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专利名称：家蚕creb蛋白在家蚕卵滞育性早期鉴定中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种家蚕CREB蛋白在家蚕卵滞育性早期鉴定中的应用。
背景技术：
家蚕QBombyx mori )是一种典型的完全变态的鳞翅目昆虫，作为最早被驯化的经济昆虫，其滞育性的早期鉴定具有重要意义。滞育是昆虫为适应环境、维持个体生命活动和确保物种繁衍的生存策略，表现为一种正常的生理活性低下的发育停滞现象。滞育使昆虫有能力在不利的季节中存活下来， 并能使昆虫的繁殖阶段和世代发生与有利的季节条件同步化，有效利用资源。在自然条件下，群体发育齐一，能增强雌雄个体间交配机率，以利产生更多的后代，保证“种”的繁衍，家蚕滞育性的调节是蚕种生产的重要技术环节。CREB(cAMP response element binding )蛋白是真核生物保守的转录因子之一， 我们在研究家蚕滞育调控机制的过程中，已克隆了家蚕CREB基因(彻OSS)，用Western blot方法在家蚕中分别检测到分子量为34KD和^KD的两个条带，分别定名为彻CREBa和
，它们的表达模式与次代卵的滞育相关。

发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕CREB蛋白在家蚕卵滞育性早期鉴定中的应用， 并可应用于蚕业生产。本发明从螺旋丝显现期的家蚕胚胎中抽提蛋白后，采用SDS-PAGE凝胶电泳和 Western Blot技术，通过软件分析检测家蚕胚胎中彻CREBa和彻CRE&量，计算彻CREBb/ 彻CREBa比值。结果发现，彻CREBb/彻CREBa等于或低于0. 04时，家蚕次代卵表现为非滞育； 彻CREBb/彻CREBa等于或大于0. 76时，家蚕次代卵表现为滞育卵。本发明的创新之处在于将彻CREB的表达模式作为快速准确地鉴定家蚕次代卵滞育性的指标。


图1为不同品种家蚕卵彻CREB蛋白Westernblot的结果。图2为根据图1结果，利用分析软件对条带进行灰度分析，计算得到ifeOS^/ BmCREBa比值；滞育性根据对所养的蚕产卵后的调查确定，即产卵后在25°C条件下放置20 天，没有发育孵化的为滞育，发育并孵化的为非滞育。具体实施方法 1.蛋白样品的制备
1)将发育到螺旋丝发生期的蚕卵的胚胎用生理盐水清洗后，加入100-150U1蛋白抽提液，用研磨器碾碎；
2)冷冻离心机40C、12000rpm离心30min取上清；3)上清中的蛋白用下述的Bradford法定量
2.标准曲线的制作配制 0. 25 mg/ml、0. 5 mg/ml、0. 75 mg/mlU mg/mlU. 25 mg/ml、 2mg/ml浓度的胎牛血清(BSA)作为标准溶液。在96孔板中各加入200 μ 1考马斯亮兰，分别再加入5 μ 1标准蛋白样品和待测蛋白样品，室温黑暗中放置IOmin后，用酶标仪在595nm 检测吸收值，制作标准曲线计算样品蛋白浓度。4)蛋白上样样品的制备用SDS-PAGE凝胶电泳的上样缓冲液(RSB)将抽提的蛋白稀释到浓度为4 μ g/ μ 1，用100°C水煮沸5min后，立即移入冰上冷却，作为电泳的上样样品，置-20°C中保存备用。3. SDS-PAGE 凝胶电泳
1)胶的制备方法如下1.Omm玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上，倒入按下面方法配制的12%分离胶至离上端Icm处，再缓慢加入Iml无菌水覆盖在胶上，静止 30min以上，待分离胶凝固。1 分离胶配制
(MH2O3. 3ml
30% Arc-Bic 溶液4. Oml
Tris Buffer (PH=8. 8)2.5ml
10% SDS0. Iml
10% APS0. Iml
TEMED4 μ 1
分离胶凝固后，倒去上面的水后，在分离胶上加入按下面方法配的5%浓缩胶至顶部， 插入1. Omm梳子，静置30min以上，待浓缩胶凝固后备用。5%浓缩胶配制
(MH2O4. Iml
30% Arc-Bic 溶液1. Oml
Tris Buffer (ρΗ=6· 8)0. 75ml
10% SDS60 μ 1
10% APS60 μ 1
TEMED6 μ 1
2)上样与电泳待浓缩胶凝固后，在电泳槽中加入足够的电泳缓冲液，拔出梳子后上样，上样量为20 μ g /泳道，电泳电压，浓缩胶为70V，分离胶为100V，电泳时间约3小时，至指示剂溴酚兰至胶底边即停止电泳。4.转膜及显影
1)先准备一张与胶大小一样的PVDF膜和两张滤纸；
2)PVDF膜先放入甲醇中浸15秒后，放入转膜缓冲液中平衡30min以上。3)胶从玻璃板上取下后，轻轻刮去浓缩胶，做好标记，在转膜缓冲液中平衡5min ；
4)转膜膜置于胶的上面，两面各放两层滤纸，夹好后按正负极放入转膜仪中，用100V 恒压，在低温下转膜75min。5)封闭液与封闭用含0. 5%吐温的缓冲液(PBST)配制成5%的脱脂奶粉溶液作为封闭液，将转膜后的PVDF膜放在封闭液室温下封闭2小时；6)抗体稀释抗体用封闭液稀释到目的浓度。市售的CREB作为一抗；
7)封闭后的PVDF膜用PBST清洗3次，每次IOmin；
8)加入一抗，常温孵育池后，用PBST洗4次，每次lOmin。9)加入二抗，常温孵育Ih后，用PBST洗4次，每次IOmin ；最后用PBS洗1次， 15min。10)显色用ECL试剂盒发光
11)将发光的膜放入压片盒中，用X感光片感光约5-60秒(曝光时间根据发光强弱)。 经显影、定影和水洗后，晾干。5.定量分析对显影后的X光片用扫描仪扫描，运用Quantity One软件(Bio-Rad 公司)对显影的彻CREBa、彻0 &蛋白条带进行灰度分析，作为蛋白质含量。结果参见图1和图2。结果发现，彻CREBb/彻CREBa等于或低于0. 04时，家蚕次代卵表现为非滞育；彻CREBb/ 彻CREBa等于或大于0. 76时，家蚕次代卵表现为滞育卵。因此彻CREBb/彻CREBa的比值可以作为判定家蚕次代卵滞育性的指标。
权利要求
1. 一种家蚕CREB蛋白在家蚕卵滞育性早期鉴定中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种家蚕CREB蛋白在家蚕卵滞育性早期鉴定中的应用。本发明从螺旋丝显现期的家蚕胚胎中抽提蛋白后，采用SDS-PAGE凝胶电泳和WesternBlot技术，通过软件分析检测家蚕胚胎中BmCREBa和BmCREBb量，计算BmCREBb/BmCREBa比值。结果发现，BmCREBb/BmCREBa等于或低于0.04时，家蚕次代卵表现为非滞育；BmCREBb/BmCREBa等于或大于0.76时，家蚕次代卵表现为滞育卵。
文档编号G01N33/68GK102445547SQ20111029242
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者刘毅, 宋红生, 张鸿雁, 徐安英, 郑增长, 黄延旺 申请人:上海大学