专利名称：血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种血管紧张素I (Ang I ) 磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
血管紧张素I是由肾素作用于血管紧张素原转变而来，因此可反映肾素活性。肾 素-血管紧张素-醛固酮系统对维持血压、水和电解质平衡、内环境稳定起重要作用。
血管紧张素I能刺激肾上腺髓质分泌肾上腺素，它直接收缩血管的作用不明显； 可促进肾上腺皮质分泌醛固酮，醛固酮作用于肾小管，起保钠、保水、排钾作用，从而引起血 量增多，血压升高，临床上血管紧张素I对高血压的诊断与分型，以及评估冠心病、心力衰 竭等疾病的严重程度和预后都有重要意义。
目前，测定血管紧张素I的方法有放射性免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫分析 等，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时 间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；化学发光免疫分析(CLIA)是当今最为敏感 的微量免疫测定法，本试剂盒将化学发光免疫分析和磁微粒技术结合，与以微孔板为固相 载体的Ang I化学发光试剂盒相比，具有以下优势(1)以磁微粒为固相载体，大大增加了 抗体的有效包被量，节约了抗体的用量，从而节约了成本；(2)以磁微粒为固相载体包被抗 体，增加了抗原-抗体的接触面积，及发光面积，提高了反应的灵敏度；(3)反应在液相中进 行，且利用旋转磁场使磁微粒其搅拌作用，大大缩短了反应时间；(4)在反应过程中引入了 生物素-亲和素系统(biotin-avidin system, BAS),它是70年代末发展起来的一种新型 反应放大系统，由于具有与标记试剂高亲和力的牢固结合、多级放大效应，使其具有灵敏度 高、特异性好、稳定性高的特点，目前已成为广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位 观察研究的新技术。现有国外化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系 统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断 和科研工作。尤其是还没有关于血管紧张素I磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒广泛用 于医疗领域。发明内容
本发明要解决的问题是提供Ang I的磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其 制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且 解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是血管紧张素I磁微粒化学发光 免疫定量检测试剂盒，包括=Ang I校准品，Ang I校准品的梯度农素分别为0，0. 8,2,10， 20, 50ng/mL,稀释液是50%牛血清；偶联有链霉未和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的Ang I抗体;Ang I酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶纯度RZ > 3. 0，活性彡250U/mL ；Ang I质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。
进一步，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。A 液为O. 7g/L鲁米诺，O. 165g/L对碘酹，缓冲液为pH8. 6的5mmol/L Tris · HCl，避光保存； B液为O. 675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。
进一步，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径 l-2um。
进一步，所述的Ang I质控品包括低值质控品和闻值质控品，低值质控品和闻值质控品的允许范围分别为4. 16 6. 24ng/mL和11. 6 17. 4ng/mL。
进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
试剂盒的制备方法，包括以下步骤
(I)Ang I校准品的配制
将Ang I纯品用50%牛血 清稀释成系列梯度，浓度分别为0，O. 8，2，10，20，50ng/ mL ；
(2) Ang I质控品的配制
将Ang I抗原用含有50%牛血清配制低值质控品和高值质控品，其允许范围分别为 4. 16 6. 24ng/mL 和 11. 6 17. 4ng/mL ；
(3)磁性颗粒_链霉未和素悬浮液的制备
取IOOmLO. lmol/L 2-吗啉乙磺酸溶液(MES溶液)，依次加入IOmg磁性颗�：� 3mg链酶亲和素(SA),搅拌30min,然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液(1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基，EDC) 3. 5uL，反应Ih后，使用磁力架吸附，静止lOmin，移去液体，加入IOmL O. 01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0. 01mol/L PBS定溶至IL即可。
(4)生物素标记的Ang I抗体的制备
取0. 5mg Ang I抗体，用硼酸盐缓冲液在2 8°C下透析I 3h ;将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uLlmol/L氯化铵溶液，常温避光反应30 60min ;用0. 01mol/L PBS溶液在2 8°C下透析2天，期间换液3 5次；
(5) Ang I酶结合物的制备
采用高碘酸钠氧化法将Ang I与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:8000，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2 8°C ;酶稳定剂是一种可以保持蛋白质在冻干或溶液下保持天然折叠构想的试剂，有利于抗原或抗体的保存，避免外界因素如温度、pH、盐、金属离子及其他污染物影响其稳定性。
(6) 20倍浓缩洗液的配制
20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5. 92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl, IOmL/ LTween-20 和 1%。Proclin300 ；
(7)化学发光液A液和B液的配制
A 液为 O. 7g/L 鲁米诺，0. 165g/L 对碘酚，缓冲液为 5mmol/L Tris · HCl (ρΗ8· 6)； B液为0. 675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。
(8)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C。
(9)对采用该方法制备的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
本发明的原理是，本试剂盒采用竞争法原理测定血清或血浆中的Ang I，在亲和 素-磁微粒悬浮液中加入生物素-Ang I抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形 成磁微粒-亲和素-生物素-Ang I抗体复合物，加入样本和酶结合物后，酶结合物与样本 中的Ang I竞争结合磁微粒表面的Ang I抗体，形成磁微粒-亲和素-生物素-Ang I抗 体-Ang1-Ang I抗体-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成 分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸 离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值(RLU)。样 本的发光值与样本中Ang I浓度呈负相关。样本中的Ang I浓度依据由校准品Ang I浓 度和对应的RLU建立的Log (X)-Logit (Y)数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的 Ang I含量。
本专利发明的血管紧张素I (Ang I)磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒，具有 以下优点(I)反应快速，可在40分钟内判断检测结果；操作简便，无污染。(2)灵敏度高， 本试剂盒的分析灵敏度不高于O. 05ng/mL。(3)特异性强，本产品对血管紧张素I1、血管紧张 素1-7的交叉特异性均小于O. 1%。(4)精密度良好，精密度不高于10%。(5)稳定性良好， 本产品在37°C可存放7天以上，在2 8°C可存放I年。(6)成本低，与市场上同类产品比 较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。(7)本试剂盒与管式化学发光仪配套使 用，在样本测定过程中灵活性更好。
图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定Ang I与放免试剂盒测定Ang I 的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的Ang I值，横坐标为放免试剂盒测定 Ang I值，两种方法相关系数(r) =0. 9891，直线方程y=0. 9993x+0. 00具体实施方式
mL ；
实施例1:制备血管紧张素I (Ang I )磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒I(I)Ang I校准品的配制将Ang I纯品用50%牛血清稀释成系列梯度，浓度分别为0，O. 8，2，10，20，50ng/(2)Ang I质控品的配制将Ang I抗原用含有50%牛血清配制低值质控品和高值质控品，其浓度分别为4.16ng/mL 和 17. 4ng/mL ；
(3)磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备
取IOOmLO. lmol/L 2_吗啉乙磺酸溶液(MES溶液)，依次加入IOmg磁性颗�：� 3mg链酶亲和素(SA),搅拌30min,然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液(1-乙基-(3- 二 甲基氨基丙基，EDC) 3. 5uL，反应Ih后，使用磁力架吸附，静止lOmin，移去液体，加入IOmL O. 01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0. 01mol/L PBS定溶至IL即可。
(4)生物素标记的Ang I抗体的制备
取0. 5mg Ang I抗体，用硼酸盐缓冲液在2 8°C下透析3h ;将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uLlmol/L氯化铵溶液，常温避光反应30min ;用O. 01mol/L PBS溶液在2 8°C 下透析2天，期间换液3次；
(5) Ang I酶结合物的制备
采用高碘酸钠氧化法将Ang I与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:8000，并加入5%酶稳定剂，储存于2 8°C ;酶稳定剂使用SurModics In Vitro Technologies的蛋白稳定剂产品。
(6) 20倍浓缩洗液的配制
20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5. 92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl, IOmL/ LTween-20 和 1%。Proclin300 ；
(7)化学发光液A液和B液的配制
A 液为 O. 7g/L 鲁米诺，O. 165g/L 对碘酚，缓冲液为 ρΗ8· 6 的 5mmol/L Tris · HCl， 避光保存液为O. 675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；
(8)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ；
(9)对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
说明
I)物理检查液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。
2)准确性试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行(t检验，|t|〈2.447);以Ang I企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在O. 9(Tl. 10范围内。
3)剂量-反应曲线的线性用双读数数学模型拟合，剂量-反应曲线在0_50ng/mL 浓度范围内相关系数r绝对值不低于O. 9900。
4)分析灵敏度试剂盒分析灵敏度不高于O. 05ng/mL。
5)精密度精密度(CV%)应不高于10%。
6)质控品的测定值平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为4. 16 6. 24ng/mL 和 11. 6 17. 4ng/mL。
7)特异性
交叉反应符合下表要求
权利要求
1.血管紧张素I磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括DAng I校准品，Ang I校准品梯度浓度分别为0，0. 8,2,10，20，50ng/mL，校准品稀释液是50%牛血清；2)偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；3)生物素标记的AngI抗体；4)AngI抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ > 3. 0， 活性彡250U/mL ；5)Ang I质控品；7)20倍浓缩洗液；8)反应管。
2.根据权利要求1所述的血管紧张素I磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。
3.根据权利要求1所述的血管紧张素I磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径l-2um。
4.根据权利要求1所述的血管紧张素I磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的Ang I质控品包括低值质控品和高值质控品，低值质控品和高值质控品的允许范围分别为4. 16 6. 24ng/mL和11. 6 17. 4ng/mL。
5.根据权利要求1所述的血管紧张素I磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
6.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤(1)AngI校准品的配制将Ang I纯品用50%牛血清稀释成系列梯度，浓度分别为0,0.8,2,10，20，50ng/mL ；(2)Ang I质控品的配制将Ang I抗原用含有50%牛血清配制低值质控品和高值质控品，低值质控品和高值质控品允许范围分别为4. 16 6. 24ng/mL和11. 6 17. 4ng/mL ；(3)磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备取IOOmLO. lmol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入IOmg磁性颗�：�3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液3. 5uL，反应Ih后，使用磁力架吸附，静止 lOmin，移去液体，加入IOmL O. 01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0. 01mol/L PBS定溶至IL即可；(4)生物素标记的AngI抗体的制备取0. 5mg Ang I抗体,用硼酸盐缓冲液在2 8°C下透析I 3h ;将透析后的抗体加入 25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uLlmol/L氯化铵溶液，常温避光反应30 60min ;用0. 01mol/L PBS溶液在2 8°C下透析2天，期间换液3 5次；(5)Ang I酶结合物的制备采用高碘酸钠氧化法将Ang I与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:8000，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2 8°C ；(6)20倍浓缩洗液的配制20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5. 92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，IOmL/ LTween-20 和 1%。Proclin300 ；(7)化学发光液A液和B液的配制A液为 O. 7g/L鲁米诺，O. 165g/L对碘酚，缓冲液为ρΗ8· 6的5mmol/L Tris · HCl，避光保存液为O. 675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；(8)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C；(9)对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
全文摘要
本发明公开了一种血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括Ang Ⅰ校准品；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的Ang Ⅰ抗体；Ang Ⅰ酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；Ang Ⅰ质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、成本低、稳定性好等优点。
文档编号G01N33/531GK102998465SQ20121047247
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者刘萍, 张影, 宋启超, 范利花 申请人:博奥赛斯(天津)生物科技有限公司
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