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专利名称：诊断试剂盒及ccdc49在制备胃癌早期诊断试剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，特别涉及一种诊断试剂盒及CCDC49在制备胃癌早期诊断试剂中的应用。
背景技术：
胃癌是�：θ死嘟】档某＜�恶性肿瘤，根据世界卫生组织(WHO) 2008年的统计(世界卫生组织年度统计，2008)，在全世界范围，胃癌病人的死亡率高居第二。在2006年WHO的统计中显示有接近950，000个新发病例，同时有约700，000人死于这一种疾病。在我国，每年胃癌新发患者数超过30万，死于胃癌的人数约16万，病死率居恶性肿瘤之首，严重威胁人民生命健康(陈竺，全国第三次死因回顾抽样调查报告，2008)。为降低死亡率， 提高胃癌的疗效，关键是胃癌的“三早”工作，即早期发现、早期诊断及早期治疗。然而，由于绝大多数胃癌患者缺乏特异性的临床症状，故早期胃癌诊断率很低，手术率不足10% (吴云林外科理论与实践，2005，10:401);术后病人的生存期也较短。目前，我国胃癌总体5年生存率为43. 4%，术后病理分期(pathological M，pTNM) I、II、III、IV期患者的术后5年生存率分别为75. 65%,58. 73%,28. 01%和8. 42% (刘炳亚中华胃肠外科杂志，2010，13:163)。因此，提高胃癌的早期诊断率非常重要。而一般体检和影像学检查作用有限，待能够发现和明确诊断时，往往已到了中、晚期，缺少预警价值。因此，从长远角度看，应致力于发现敏感性和特异性均较好的肿瘤标志物。此外，胃癌异质性大，预后及对治疗的反应性差别较大，对于临床评估预后以及对治疗反应性的预测与评价，均需良好的肿瘤标志物。理想的肿瘤标志物应符合以下条件(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)肿瘤标志物浓度和肿瘤大小、转移、恶性程度有关，能协助肿瘤分期和判断预后；(4)半衰期短，有效治疗后浓度很快下降，能较快反映体内肿瘤的实际情况；(5)存在于体液，特别是血液中，易于检测(刘炳亚中华胃肠外科杂志，2010，13:163)。肿瘤血清标志物的研究一直是本领域的研究重点。现已有多种胃癌肿瘤标识物如癌胚抗原(CEA)，存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中，但对早期胃癌的诊断意义较�。�主要用于胃癌治疗前后的动态观察(Lipkin M:Cancer Research, 1988, 48:235 ；Lipkin: JBC Supplymental, 1992，16:1) ;CA125、CA 19-9, CA50、CA724 以及 CA242 等部分糖抗原在部分胃癌患者中可升高，但其敏感性仅20 40 % (Kodera Y:The Americanjournal of gastroenterology, 1996，91:49 ；Chou M:Disease Markers, 2000，16:105 ；Lai IR etal:Hepato—gastroenterology，2002，49:115 Edip U et al!Advances inTheray, 2008, 25:1075);还有研究发现肿瘤相关糖蛋白抗原_72 (TAG-72)对胃癌的敏感性为69%，特异性为84% (刘军等实用医学杂志，1999，15:4);糖蛋白抗原MG7_Ag在血清中有40% -60%的阳性检出率，在胃癌组织中有80% -94%的阳性检出率(Ren JiCancer,
2000,88:280);核小体组蛋白类抗原(IP0 — 38)作为胃癌诊断的敏感性为57. 4%，特异性超过90% (Hao Y etal: J Proteome Res, 2008，7:3668)以上这些指标均有利于早期胃癌的诊断。某些肿瘤基因，如DDC、C-myC、C-erb-2、p53以及nm23等对胃癌的发生、转移也有一定意义，但广泛应用于临床仍受限制(刘倩等，人民卫生出版社，2004)。由于现有的胃癌生物标识物在灵敏度和特异性上的缺陷，虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值，但目前仍不能用于胃癌的确诊。为了实现对胃癌的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的胃癌生物标志物。我们在前期研究中利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了胃癌病人相关血清101份(胃癌病人37份、高危病人14份、健康人血清50份)，在较短时间内比较了患者和健康人样品中的不同，给出了候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗胃癌。蛋白CCDC49 (Coiled-coil domain containing protein 49)含卷曲螺旋区域结合蛋白49，是由基因CCDC49编码，该基因在哺乳动物中进化保守，编码425个氨基酸，蛋白质分子量为42KD (NCBI)。该蛋白功能未知，亦未见有将CCDC49蛋白质作为胃癌生物标志物的报导。

发明内容
本发明的第一目的在于提供一种诊断试剂盒，以解决现有技术中的胃癌诊断试剂盒不能实现对胃癌的早期高灵敏性、高特异性的诊断的技术性问题。本发明的第二目的在于提供一种CCDC49在制备胃癌早期诊断试剂中的应用，以解决现有技术中的胃癌诊断试剂不能实现对胃癌的早期高灵敏性、高特异性的诊断的技术性问题。本发明目的通过以下技术方案实现一种诊断试剂盒，用于胃癌早期的诊断，所述诊断试剂盒包括酶标板、人蛋白质CCDC49、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，人蛋白质(XDC49包被于所述酶标板上。优选地，所述人蛋白质(XDC49是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到，浓度为 50 y g/mL。优选地,所述标准血清包括0U/mL标准血清I和100U/mL标准血清2,所述0U/mL标准血清I为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述100U/mL标准血清2为CCDC49抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。优选地，所述酶标试剂含HRP- 二抗0. 1-1 u g/mL。优选地，所述酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液包括显色剂A和显色剂B，显色剂A :500mL溶液中含有醋酸钠13. 6g、柠檬酸I. 6g和30%双氧水0. 3mL ;显色剂B :500mL溶液中含有TMB 350mg、DMS0 20mL和柠檬酸 H205. lg。优选地，所述封闭液为0. 5%BSA的0. 01mol/L pH 7. 4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液，即 I 升溶液中含 5g BSA (牛血清白蛋白)、8g NaCUO. 2g KH2PO4,2. 9g Na2HPO4 12H20和 0. 2g KCl。优选地，所述样品稀释液为0. 01mol/L pH 7. 4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS);所述洗涤液为 0. 01mol/L pH 7. 4 磷酸盐-NaCl 缓冲液(PBST), PBST 内含 0. 05%Tween_20,即 I 升溶液中含 8g NaCl.O. 2g KH2PO4,2. 9g Na2HPO4 12H20、0. 2g KCl 和 0. 5mL Tween-20 ;所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。优选地，所述试剂盒中的试剂均可加入防腐剂。一种诊断试剂盒，用于胃癌早期的诊断，所述诊断试剂盒采用的是现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质CCDC49的IgM抗体，具体是用人蛋白质CCDC49抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中加入待测血清，再与HRP标记的二抗结合，形成CCDC49-抗体-酶标二抗复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的抗蛋白质(XDC49的IgM抗体的水平呈正相关。
人蛋白质CCDC49在制备胃癌早期诊断试剂中的应用。与现有技术相比，本发明有以下优点I、提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗蛋白质CCDC49的IgM抗体的水平，有助于辅助早期诊断胃癌；2、提供的血清生物标志物蛋白质(XDC49的特异性为81%，敏感性为82%，具有高特异性和高敏感性的特点。


图I为银染鉴定(XDC49的表达浓度、纯化状况的示意图，图中I表示标准BSA溶液浓度为5 U g/mL ；2表示标准BSA溶液浓度为10 U g/mL ；3表示标准BSA溶液浓度为25 U g/mL ；4表示标准BSA溶液浓度为50 U g/mL ；5表示标准BSA溶液浓度为100 U g/mL ；6表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)(国家生化工程技术研究中心)分离纯化后的(XDC49蛋白质样品(含GST标签)；7表示蛋白质分子量mar ker，从大到小分子量分别是170KD，130KD，9 5KD，7 2KD，55KD ；图2为Western-Blotting鉴定(XDC49的表达、纯化状况的示意图，图中I表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)(国家生化工程技术研究中心)分离纯化后的(XDC49蛋白质样品(含GST标签)；2表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是130KD，95KD，72KD，55KD ；图3为健康人、高危、胃癌患者血清中抗蛋白质(XDC49的IgM抗体的浓度变化曲线图，注图中的数值是健康人、高危、胃癌患者各300份血清样本中的抗蛋白质CCDC49的IgM抗体浓度的相对水平。
具体实施例方式以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。I、表达、纯化及鉴定CCDC49 :
蛋白质(XDC49是由基因工程改造过的酿酒酵母利用半乳糖诱导过量表达，之后，经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化而得到，对其进行银染定量和Western-Blotting鉴定的结果分别如图I和图2所示。2、血清样品的准备全血标本于室温放置2小时或4°C过夜后于IOOOg离心20分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于_20°C或_80°C保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有NaN3,因为NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。3、ELISA法中各种缓冲液及试剂的配制方法(I)包被缓冲液0. 05M pH 9. 6 的 Na2CO3-NaHCO3
权利要求
1.一种诊断试剂盒，用于胃癌早期的诊断，其特征在于，所述诊断试剂盒包括酶标板、人蛋白质CCDC49、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，人蛋白质(XDC49包被于所述酶标板上。
2.如权利要求I所述的ー种诊断试剂盒，其特征在于，所述人蛋白质CCDC49是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到，浓度为50μ g/mL。
3.如权利要求I所述的ー种诊断试剂盒，其特征在于，所述标准血清包括OU/mL标准血清I和100U/mL标准血清2,所述OU/mL标准血清I为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述100U/mL标准血清2为(XDC49抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。
4.如权利要求I所述的ー种诊断试剂盒，其特征在干，所述酶标试剂含HRP-ニ抗0.1-1μ g/mL0
5.如权利要求I所述的ー种诊断试剂盒，其特征在于，所述酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液包括显色剂A和显色剂B，显色剂A 500mL溶液中含有醋酸钠13. 6g、柠檬酸1.6g和30%双氧水O. 3mL ;显色剂B :500mL溶液中含有TMB 350mg、DMS0 20mL和柠檬酸·Η205.丄g0
6.如权利要求I所述的ー种诊断试剂盒，其特征在干，所述封闭液为O.5%BSA的O. 01mol/L pH 7. 4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液，即I升溶液中含5g BSA (牛血清白蛋白)、8g NaCl、O. 2g KH2PO4,2. 9g Na2HPO4 · 12H20 和 0. 2g KCl。
7.如权利要求I所述的ー种诊断试剂盒，其特征在干，所述样品稀释液为O.Olmol/L pH 7. 4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS);所述洗涤液为O. Olmol/L ρΗ7· 4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，PBST 内含 O. 05%Tween-20,即 I 升溶液中含 8g NaCl、O. 2g KH2PO4,2. 9gNa2HPO4 · 12Η20、0· 2g KCl 和 O. 5mL Tween-20 ;所述终止液为 2mol/L H2SO4 溶液。
8.如权利要求I所述的ー种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的试剂均可加入防腐剤。
9.一种诊断试剂盒，用于胃癌早期的诊断，其特征在于，所述诊断试剂盒采用的是现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质CCDC49的IgM抗体，具体是用人蛋白质CCDC49抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中加入待测血清，再与HRP标记的ニ抗结合，形成(XDC49-抗体-酶标ニ抗复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最終的黄色，颜色的深浅和样品中的抗蛋白质(XDC49的IgM抗体的水平呈正相关。
10.人蛋白质CCDC49在制备胃癌早期诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物科学领域，特别涉及一种诊断试剂盒及CCDC49在制备胃癌早期诊断试剂中的应用。本发明的诊断试剂盒，用于胃癌早期的诊断，所述诊断试剂盒包括酶标板、人蛋白质CCDC49、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，人蛋白质CCDC49包被于所述酶标板上。与现有技术相比，本发明有以下优点1、提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗蛋白质CCDC49的IgM抗体的水平，有助于辅助早期诊断胃癌；2、提供的血清生物标志物蛋白质CCDC49的特异性为81%，敏感性为82%，具有高特异性和高敏感性的特点。
文档编号G01N33/68GK102680709SQ20121015271
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者刘炳亚, 朱正纲, 李建芳, 杨丽娜, 燕敏, 王靖方, 郭书娟, 陶生策 申请人:上海交通大学