250 255Pro Ser Arg Leu260
<210>3<211>260<212>PRT<213>Oryctolagus cuniculus<400>3Met Ala Ser Ser Gly Val Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val1 5 10 15Ala Ile Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Arg20 25 30Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Ile Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Ala Leu Gln Ala Glu Gly Leu Ser50 55 60Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg65 70 75 80Leu Val Ala Thr Ala Leu Asn Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val85 90 95Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Lys Leu Met Asp Val Thr100 105 110Glu Glu Val Trp Asp Lys Ile Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Met Ala115 120 125Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140Ser Val Val Ile Val Ala Ser Ile Ala Ala Phe Asn Pro Phe Ser Gly145 150 155 160Leu Gly Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Val Gly Leu Thr Lys165 170 175Asn Leu Ala Leu Glu Leu Ala Ala Gln Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu180 185 190
Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Lys Ala Leu Trp Glu Asp195 200 205Lys Ala Gln Glu Glu Asn Ile Ile Gln Lys Leu Arg Ile Arg Arg Leu210 215 220Gly Lys Pro Glu Glu Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu225 230 235 240Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Ala Gly Gly Ala245 250 255Pro Ser Arg Leu260<210>4<211>780<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4atg gcc agc tcc ggg atg acc cgc cgg gac ccg ctc gca aat aag gtg 48Met Ala Ser Ser Gly Met Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val1 5 10 15gcc ctg gta acg gcc tcc acc gac ggg atc ggc ttc gcc atc gcc cgg 96Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg20 25 30cgt ttg gcc cag gac ggg gcc cat gtg gtc gtc agc agc cgg aag cag 144Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45cag aat gtg gac cag gcg gtg gcc acg ctg cag ggg gag ggg ctg agc 192Gln Asn Val Asp Gln Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser50 55 60gtg acg ggc acc gtg tgc cat gtg ggg aag gcg gag gac cgg gag cgg 240Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg65 70 75 80ctg gtg gcc acg gct gtg aag ctt cat gga ggt atc gat atc cta gtc 288Leu Val Ala Thr Ala Val Lys Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val
85 90 95tcc aat gct gct gtc aac cct ttc ttt gga agc ata atg gat gtc act 336Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Ser Ile Met Asp Val Thr100 105 110gag gag gtg tgg gac aag act ctg gac att aat gtg aag gcc cca gcc 384Glu Glu Val Trp Asp Lys Thr Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Pro Ala115 120 125ctg atg aca aag gca gtg gtg cca gaa atg gag aaa cga gga ggc ggc 432Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140tca gtg gtg atc gtg tct tcc ata gca gcc ttc agt cca tct cct ggc 480Ser Val Val Ile Val Ser Ser Ile Ala Ala Phe Ser Pro Ser Pro Gly145 150 155 160ttc agt cct tac aat gtc agt aaa aca gcc ttg ctg ggc ctg acc aag 528Phe Ser Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys165 170 175acc ctg gcc ata gag ctg gcc cca agg aac att agg gtg aac tgc cta 576Thr Leu Ala Ile Glu Leu Ala Pro Arg Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu180 185 190gca cct gga ctt atc aag act agc ttc agc agg atg ctc tgg atg gac 624Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Arg Met Leu Trp Met Asp195 200 205aag gaa aaa gag gaa agc atg aaa gaa acc ctg cgg ata aga agg tta 672Lys Glu Lys Glu Glu Ser Met Lys Glu Thr Leu Arg Ile Arg Arg Leu210 215 220ggc gag cca gag gat tgt gct ggc atc gtg tct ttc ctg tgc tct gaa 720Gly Glu Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu225 230 235 240gat gcc agc tac atc act ggg gaa aca gtg gtg gtg ggt gga gga acc 768Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr245 250 255ccg tcc cgc ctcPro Ser Arg Leu
260<210>5<211>780<212>DNA<213>Mus musculus<400>5atg gcc agt tcc ggg ttg act cgt cga aac cct ctc tcc aat aag gtg 48Met Ala Ser Ser Gly Leu Thr Arg Arg Asn Pro Leu Ser Asn Lys Val1 5 10 15gcc ctg gtc aca gcc tcc acc gac ggg atc ggc ttt gcc atc gcc cgg 96Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg20 25 30cgc ctg gct gaa gat ggg gcc cac gtg gtc gtc agc agc cgc aaa cag 144Arg Leu Ala Glu Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45cag aat gtg gac cgt gca gtg gcc aca cta cag gga gag ggc ctg agt 192Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser50 55 60gtg act ggc atc gtg tgc cac gtg ggg aag gca gag gat cga gaa aag 240Val Thr Gly Ile Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Lys65 70 75 80ctg ata acc acg gct ctg aag cgt cac cag ggg att gat atc ctg gtc 288Leu Ile Thr Thr Ala Leu Lys Arg His Gln Gly Ile Asp Ile Leu Val85 90 95tcc aat gct gct gtc aac cct ttc ttt gga aat cta atg gat gtc aca 336Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Asn Leu Met Asp Val Thr100 105 110gag gag gtg tgg gac aag gtt ttg agc att aat gtg aca gct aca gcc 384Glu Glu Val Trp Asp Lys Val Leu Ser Ile Asn Val Thr Ala Thr Ala115 120 125atg atg att aaa gcg gtg gtg cca gag atg gaa aag cga gga ggc ggc 432Met Met Ile Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140
tca gtg gtg att gtg ggt tct gta gca ggc ttc act cgg ttc cct tct 480Ser Val Val Ile Val Gly Ser Val Ala Gly Phe Thr Arg Phe Pro Ser145 150 155 160ctg ggt cct tac aat gtt agc aaa aca gct ttg ctg ggt ctt act aag 528Leu Gly Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys165 170 175aac ttt gca gcg gag ttg gcc ccg aag aac att cga gtg aac tgc tta 576Asn Phe Ala Ala Glu Leu Ala Pro Lys Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu180 185 190gca cct gga ctc atc aag act cga ttc agc agt gtg ttg tgg gag gag 624Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Arg Phe Ser Ser Val Leu Trp Glu Glu195 200 205aaa gca aga gag gac ttc ata aaa gaa gcc atg caa atc aga agg cta 672Lys Ala Arg Glu Asp Phe Ile Lys Glu Ala Met Gln Ile Arg Arg Leu210 215 220ggc aag cca gag gat tgt gct ggc ata gtt tcc ttc tta tgc tct gaa 720Gly Lys Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu225 230 235 240gac gcc agt tac atc aat gga gag acc gta gta gtg ggg gga gga acc 768Asp Ala Ser Tyr Ile Asn Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr245 250 255cct tct cgc ctc 783Pro Ser Arg Leu260<210>6<211>780<212>DNA<213>Oryctolagus cuniculus<400>6atg gcc agc tct ggg gtg acc cgc cgg gac ccg ctc gcg aat aag gtg 48Met Ala Ser Ser Gly Val Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val1 5 10 15
gcc atc gta acg gcc tcc acc gac ggg atc ggc ttg gcc atc gcc cgg 96Ala Ile Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Arg20 25 30cgt ctg gcc cag gat ggg gcc cac gtg gtc atc agc agc cgg aag cag 144Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Ile Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45cag aac gtg gac cgg gcg gtg gct gca ctg cag gcc gag ggg ctg agt 192Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Ala Leu Gln Ala Glu Gly Leu Ser50 55 60gtg acg ggc acc gtg tgc cac gtg ggg aag gcc gag gac cgg gaa cgg 240Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg65 70 75 80ctg gtg gcc acg gcc ctg aac ctc cac gga ggc att gat atc ctg gtc 288Leu Val Ala Thr Ala Leu Asn Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val85 90 95tcc aat gct gca gtc aac ccc ttc ttt gga aag cta atg gat gtc acc 336Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Lys Leu Met Asp Val Thr100 105 110gag gag gtg tgg gac aag att ctg gac att aac gtg aag gcc atg gcc 384Glu Glu Val Trp Asp Lys Ile Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Met Ala115 120 125ctg atg aca aag gcg gtg gtg cca gag atg gag aaa cga gga ggc ggc 432Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140tcc gtg gtg atc gtg gcc tcc ata gca gcc ttc aat cca ttc agt ggc 480Ser Val Val Ile Val Ala Ser Ile Ala Ala Phe Asn Pro Phe Ser Gly145 150 155 160ctg ggc cct tat aat gtt agt aaa aca gcc ttg gtg ggc ctt acc aag 528Leu Gly Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Val Gly Leu Thr Lys165 170 175aac ctg gcc ctg gag ctg gct gcc cag aac atc cgg gtg aac tgc ctg 576Asn Leu Ala Leu Glu Leu Ala Ala Gln Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu180 185 190
gca ccg gga ctc atc aag acc agc ttc agt aag gcg ttg tgg gag gac 624Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Lys Ala Leu Trp Glu Asp195 200 205aag gca caa gag gaa aac atc ata caa aag ttg agg ata aga agg tta 672Lys Ala Gln Glu Glu Asn Ile Ile Gln Lys Leu Arg Ile Arg Arg Leu210 215 220ggc aaa cca gag gaa tgt gcg ggc atc gtg tct ttc ctg tgc tcc gaa 720Gly Lys Pro Glu Glu Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu225 230 235 240gac gcc agc tac atc act ggg gag aca gtg gtg gtg gct gga gga gca 768Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Ala Gly Gly Ala245 250 255cca tcc cgc ctcPro Ser Arg Leu260<210>7<211>32<212>DNA<213>人工合成序列<400>7ggaattccat atggccagtt ccgggttgac tc32<210>8<211>36<212>DNA<213>人工合成序列<400>8cgggatccgt cgactcagag gcgagaaggg gttcct36<210>9<211>20<212>PRT<213>Mus musculus
<400>9Gly Ser His Met Ala Ser Ser Gly Leu Thr Arg Arg Asn Pro Leu Ser1 5 10 15Asn Lys Val Ala20
权利要求
1.具有抗糖尿病作用的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质存在下，选自下述通式(I)或通式(II)表示的化合物中的化合物(以下简称稠合嘌呤衍生物)和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量的步骤；[2]测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而阻碍稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物结合的物质的步骤， 式(I)中，R1A表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族杂环基，R2A表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族杂环基，R3A表示氢原子、低级烷基或取代或非取代芳烷基，X1和X2分别独立地表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基，n表示0～3的整数， 式(II)中，X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳香族杂环基)或N＝C-W[式中，W表示卤原子、取代或非取代芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基、-NR4R5(式中，R4和R5相同或不同，表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳烷基，或者R4和R5与相邻的氮原子一起形成杂环基)、-OR6(式中，R6表示取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳烷基)、-SR6a(式中R6a与前述R6同义)、取代或非取代低级烷基或氰基]，R2表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代的芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基、卤原子、低级烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分别与前述R4和R5同义)、-CO2H、低级烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示卤原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分别与前述R4和R5同义)、或-CHO，R3表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、或低级烷氧基烷基，n表示0～3的整数，V1表示氢原子、取代或非取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代芳香族杂环基，V2表示取代低级烷基、或取代或非取代芳香族杂环基；V1表示氢原子、低级烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基、且(a)X...Y...Z表示R1aN-C＝O(式中，R1a表示在前述R1的定义中除取代低级烷基以外的基团)，R2表示取代低级烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代脂环式杂环基、卤原子、低级烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分别与前述同义)、-CO2H、低级烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示卤原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分别与前述R4和R5同义)、或-CHO，或者(b)X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1与前述同义)，R3表示低级烷氧基烷基，或者(c)X...Y...Z表示R1bN-C＝O(式中，R1b表示取代低级烷基)，或者(d)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W与前述同义)，R2表示取代或非取代低级烷基，取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族杂环基、取代或非取代脂环式杂环基、卤原子、低级烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分别与前述同义)、或-CO2H、低级烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示卤原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分别与前述同义)、或-CHO，或者(e)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W与前述同义)，R3表示低级烷基，取代或非取代芳烷基、低级烷氧基烷基时，V2也可以表示低级烷基，取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基。
2.具有抗糖尿病作用的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质存在下，权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物和与该稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质接触时，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合量的步骤；[2]测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质接触时，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而阻碍该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质结合的物质的步骤。
3.与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相结合的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质存在下，权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，该稠合嘌呤衍生物与胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量的步骤；[2]测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物接触时，该稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而阻碍稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物结合的物质的步骤；[5]利用[4]得到的物质，选择与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相结合的物质的步骤。
4.与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相结合的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质存在下，权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物和该稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质接触时，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合量的步骤；[2]测定被检物质不存在下，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质接触时，该稠合嘌呤衍生物和该蛋白质的结合量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而阻碍稠合嘌呤衍生物和该蛋白质结合的物质的步骤。
5.使与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质活性变化的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质与权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相接触时，该蛋白质的活性的步骤；[2]测定与被检物质不接触时该蛋白质的活性的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而使该蛋白质活性变化的物质的步骤。
6.抑制与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质活性的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质与权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相接触时，该蛋白质的活性的步骤；[2]测定与被检物质不接触时该蛋白质的活性的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而抑制该蛋白质活性的物质的步骤。
7.使与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质功能变化的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质和表达与权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的转化体相接触时，该转化体的细胞应答的步骤；[2]测定被检物质不存在下的该转化体的细胞应答的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而使该转化株的细胞应答发生变化的物质的步骤。
8.使编码与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质的基因的表达量变化的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质和表达与权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质的转化体相接触时，编码该转化体的该蛋白质的基因的表达量的步骤；[2]测定被检物质不存在下编码该转化体的该蛋白质的基因的表达量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而使编码该蛋白质的基因的表达量发生变化的物质的步骤。
9.使与该稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质的表达量变化的物质的探索方法，包括以下步骤[1]测定被检物质和表达与权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质的转化体相接触时，该转化体的该蛋白质的表达量的步骤；[2]测定被检物质不存在下该转化体的该蛋白质的表达量的步骤；[3]比较被检物质存在下和不存在下该测定值的步骤；[4]选择因被检物质而使该蛋白质的表达量发生变化的物质的步骤。
10.如权利要求1～9的任意一项所述的探索方法，稠合嘌呤衍生物为下述式(III)表示的化合物。
11.如权利要求2和4～9的任意一项所述的探索方法，其特征在于，使用固定了权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物的载体。
12.如权利要求11所述的探索方法，载体为琼脂糖凝胶颗粒。
13.如权利要求11或12所述的探索方法，稠合嘌呤衍生物为下述式(IV)表示的化合物。
14.固定了权利要求1所述稠合嘌呤衍生物的载体。
15.如权利要求14所述的载体，稠合嘌呤衍生物为权利要求13所述的式(IV)表示的稠合嘌呤衍生物。
16.如权利要求14或15所述的载体，载体为琼脂糖凝胶颗粒。
17.如权利要求2和4～13的任意一项所述的探索方法，与权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质为选自下述[i]～[iii]中的任意一种蛋白质[i]具有用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列的蛋白质；[ii]在用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列中，由1个以上的氨基酸被缺失、置换、插入或添加而成的氨基酸序列组成，且与权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质；[iii]由具有与用序列号1～3中任一项表示的氨基酸序列60％以上相同性的氨基酸序列组成，且与权利要求1所述的稠合嘌呤衍生物相结合的蛋白质。
18.由权利要求1～13和17的任意一项所述的探索方法得到的物质或该物质的可药用盐。
19.含有以权利要求18所述的物质或该物质的可药用盐为有效成分的药物。
20.含有以权利要求18所述的物质或该物质的可药用盐为有效成分的糖尿病治疗药。
21.含有以权利要求18所述的物质或该物质的可药用盐为有效成分的胰岛素促泌剂。
22.含有用下述通式(V)表示的化合物或其可药用盐为有效成分的胰岛素促泌剂， 式(V)中，R1B、R2B、R3B相同或不同，表示氨基、单或二取代氨基、或含有N的取代或非取代杂环基，该杂环基通过N原子与三嗪环结合。
23.促进胰岛素分泌的方法，包括以权利要求22所述的通式(V)表示的化合物或其可药用盐的有效量给药的步骤。
24.权利要求22所述的通式(V)表示的化合物或其可药用盐在制造胰岛素促泌剂中的应用。
全文摘要
本发明提供一种使用稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物或与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质的，阻碍稠合嘌呤衍生物和胰脏β细胞或该细胞的处理物的结合的，阻碍稠合嘌呤衍生物和与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质相结合的，阻碍与稠合嘌呤衍生物结合的蛋白质的表达、酶活性的物质的探索方法。
文档编号G01N33/569GK1668759SQ0381664
公开日2005年9月14日 申请日期2003年5月16日 优先权日2002年5月17日
发明者石黑博树, 大岛由子, 杉本整治, 松原正浩, 上野公久, 森圣寿, 中西聪, 矢野浩史 申请人:协和发酵工业株式会社
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
