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专利名称：三聚氰胺定量检测试剂和方法
技术领域：
本发明属三聚氰胺定量检测领域，特别是涉及利用胶体金免疫层析法和金标定量检测仪结合进行乳品的三聚氰胺定量检测。
背景技术：
三聚氰胺(melamine)，分子式为C3N6H6，俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“ 1，3， 5-三嗪-2，4，6-三氨基”，分子量为126. 12，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，中国国家食品质量监督检测中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺属于化工原料，不允许添加到食品中。三聚氰胺具有一定的肾毒性，食用后会导致人体泌尿系统产生结石。其分子中含有大量氮元素，用全氮法检测蛋白质含量时不能够区分这种“伪蛋白氮”，因此一些不法商家往乳制品中添加三聚氰胺粉以提高蛋白质含量，这对广大消费者特别是婴幼儿造成了严重的危害，对我国的乳业产生了较大的负面影响。如何解决“乳品安全”问题，建立原料乳的快速检测技术是关键之一。目前，用于奶粉、原料奶及牛奶中定量检测三聚氰胺含量的方法主要有HPLC法、 HPLC-MS/MS法、GCMS法、ELISA法等，但这些方法耗时费力、成本高、对检测人员的专业性要求高，不适用于现场检测。收奶站常用胶体金法定性检测试纸测量乳品中的三聚氰胺，检测限一般为0. 5ppm，并不能确定其含量。本研究即采用胶体金免疫层析法定量技术测定乳品中三聚氰胺的含量，使用金标定量检测仪与三聚氰胺免疫胶体金检测试纸配套检测，通过检测线颜色的强弱来测定三聚氰胺含量。胶体金免疫层析法测定乳制品中三聚氰胺的含量，相对于定性检测而言，三聚氰胺定量检测试剂(胶体金法)能在现场检测时就确定其含量，该方法简便、快速，实用性强，检测结果稳定可靠，成本低，便于记录和溯源。

发明内容
所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种利用胶体金免疫层析法和金标定量检测仪结合进行乳品的三聚氰胺定量检测的试剂及其方法，以克服现有三聚氰胺胶体金定性检测试纸不能定量检测，HPLC等其他方法，检测成本高，不能现场测定、出报告速度慢，影响原料乳的及时加工。技术方案本发明的技术方案之一是提供一种一种三聚氰胺定量检测试纸，该试纸在检测区的近样品端提供一个MEL抗体-胶体金区域，在检测区的另一端包被有三聚氰胺抗原检测线，通过该检测线中的三聚氰胺抗原与样品中存在的三聚氰胺竞争性结合所述MEL抗体的结合位点来定量测定样品中的三聚氰胺含量。上述的三聚氰胺定量检测试纸的另一种优选方案为，所述的检测试纸采用胶体金免疫层析法定量测定样品中的三聚氰胺。上述的三聚氰胺定量检测试纸的一种优选方案为，在所述检测区内还具有至少一条质控线。上述的三聚氰胺定量检测试纸的另一种优选方案为，所述的检测试纸对原料奶的检测范围为 0. 12mg/L-iang/L，优选为 0. 25mg/L-4mg/L0上述的三聚氰胺定量检测试纸的再一种优选方案为，所述的待测牛奶样品无需稀释或预处理。上述的三聚氰胺定量检测试纸的又一种优选方案为，所述的试纸还包括一样品垫，所述样品垫为经 0. 1-10% BSA，0. 05-3% Triton X-100 的 0. 01-0. lmol/L PBS pH = 5-10处理液浸泡处理的玻璃纤维膜。一种三聚氰胺定量检测试纸的制备方法，包括如下步骤将20-200mL0. 001-0. 1% 的HAuCl4溶液加热至沸，在剧烈搅拌下迅速加入0. 5-5mL 1 %的柠檬酸钠溶液，保持沸腾状态反应5-30min后关闭热源即得胶体金溶液，调节pH至5_10，混合MEL单克隆抗体与胶体金溶液，涡旋反应10-30分钟，加入10% BSA封闭，重悬并浓缩，得到稳定的金标抗体。上述的三聚氰胺定量检测试纸的制备方法的一种优选方案为，所述的pH值调节为 7-9。一种三聚氰胺定量检测方法，依次包括如下步骤将不同的液体样品进行不同处理后，滴于权利要求1所述的检测试纸的样品垫一侧，通过待测抗原与检测线中的三聚氰胺抗原竞争性结合MEL抗体使胶体金聚集而显色；利用金标定量检测仪测量读取检测线的光密度来获得被检样品中三聚氰胺的浓度，测定时间为样品滴加后10 士 ailin。上述的定量检测方法的一种优选方案为，所述试纸需将原料奶稀释处理，检测范围为 0. 12mg/L-12mg/L。上述的定量检测方法的另一种优选方案为，所述试纸检测原料奶时用到的样品稀释液为0. OlM PBS。上述的定量检测方法的另一种优选方案为，所述试纸检测牛奶时无需对样品做任何处理，对牛奶的检测范围为0. 25mg/L-4mg/L0上述的定量检测方法的另一种优选方案为，所述试纸上还具有至少一条质控线， 利用金标定量检测仪测量读取检测线和质控线的光密度，制作标准工作曲线，获得被检样品中所述标志物的浓度。上述的定量检测方法的另一种优选方案为，所述试纸的操作步骤快速、简便，结果判读时间为10 士 ailin。具体而言，本发明的三聚氰胺定量检测试剂采用免疫竞争抑制法检测奶粉、原料奶及牛奶中三聚氰胺的含量，即检测线上包被的三聚氰胺抗原，同样品中存在的三聚氰胺竞争有限的抗体结合位点。在试纸条检测线区包被了三聚氰胺抗原，在检测区的一端放置了已干燥处理的MEL抗体胶体金纸片。如果样品中三聚氰胺的含量在检测范围内，三聚氰胺抗体胶体金将随同样品溶液在膜上运行至检测线，与三聚氰胺抗原结合呈现出一肉眼可见的线条，将试剂盒插入配套的BN-Q系列金标免疫层析分析仪，即可得出样品中三聚氰胺的含量。该试剂盒原料奶的检测范围为0. 12mg/L-iaiig/L，牛奶的检测范围为0. 25mg/ L-4mg/Lo在本发明的一种实施方式中，所述定量检测试纸是通过如下过程制备的
1、胶体金制备1. 10. 01%氯金酸水溶液的配制称取氯金酸10mg，加入到IOOml纯水中。1. 21 %柠檬酸三钠水溶液的配制称取柠檬酸三钠10mg，加入到Iml纯水中。1. 3取配制好的0. 01%氯金酸水溶液，加热至沸，搅拌下准确加入一定量的柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸10 15分钟，至溶液的颜色完全变为透明的酒红色，停止加热， 冷却至室温，加纯化水使其恢复至原体积。2、Mel免疫胶体金制备2. 1将购买的抗三聚氰胺单克隆抗体的浓度，用0. OlM PB缓冲液(PH7. 2-7. 6)稀释到 1. Omg/ml ο2. 2 Iml胶体金溶液，往里加入0. 01-0. Iml的0. IM PB缓冲液(PH7. 2-7. 6)混合 3分钟。在快速搅拌下，再缓缓将上述稀释的抗体溶液10-20 μ 1加入其中。生产中可根据此尺度按比例配制。室温反应3-10分钟并不时缓缓搅拌。2. 3反应结束后，在上述反应液中加入1/50倍反应液总体积的10% BSA。室温反应3-10分钟并不时缓缓搅拌。2. 4将制备好的免疫胶体金12000转/min离心30分钟，收集离心沉淀，用0. 1 % BSA硼酸缓冲液复溶。2. 5制得的免疫胶体金溶液应在2-8 °C保存。3、胶金垫制备3. 1胶金垫稀释液配制称取0.01-0. 03g BSA,0. Olg PEG20000，0· 1-0. 5g 蔗糖，0· 01-0· 03g Tween-20, 0. 02gTritonX-100,0. 02g Casein 加入到 IOmL 0. OlM PB 缓冲液中(PH7. 2-7. 6)，充分溶解。3. 2将制备好的Mel免疫胶体金用胶金垫稀释液10_20倍稀释，用移液器按每条 l-2ml免疫胶体金稀释溶液的量，将吸取的液体均勻地加在胶金垫上，平放在干净的架子上，烘房干燥2小时。4、Mel免疫硝酸纤维素膜制备4. IC线溶液配制用0. OlM PBS(PH7. 2)将羊抗鼠IgG浓度稀释到0. 5-1. Omg/ml。4. 2T线溶液配制将购买的Mel抗原浓度用0. OlM PBS稀释到0. 5-1. Omg/ml。4. 3调试好微量蛋白点膜系统各参数，进行喷膜。烘房干燥2小时。5、样品垫6、Mel检测试剂制备取出制备好的胶金垫、免疫硝酸纤维素膜与吸水垫、样品垫(玻璃纤维素纸)，粘贴到PVC底板上，裁切成试纸条，组装到试剂盒内。7、BN-Q系列金标免疫层析分析仪有益效果本发明的三聚氰胺定量检测试纸和方法通过胶体金免疫层析法和金标定量检测仪结合实现了乳品的三聚氰胺定量检测，具有定量检测重复性良好、定量线性好、线性范围宽(对原料奶的检测范围为0. 12mg/L-12mg/L ；对牛奶的检测范围为0. 25mg/L-4mg/L)、快速(IOmin)的优点。
在本说明书中，除非有其他说明，各个优选技术方案和更优选技术方案的技术特征可以相互组合形成新的技术方案。为了简要目的，申请人在说明书中省略了这些组合的具体描述，然而，所有这些技术特征组合后的技术方案均应当被认为以明确的方式书面记载于本说明书中。


图1为原料奶中检测MEL含量的标准曲线案例图2为成品牛奶中检测MEL含量的标准曲线案例
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如胶体金检测试剂操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。本发明所述的“金标免疫层析分析仪”为利用反射分光光度计原理在胶体金显色的相应光谱上对光强度进行记录的装置，优选地，该装置还可以配备计算程序对检测值⑴和对照值(C)的比值进行自动计算和记录，并且按照输入或设定的标准曲线，对检测值所对应的浓度进行直接判读。实施例11、取0. 01%氯金酸水溶液100ml，加热至沸，搅拌下加入Iml 柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸lOmin，至溶液颜色为透明的酒红色停止加热，冷却至室温后定容至100ml。2、IOOml胶体金溶液，加入IOml的0. IM PB缓冲液(PH7. 2-7. 6)混合3分钟；在快速搅拌下，再缓缓加入稀释好的抗体溶液Ι-aiil，反应3-10分钟并不时缓缓搅拌；加入2ml 的10% BSA溶液，反应3-10分钟并不时缓缓搅拌。将制备好的免疫胶体金12000转/min 离心30分钟，收集离心沉淀用0. 1% BSA硼酸缓冲液复溶。3、配制胶金垫稀释液 IOOml :0. 1-0. 3g BSA, 0. Ig PEG20000, l_5g 蔗糖， 0. 1-0. 3gTween-20,0. 2g TritonX-100,0. 2g Casein，加入到 IOOmL 0. OlM PB 缓冲液
(PH7.2-7.6)中，充分溶解。用胶金垫稀释液将制备好的免疫胶体金10-20倍稀释，按每条胶金垫Iml溶液的量铺成胶金垫，烘房干燥。4、C线溶液中羊抗鼠IgG浓度用0. OlM PBS (PH7. 2)稀释到1. Omg/ml ；T线溶液中 Mel抗原浓度用0. OlM PBS (PH7. 2)稀释到0. 5mg/ml。制备MEL免疫硝酸纤维素膜。5、用0. OlM PBS处理样品垫。6、粘贴、组装。7、测试含有不同浓度MEL的原奶，原奶样本用0. OlM PBS进行稀释，定量加样， 5-10min后用BN-Q系列金标免疫层析分析仪读值。测试结果见图1.实施例21、取0.01%氯金酸水溶液500ml，加热至沸，搅拌下加入0. Sml 10%柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸lOmin，至溶液颜色为透明的酒红色停止加热，冷却至室温后定容至500ml。2,500ml胶体金溶液，加入50ml的0. IM PB缓冲液(PH7. 4)混合3分钟；在快速搅拌下，再缓缓加入稀释好的抗体溶液5ml，反应5分钟并不时缓缓搅拌；加入IOml的10% BSA溶液，反应5分钟并不时缓缓搅拌。将制备好的免疫胶体金12000转/min离心30分钟，收集离心沉淀用0. 1% BSA硼酸缓冲液复溶到50ml。3、配制胶金垫稀释液 500ml 称取 0.5-1. 5g BSA, 0. 5g PEG20000，5_10g 蔗糖， 0. 5-1. 5g Tween-20,Ig TritonX-100,Ig Casein,加入到 IOOmL 0. OlM PB 缓冲液中
(PH7. 2)，充分溶解。用胶金垫稀释液将制备好的免疫胶体金10-20倍稀释，按每条胶金垫 Iml溶液的量铺成胶金垫，烘房干燥。4、C线溶液中羊抗鼠IgG浓度用0. OlM PBS (PH7. 2)稀释到1. Omg/ml ；T线溶液中 Mel抗原浓度用0. OlM PBS (PH7. 2)稀释到0. 5mg/ml。制备MEL免疫硝酸纤维素膜。5、粘贴、组装。实施例3测试了两个品种的含有不同浓度MEL的成品市售牛奶。待测牛奶样品无需稀释或预处理，定量加样到试剂盒中，用BN-Q系列金标免疫层析分析仪读值。测试结果见图2。由图1和图2可看出，本发明的三聚氰胺定量检测试剂在检测范围内的两次测试结果均呈线性相关。
权利要求
1.一种三聚氰胺定量检测试纸，该试纸在检测区的近样品端提供一个MEL抗体-胶体金区域，在检测区的另一端包被有三聚氰胺抗原检测线，通过该检测线中的三聚氰胺抗原与样品中存在的三聚氰胺竞争性结合所述MEL抗体的量，测定样品中的三聚氰胺含量。
2.根据权利要求1所述的三聚氰胺定量检测试纸，其特征在于，在所述检测区内还具有至少一条质控线。
3.根据权利要求1所述的三聚氰胺定量检测试纸，其特征在于，所述的检测试纸对原料奶的检测范围为0. 12mg/L-12mg/L0
4.根据权利要求1所述的三聚氰胺定量检测试纸，其特征在于，所述的待测牛奶样品无需稀释或预处理。
5.根据权利要求1所述的三聚氰胺定量检测试纸，其特征在于，所述的试纸还包括一样品垫，所述样品垫为经 0. 1-10% BSA,0. 05-3% Triton X-100 的 0. 01-0. lmol/L PBS pH =5-10处理液浸泡处理的玻璃纤维膜。
6.一种三聚氰胺定量检测试纸的制备方法，包括如下步骤将20-200mL0. 001-0. 1% 的HAuCl4溶液加热至沸，在剧烈搅拌下迅速加入0. 5-5mL 1 %的柠檬酸钠溶液，保持沸腾状态反应5-30min后关闭热源即得胶体金溶液，调节pH至5_10，混合MEL单克隆抗体与胶体金溶液，涡旋反应10-30分钟，加入10% BSA封闭，重悬并浓缩，得到稳定的金标抗体。
7.根据权利要求6所述的三聚氰胺定量检测试纸的制备方法，其特征在于，所述的pH 值调节为7-9。
8.—种三聚氰胺定量检测方法，依次包括如下步骤(1)将液体样品滴于权利要求1所述的检测试纸的样品垫一侧，通过待测抗原与检测线中的三聚氰胺抗原竞争性结合MEL抗体使胶体金聚集而显色；(2)利用金标定量检测仪测量读取检测线的光密度来获得被检样品中三聚氰胺的浓度。
9.根据权利要求8所述的定量检测方法，其特征在于，所述试纸对原料奶的检测范围为 0. 12mg/L-12mg/L ；对牛奶的检测范围为 0. 25mg/L-4mg/L0
10.根据权利要求8所述的定量检测方法，其特征在于，所述试纸上还具有至少一条质控线，利用金标定量检测仪测量读取检测线和质控线的光密度，制作标准工作曲线，获得被检样品中所述标志物的浓度。
全文摘要
本发明涉及一种三聚氰胺简便、快速、定量检测试剂及其检测方法。该试纸在检测区的近样品端提供一个三聚氰胺(MEL)抗体-胶体金区域，在检测区的另一端包被有三聚氰胺抗原检测线，通过该检测线中的三聚氰胺抗原与样品中存在的三聚氰胺竞争性结合所述MEL抗体的量，测定样品中的三聚氰胺含量。对原料奶的检测范围为0.12mg/L-12mg/L；对牛奶的检测范围为0.25mg/L-4mg/L，并且具备简便、快速、精密度高、稳定性好，检测费用低等优点，适用于对乳品中三聚氰胺的定量。
文档编号G01N33/531GK102507927SQ201110311538
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者宋旭, 沈鹤柏 申请人:沈鹤柏