专利名称：血液小分子代谢物特征图谱的制作和诊断应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学诊断学技术领域，具体涉及一种鉴别乳头状甲状腺癌、良性甲状腺肿及正常人的血液小分子代谢物图谱及其制作方法与应用。
背景技术：
代谢组学作为后基因组时代系统生物学领域中重要的技术手段，近年来得到了长足的发展。代谢组学的着眼点在于病理刺激或者基因修饰后，细胞、组织、器官在内所有代谢物量的动态变化，从整体角度通过代谢物的变化对于疾病的发生发展进行系统描述。体液内的所有的代谢物可以作为生命系统状态的指针，不仅能够反映各种生理调节的结果，也可以发展为辅助临床诊断的有力工具。目前，在包括癌症、糖尿病、心血管疾病等疾病的研究中发现了相应的诊断代谢标志物。而应用一组血液小分子代谢物构成的代谢谱对疾病进行诊断的方法的发展在国际上正处于一个快速的发展阶段，可能在未来对疾病的临床诊断中产生重大的影响。甲状腺癌是头颈部的第一高发肿瘤，近年来甲状腺癌的发病率显著增高，已经成为发病率增长最快的恶性肿瘤之一。以美国为例，近30年甲状腺癌的发病率就增加了 2-3倍，甲状腺癌已占女性恶性肿瘤的第七位。目前美国每年甲状腺癌的新发病例已高达3-4万人。甲状腺肿瘤可以分为良性肿瘤和恶性肿瘤两类。绝大部分恶性甲状腺癌的发生来自滤泡上皮，少数可来自滤泡旁细胞，极少数来自甲状腺的间质。临床上常把甲状腺癌分为:乳头状癌、滤泡状癌、末分化癌和髓样癌四种。其中乳头状癌是最常见的种类，约占75%。临床上甲状腺肿瘤往往仅表现为甲状腺结节，因此常把甲状腺肿瘤与甲状腺结节相混。实际上结节仅是形态的描述，它包括肿瘤、囊肿、正常组织构成的团块以及其他疾病所引起的甲状腺肿块。临床上难以确定甲状腺结节的性质，即使病理活检，有时甲状腺腺瘤与结节性增生，良性肿瘤与恶性肿瘤也不易明确辨认。目前尚缺少标志物可用于甲状腺结节的良恶性的判断，也未见采用血液小分子代谢物图谱鉴别乳头状甲状腺癌、良性甲状腺结节或正常人的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血液小分子代谢物，并将其制作成图谱，用于鉴别乳头状甲状腺癌、良性甲状腺肿及正常人。本发明根据代谢组学这一系统生物医学领域新的理论及方法体系，建立一种由血液中有限个数的小分子代谢物组成的特征图谱及其制作方法。本发明提供了一种血液小分子代谢物特征图谱，其制作方法如下。本发明是从正常人、单纯性甲状腺肿和乳头状甲状腺癌的3组样本的血清中以代谢组学的方法筛选出可用于甲状腺结节良恶性诊断的代谢标志物组，构成肝癌诊断代谢物P曰。其中，血液代谢物获取方法如下:I)获取研究对象血液样本。血样为清晨餐前空腹血液，采集后于4°C静置半小时、9000g条件下离心15分钟取上清后立即储存于-80°C的冰箱中备用。2)血样预处理将样品室温解冻。取50 μ L血样加入200 μ L乙腈，剧烈震荡后于4°C静置10分钟，然后在4°C下以15000g离心10分钟，取上清4μ L进样。3)样本分析色谱分析采用的是安捷伦1200系列快速分辨液相色谱，液相色谱柱采用的是C18柱，质谱分析采用的是安捷伦6510四极杆-飞行时间质谱。4)血液小分子代谢物轮廓获取利用软件从原始数据中提取化合物信息，计算准确分子量并做色谱峰匹配。匹配后的数据经过归一化以减少系统误差。用于甲状腺癌良恶性诊断的小分子代谢物谱的筛选过程如下:通过病理诊断明确的甲状腺良性结节和恶性乳头状甲状腺癌以及正常人的各组，以统计学方法，如多因素方差分析、Z值等寻找特异性代谢物，筛选乳头状甲状腺癌同良性甲状腺结节以及正常组人具有显著差异的代谢物。对于差异代谢物进行进一步的过滤，以采取尽可能少的代谢物，达到更好效果为前提，最终确认2个代谢物的比值构成肝癌诊断代谢物特征谱。本发明提供了 2个血液代谢标志物，即棕榈酰卡尼汀和卡尼汀2个血液代谢标志物，它们的分子量分别为:400.2634和161.20，质谱上检测到的对应离子分别是:404.5532和 160.7866。本发明还提供了上述血液小分子代谢物特征图谱用于鉴别乳头状甲状腺癌、良性甲状腺结节或正常人。经临床实验表明，本发明的图谱甲状腺癌判定的准确率为74%，非癌(良性甲状腺肿和正常人)判定的准确率为72.3%。本发明的应用具有高灵敏度、高通量的优点，弥补了现在临床上缺少非侵入性的甲状腺结节的良恶性诊断方法的不足，适用于甲状腺癌的筛查和辅助诊断。本方法具有良好的扩展性，可以通过加入新的代谢标志物提高相应的判断能力。本方法同时适用于其它疾病早期诊断标志物的开发，同时，发现的标志物具有开发成为诊断试剂盒的前景。
图1为本发明小分子代谢物谱型在区分甲状腺结节、乳头状甲状腺癌和正常人的分析图。图2为本发明小分子代谢物图谱在鉴别乳头状甲状腺癌与单纯性甲状腺肿及正常人中的应用。Control组包括50例正常人血清样本，cyst组包括68例单纯性甲状腺肿血清样本，cancer组为40例乳头状甲状腺癌血清样本。其中C16即为棕榈�？嵬。珻O为卡尼汀。
具体实施例方式现结合实施例和附图对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例1:从正常人、单纯性甲状腺结节以及乳头状甲状腺癌共3组血清样本中筛选可用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的代谢物图谱。1、血清样本采集与处理研究对象主要为因甲状腺结节肿，首次入院经手术切除后病理诊断分别为单纯性甲状腺结节和乳头状甲状腺癌的两组病人。该两组入院后未进行任何治疗的第二天清晨，空腹静脉抽取血样。另一组研究对象为年龄和性别与上述两组类似的正常体检人员的血样。以上血样按常规方法制备血清。血清样品预处理:血清样品保存于-80°C冰箱内至分析前。乳头状甲状腺组40例，单纯性甲状腺结节组68例，正常对照组50例。分析前，将样品从冰箱取出，室温解冻。分别取50 μ L血清加入200 μ L乙腈，剧烈震荡后与4°C静置10分钟，然后在4°C下以15000g离心10分钟，取上清4μ L进样。2、血清代谢轮廓分析方法2.1液相色谱质谱分析(I)色谱条件:采用的是安捷伦1200系列快速分辨液相色谱，规格为IOcmX 2.1mm1.8ym ZORBAX TM SB-AQ C18，柱温度50°C。流动相A是含有0.1 %甲酸的水，流动相B为乙腈。洗脱梯度为2% B起始，保持1.5分钟后在4分钟内升至30%，随即在25分钟达到100%。保持4分钟后进行柱平衡5分钟。流量为0.4mL/min。进样量为4 μ L。(2)质谱条件:质谱条件为:质谱分析采用的是安捷伦6510四极杆-飞行时间质谱。质谱在正离子模式下进行数据采集。质谱毛细管电压设为4000V，干燥气流量为IlL/min,温度为35CTC。喷雾压力设为45psig。Fragmentor电压和skimmer电压分别设为230V和65V。嘌呤和六膦嗪(hexakis phosphazine)的混合物作为校正液用来保持质量数测量的精度以及稳定性。在正离子模式下它们分别产生质荷比为121.0508以及922.0097的离子。数据采集范围是质荷比80-1000，以质心模式采集。采集速率为500毫秒。在进行自动二级质谱分析的时候，碰撞电压分别设为IOV以及30V。3、代谢组数据预处理利用软件从原始数据中提取化合物信息，计算准确分子量并做色谱峰匹配。匹配后的数据经过下列归一化过程以减少系统误差:首先，将所有O值设为0.01，然后将数据以中心值进行归一化，对于质量数则采用所有测量的均值。缺失值的处理上采用分类80%原贝U，即当一个离子在80%的某一类样品里都不为零时，才能够被采用。4、代谢物组的筛选针对所有的代谢物，首先通过ANOVA的方法筛选出组间存在显著差异的代谢物，并过滤掉组内差异大于组间差异的代谢物。然后将数据倒入SIMCA-P软件进行分析，根据变量重要性分析的结果，找到各组间差异最大的离子，并进行等级聚类分析，确保不将来自于同一代谢物的离子重复选入。最终，选择了 2种代谢物的比值用于鉴别诊断乳头状甲状腺癌、单纯性甲状腺结节以及正常人。2种代谢物包括:棕榈�？嵬『涂嵬 �
5、诊断代谢物组用于血清样本的判定通过所述代谢物比值，以SPSS软件进行判别分析，对乳头状甲状腺癌，单纯性甲状腺结节以及正常人进行判断。结果这组代谢物对乳头状甲状腺癌的判定的准确率为74%，单纯性甲状腺结节以及正常人的准确率为72.3%。结果表明，I棕榈�？嵬『涂嵬〈晃镒榈谋戎的芄唤虾玫亩约鬃聪俳峤诘牧级裥越屑鹫锒�。
权利要求
1.一种血液小分子代谢物特征图谱，其特征在于所述的血液小分子代谢物为棕榈�？嵬『涂嵬×礁鲅捍槐曛疚铮堑姆肿恿糠直鹞�:400.2634和161.20，质谱上检测到的对应离子分别是:404.5532和160.7866。
2.一种如权利要求1所述血液小分子代谢物特征图谱的制作方法，包括如下步骤: A、将棕榈�？嵬『涂嵬。直鸩捎肙bitrap，正离子模式下采集代谢物浓度信息； B、采用反相色谱柱进行小分子代谢物分离分析； C、所获取的代谢组信息通过归一化的方法减少样本分析过程中的误差，从而获取代谢物的相对浓度信息； D、根据血液代谢物组分的相对浓度值，通过二元逻辑回归的方法判断代谢物谱的变化趋势，构成代谢物谱型。
3.—种如权利要求1所述血液小分子代谢物特征图谱在制备鉴别乳头状甲状腺癌、良性甲状腺肿及正常人诊断试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及医学诊断学技术领域，甲状腺肿瘤可以分为良性肿瘤和恶性肿瘤两类。临床上难以确定甲状腺结节的性质，即使病理活检，有时甲状腺腺瘤与结节性增生，良性肿瘤与恶性肿瘤也不易明确辨认。本发明提供一种用于鉴别乳头状甲状腺癌、良性甲状腺肿和正常人的血液小分子代谢物特征谱图及其制作方法。所述的小分子代谢物为2个血液代谢标志物，即棕榈�？嵬『涂嵬。堑姆肿恿糠直鹞�400.2634和161.20，质谱上检测到的对应离子分别是404.5532和160.7866。临床实验表明，由上述两代谢小分子的比值构成的图谱应用于甲状腺癌判定的准确率为74％，非癌(良性甲状腺肿和正常人)判定的准确率为72.3％。本发明具有高灵敏度的优点，可以制备成诊断试剂盒，用于甲状腺癌的筛查和辅助诊断。
文档编号G01N30/89GK103175935SQ20111044108
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者姚真真, 焦炳华, 苏东玮, 施俊义, 王梁华, 程令涛, 逄志骏 申请人:中国人民解放军第二军医大学
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