专利名称：一种肝硬化免疫质谱检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肝硬化免疫质谱检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
随着肝癌外科的成熟和发展，肝癌的治疗方法和手段日渐丰富，而不再局限于单一的手术治疗。肝切除术和肝移植仍然是肝癌患者治疗的主要方法，但微创治疗、经皮肝动脉化疗栓塞等技术方法，作为手术治疗的重要补充，也得到了较广泛的应用，它们在为患者创造手术治疗机会、降低或减少肿瘤的复发和转移等方面都起到了一定的作用，延长了患者的生存时间。虽然如此，肝癌患者发病隐匿、无明显症状、多数患者就诊时已失去手术根治的机会。因此，“早期发现、早期诊断、早期治疗”是降低癌症死亡率的重要措施。筛选和建立用于癌症早期诊断的、高敏感、高特异的血清学诊断技术，提供癌症早期预警普查，具有重大意义和巨大市场前景。而肝硬化是肝癌的重要预警时期。因此对肝硬化的准确和快速的诊断有助于预防和早期治疗肝癌。目前国内外广泛采用检测血清中甲胎蛋白(AFP)来确诊肝癌(HCC)，尽管这种方法提高了 HCC的检测水平，但仍有显著数量患者的甲胎蛋白并未升高，尤其对肿瘤直径小于3CM的小肝癌患者，其敏感性及特异性更低。近年来，标志物联检在肿瘤诊断中的应用的研究得到很大的重视。如通过联检甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清铁蛋白(SF)、 α-L-岩藻糖苷酶(AFU)可显著提高肝癌诊断的阳性率。AFP、CEA、SF、CA等四标志物联检原发肝癌的实验也获得不错的结果。但由于诊断特异性或成本效益方面的原因，很难在肝癌普查中广泛应用。目前，检测血清中多肽进行临床诊断还没有先例。血清多肽能否用于诊断或早期诊断肝癌可以从三个方面来判断。1、血清多肽是血清蛋白的降解产物或基因直接编码产物。当生理状态发生变化时尤其向肿瘤转化时，蛋白的代谢发生变化，导致多肽相应变化， 从而建立了多肽----疾病的相关关系，因此，多肽可以像蛋白一样进行疾病诊断。2、实践上已经有一些疾病的诊断采用多肽标志物，1985年以来，利用合成多肽检测艾滋病病毒 (PM)、风疹病毒、人巨细胞病毒及类风湿等已应用到临床。3、文献表明，多肽可以用于临床诊断，如，Clinical Chemistry 51 10,1933-1945(2005)和 Clinical Chemistry 53:61， 067-1074(2007)认为血清多肽标志物能更精确的区分蛋白标志物不能区分的肿瘤。Nat Methods. 2008 Jan ；5(1) :57_9认为质谱诊断肿瘤甚至比MRI还好。质谱技术给生命科学带来的促进作用举世公认，近十年来，质谱在新生二筛查、基因突变检测方面取得一系列重要进展，并出现了单核苷酸多态性(SNP)分析专业质谱仪器，显示了质谱在临床诊断方面的价值。但目前还没有合适的肝硬化多肽标志物的检测试剂盒能准确、特异且简便的检测肝硬化，从而能更起到肝癌的预警并早地预防肝癌
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种肝硬化免疫质谱检测试剂盒。本发明提供的试剂盒，其含有保藏号为CGMCC No. 5269的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和固相载体。其中，所述固相载体为包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒。优选地，本发明的单克隆抗体可固定在固相载体上，如固定于被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒上。本发明选用的包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒(Protein GAgarose/Protein AAgarose)是免疫沉淀的基质，与包被蛋白G或蛋白A的磁珠(Protein G magnetic beads/ Protein A magnetic beads)相比，更具成本低的优点。进一步的，本发明的免疫质谱检测试剂盒还含有洗脱液，所述的洗脱液选自PH 2. 7 的 0. lmol/1 甘氨酸-HCl 溶液、5% (ν/ν)乙酸或含 0. 1% (v/v) TFA 的 50 70% (ν/ ν) ACN的混合液。本发明中，抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株ΑΡ0105，是以多肽标志物抗原(序列为 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln的多肽，命名为多肽5)与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的偶联物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本发明提供的抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株ΑΡ0105，已于2011年9月27号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)保藏，保藏号为 CGMCC No. 5269。本发明还提供所述多肽免疫检测试剂盒的制备方法，该方法包括如下步骤将纯化后的单克隆抗体与所述固相载体悬浮液混合，使得浓度为0. 15 μ g/ μ L-l. 5 μ g/ μ L，在 4°c旋转孵育15分钟-2小时，放置l-5min，沉淀，移出上清液，用100-200 μ L PBS缓冲液 (0. 01mol/l、pH7. 4)清洗所述固相载体2_5次，得到所述多肽免疫检测试剂盒。本发明还提供一种肝硬化免疫质谱检测方法，该方法包括如下步骤所述免疫检测试剂盒从血清样品中分离多肽标志物抗原，用高通量的MALDI-T0F-MS检测洗脱液中的所述多肽标志物抗原，由此建立完整的多肽免疫质谱检测方法。其中，所述分离方法为将所述试剂盒中的单克隆抗体与血清样品中的多肽标志物抗原发生特异性结合，用洗脱液从所述固相载体上分离出所述多肽标志物抗原。具体地，所述肝硬化免疫质谱检测方法包括如下步骤1)结合单克隆抗体与琼脂糖颗粒以共价键相互结合；2)孵育将样品与结合了抗体的琼脂糖颗粒进行孵育；3)清洗经过孵育，使得待分析物结合到抗体上，并清洗琼脂糖，洗掉不与抗体结合的杂质；4)洗脱用洗脱液将待分析物洗脱下来；5)检测用MALDI-T0F MS检测，并对数据进行分析。优选地，所述肝硬化免疫质谱检测方法包括如下步骤1)取 15-25 μ 1 固相载体，置于 Eppendorf 管中，加入 1. 56μ g-31. 1μ g 抗体，4°C 旋转混合15分钟-2小时，放置l_5min，移出上清液，用0. 01M、pH7. 4PBS缓冲液100-200 μ L 清洗所得固相载体沉淀2-5次；
2)取0. 48 μ g-24 μ g多肽标准品、10-50 μ L PBS,与步骤1)清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合8-12h ；3)放置l-5min，移出上清液，用100-200 μ L PBS清洗沉淀2_5次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；以避免抗原非特异附着在管壁，降低检测本底值；4)加入5-10 μ L洗脱液，吸排混合l-5min ；5)离心，取上清液，用MALDI-T0F-MS检测，得到多肽标准品质谱；6)用40_60μ1血清样品替代步骤2)的多肽标准品，重复步骤2) _5)，用 MALDI-T0F-MS检测，测定血清样品中的多肽标志物抗原。步骤5)所述检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，N2激光器，激光波长337nm，能量2000，离子延迟提取时间(Pulse ion extraction，PIE) 390ns，质谱信号单次扫描累加2000次，使用ρ印tide II standard kit (Bruker)离子峰校正(m/z 700-m/ ζ 3500)，质量扫描范围500-5000Da。本发明肝硬化免疫质谱检测方法操作简单，主要包括抗体固相化、多肽抗原孵育结合和质谱检测三个方面，即将包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒与本发明的单克隆抗体混合孵育，抗体与蛋白G或蛋白A亲和结合后固相化，清洗，加入多肽抗原孵育，抗原与抗体特异性结合，清洗，洗脱液分离抗原，MALDI-T0F-MS检测。本发明所涉及的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的特异性强；采用免疫与质谱技术连用，能实现肝硬化高通量、高灵敏度、高精确度的检测，从而能更好地起到肝癌的预警作用。此外，本发明技术是分子水平的诊断，与肿瘤影像学相比预警能力强、成本低。本发明将血清多肽肿瘤早期诊断试剂盒与先进的质谱技术联合，可以同时检测多个生物标志群，是验证血清标志物和应用于临床检测的理想工具。
图1为本发明的多肽免疫质谱检测方法示意图；图2为本发明合成肽5标准品的质谱图。图3为本发明肝硬化确证血清样本的质谱图。图4为本发明的检测肝硬化血清与正常血清的ROC曲线图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1多肽标志物抗原单克隆抗体的制备方法1)采用偶联载体蛋白KLH的合成的多肽5作为免疫原免疫BALB/C小鼠；其全长序列为Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。2)2周后检测尾血滴度，达到1 1000以上后，取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG作用下进行融合；3)通过ELISA方法进行筛�。糜邢尴∈头ǘ苑置诳固逖粜缘脑咏涣鱿赴锌寺〈炕�4)筛选出10株针对合成肽5的杂交瘤细胞，意外地发现其中一株敏感性较
5高(lng/well)，扩增细胞系，制备并纯化单抗腹水，检测单抗的效价(1 200000)、滴度 (0.0005 μ g/ml)及亚型鉴定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特异性单克隆抗体。将该杂交瘤细胞株命名为抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105，并于2011 年9月27号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No.5269ο 实施例2肝硬化免疫质谱检测方法本发明的多肽免疫质谱检测方法的流程如图1所示。具体为1)取 25 μ L 包被蛋白 G 的琼脂糖颗粒(Protein G Agarose, Santa Cruz)，置于 0. 6mL Eppendorf管中，加入7.78 μ g AP0105，4°C旋转(转速5r/min)，混合1小时，放置 3min，移出上清液，用 100 μ L PBS 缓冲液(0. 01mol/l、ρΗ7. 4)清洗 Protein G Agarose 3 次；2)取M μ g合成肽5的多肽标准品(固相化学合成，北京中科亚光生物科技有限公司)、50 μ L PBS,与步骤1)清洗后的ftOtein G Agarose混合，4°C旋转混合8h ；3)放置 3min，移出上清液，用 200 μ L PBS 清洗 ftx)tein G Agarose 3 次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；4)加入5 μ L含有0. 1 % TFA的70 % ACN的洗脱液，吸排混合5min ；5)离心，取上清液，用MALDI-T0F-MS检测，检测图谱如图2所示，多肽标准品峰明显，与理论偏差小于0. IDa0其中，检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，队激光器，激光波长337nm，能量2000，离子延迟提取时间(Pulse ion extraction，PIE) 390ns，质谱信号单次扫描累加2000次，使用ρ印tide II standard kit (Bruker)离子峰校正(m/z 700-m/z ；3500)，质量扫描范围500 5000Da。结果表明，经本发明的方法检测合成肽5标准品，得到的MALDI-T0F MS质谱图具有分辨率高、特异性强的特点。实施例3肝硬化免疫质谱检测方法本发明的多肽免疫质谱检测方法的流程如图1所示。具体为1)取 15 μ L 包被蛋白 A 的琼脂糖颗粒(Protein A Agarose, Santa Cruz)，置于 0. 2mL Eppendorf 管中，加入 1. 56 μ g AP0105，4°C旋转(转速 5r/min)，混合 15 分钟，放置 2min，移出上清液，用 100 μ L PBS 缓冲液(0. 01mol/l、ρΗ7. 4)清洗 Protein AAgarose 3 次；2)取M μ g合成肽5多肽标准品(固相化学合成，北京中科亚光生物科技有限公司)、50 μ L PBS,与步骤1)清洗后的ftOtein A Agarose混合，4°C旋转混合8h ；3)放置 2min，移出上清液，用 200 μ L PBS 清洗 ftx)tein A Agarose 3 次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；4)加入5 μ L 5 %乙酸洗脱液，吸排混合;3min ；5)离心，取上清液，用MALDI-T0F-MS检测，从谱图中可以看出多肽标准品峰明显， 与理论偏差小于0. IDa0其中，检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，N2激光器，激光波长337nm，能量2000，离子延迟提取时间(Pulse ion extraction，PIE) 390ns，质谱信号单次扫描累加2000次，使用ρ印tide II standard kit (Bruker)离子峰校正(m/z 700-m/z ；3500)，质量扫描范围500 5000Da。实施例4肝硬化免疫质谱检测方法本发明的多肽免疫质谱检测方法的流程如图1所示。具体为1)取 20 μ L 包被蛋白 G 的琼脂糖颗粒(Protein G Agarose, Santa Cruz)，置于 0. 2mL Eppendorf管中，加入7.78 μ g AP0105，4°C旋转(转速5r/min)，混合1小时，放置 3min，移出上清液，用 100 μ L PBS 缓冲液(0. 01mol/l、ρΗ7. 4)清洗 Protein GAgarose 3 次；2)取M μ g合成肽5多肽标准品(固相化学合成，北京中科亚光生物科技有限公司)、50 μ L PBS,与清洗后的ftOtein G Agarose混合，4°C旋转混合8h ；3)放置 3min，移出上清液，用 200 μ L PBS 清洗 ftx)tein G Agarose 3 次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；4)加入5 μ L pH 2. 7的0. lmol/1甘氨酸-HCl溶液，吸排混合3min ；5)离心，取上清液，用MALDI-T0F-MS检测，谱图结果显示，多肽标志物峰值与理论偏差小于0. 2Da。谱图中杂峰较少，显示出目标峰有较高特异性。6)另取50 μ L临床确诊的肝硬化血清72份，正常血清120份，按上述同法平行操作，用MALDI-T0F-MS检测。肝硬化血清的谱图如图3所示，可以看出，图3所示的谱图与标准品图2的谱图相同，显示出目标峰有较高特异性。结果经统计，如图4的ROC曲线显示，敏感度达到75. 0%，特异度达到95. 1%。其中，检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，N2激光器，激光波长337nm，能量2000，离子延迟提取时间(Pulse ion extraction，PIE) 390ns，质谱信号单次扫描累加2000次，使用ρ印tide II standard kit (Bruker)离子峰校正(m/z 700-m/z ；3500)，质量扫描范围500 5000Da。
权利要求
1.一种肝硬化免疫质谱检测试剂盒，其含有保藏号为CGMCC No. 5沈9的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和固相载体。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体固定在固相载体上。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体为包被蛋白G或蛋白 A的琼脂糖颗粒。
4.根据权利要求1 3任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，还含有洗脱液。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的洗脱液选自pH2. 7的 0. lmol/1甘氨酸-HCl溶液、5%乙酸、含0. 1% TFA的50 70% ACN的混合液。
全文摘要
本发明涉及一种肝硬化免疫质谱检测试剂盒，所述试剂盒含有保藏号为CGMCC No.5269的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和固相载体。本发明所涉及的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的特异性强；采用免疫与质谱技术连用，能实现肝硬化高通量、高灵敏度、高精确度的检测，从而能更好地起到肝癌的预警作用。此外，本发明技术是分子水平的诊断，与肿瘤影像学相比预警能力强、成本低。
文档编号G01N33/577GK102507941SQ20111032835
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者付海媛, 侯利平, 原剑, 周晓明, 孙云波, 张拓, 杨保安, 王东茂, 甄蓓, �？〗�, 魏开华, 黄亚娟 申请人:北京正旦国际科技有限责任公司, 湖南金健药业有限责任公司
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