专利名称：重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法
技术领域：
本发明涉及重金属镉多克隆抗体的制备以及基于抗体的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)。
技术背景由重金属造成的污染称为重金属污染，目前对环境污染最严重的重金属为 铅、镉、汞、铬和砷，简称为"五毒"。重金属进入人体后，不易排泄，逐渐蓄积， 当超过人体的生理负荷时，就会引起生理功能改变，导致急、慢性疾病或产生远 期危害。近年来随着我国经济的迅猛发展，越来越多的环境突发事故频繁发生， 其中主要的一类污染物即为重金属污染物，尤其是食物中毒、饮水中毒、水体突 发污染事故等。因此，建立快速便捷的重金属检测方法，对重金属污染进行长期 监测，对控制污染，保护环境和人类生命安全与健康具有十分重要的意义。当前，国际上对重金属检测的发展方向是灵敏、准确、实时、快速、选择性 好和适用范围广等。而传统的重金属检测技术大多需要大型或专门仪器(原子吸 收光谱法、原子发射光谱法等)才能完成，且前处理过程复杂，耗时较多，分析 工作只能在室内进行，难以满足高通量快速和在线检测的需要。免疫学检测方法 是利用抗原与抗体的特异性结合作用来选择性识别和测定可以作为抗体或抗原 的待测物。它是免疫学长期发展的一个重要分支，具有检测速度快、费用低廉、 仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等优点。己广泛应用于临床医学、生命科学 以及环境中有机有毒物质的检测。同时，也为重金属的检测提供了新的思路，对 传统的重金属检测方法进行了有效的补充。自从1985年Reardan等人在Nature上发表文章，首次通过金属-螯合剂制备 单克隆抗体以来，国外对于重金属免疫学检测方法的研究越来越多，至目前为止， Cd2+、 Co2+、 U6+、 Pb2+、 Cu2+、 Hg2+、 Zn2+和ln3+金属-螯合剂复合物抗体被研 制出来，并建立了相应的酶联免疫检测方法。专利CN1769893公开了一种重金 属Pb"完全抗原的制备方法，朱晓霞等制备了镉，铅的单克隆抗体，并建立了相 应的酶联免疫检测方法。上述方法均是基于重金属单克隆抗体进行的研究。目前，对重金属免疫检测的研究大多集中在单克隆抗体及相应酶联免疫检测方法方面， 对多克隆抗体研究相对较少。单克隆抗体的制备相对多克隆抗体而言制备成本 高，周期更长，风险大。虽然在特异性方面较多克隆抗体稍高，但就建立的检测 方法来说，多克隆抗体亦能达到检测的要求，且方法的检测限与灵敏度与基于单 克隆抗体的检测方法接近。文献检索表明，国外只有David K. Johnson在1999年以四乙二胺五乙酸酸酐 为螯合剂制备了镉多克隆抗体，采用荧光偏振免疫法对镉进行检测(Johnson, D.K., A fluorescence polarization immunoassay for cadmium(ll). Analytics ChimicaActa, 1999. 399: p. 161-172)。发明内容1. 发明要解决的技术问题针对现有的重金属镉免疫学检测方法存在的问题，本发明提供了重金属镉多 克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法，制备一种重金属镉的多克隆抗体，并 通过抗体抗原反应，建立一种用于重金属镉检测的酶联免疫吸附测定方法，用于 环境水样的快速检测。2. 技术方案本发明的原理制备重金属镉的多克隆抗体，并建立了一种间接竞争酶联免 疫吸附测定方法(CI-ELISA)。重金属的免疫学检测方法的关键在于抗重金属抗 体的制备，包括多克隆抗体和单克隆抗体，而抗体制备的关键又在于重金属免疫 原的制备。重金属镉多克隆抗体制备与间接竞争酶联免疫吸附测定方法的基本原 理是通过选择性双功能螯合剂的一端与重金属螯合生成重金属-螯合剂复合物，作为半抗原，半抗原再通过螯合剂的另一端与载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、 卵清白蛋白(OVA)等偶联后形成重金属-螯合剂-蛋白完全抗原(免疫原和包被 原)。以免疫原免疫新西兰大白兔，获得多克隆抗体。CI-ELISA的基础是抗原的 固相化及抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原仍保持其免疫学活性，酶标 记的抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，可溶性抗原包被酶 标板，加入系列浓度的待测物的标准溶液与抗体等体积混合孵育后的混合溶液， 混合溶液中的待测抗原与固相载体表面的抗原竞争抗体表面的结合位点。再加入酶标记的抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与混合溶液 中待测物标准溶液的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为 有色产物，产物的量与混合溶液中待测物标准溶液的量直接相关，故可根据呈色 的深浅进行定性或定量分析。抗原制备反应方程式为本发明的具体技术方案如下 重金属镉多克隆抗体的制备方法，其步骤包括(A) 完全抗原的合成，完全抗原的合成是多克隆抗体制备的关键，以1-(4-异硫氰基苯甲基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)作为双功能螯合剂，采用异硫氰酯法 和重金属与载体蛋白偶联，获得完全抗原，包括免疫原Cd-ITCBE-BSA和包被 原Cd-ITCBE-OVA;(B) 抗体的制备，以免疫原Cd-ITCBE-BSA，选取三只1.5-2.0kg的纯种雄性新西兰大白兔作为试验动物，试验前一周采集阴性血清，常规免疫方法对大 白兔进行免疫，免疫约3个月后心脏采血，制备血清，用间接非竞争ELISA法 测定抗体效价，间接竞争ELISA法鉴定其对金属镉的特异性，血清添加终浓度 为0.01%的硫柳荥，分装后于一20'C冻存，即得到重金属镉的多克隆抗体。步骤(A)中采用紫外吸收法对完全抗原进行全波扫描，以确定抗原是否合 成功。对完全抗原中蛋白含量与重金属镉的含量进行测定，分别采用考马斯靓蓝 法和火焰原子吸收分光光度法。酶联免疫吸附测定方法，其步骤包括(1) 采用方阵滴定法确定包被原Cd-ITCBE-OVA与抗体最佳反应浓度，以 最佳浓度的包被原Cd-ITCBE-OVA包被96孔酶标板；(2) 用含EDTA的PBS溶液配制镉标准溶液，与等体积的1/2最佳工作浓 度的抗体混合，作为反应液加入酶标板中进行间接竞争酶联免疫吸附测定试验；(3) 考察螯合剂EDTA及其浓度、盐离子强度、pH值、封闭液和预混时间对CI-ELISA的影响，优化反应条件；(4)在已优化的反应条件下，建立CI-ELISA，绘制标准抑制曲线。对方法的检测限，检测范围，精密度和准确度、与其他金属如Pl)S+、 Ni2+、 Mg2+、 Ca2+、 Cu2+、 Mn2+、 Zn2+、 Co2+、 Cr3+、 Hg"和Fe3+的交叉反应率等进 行分析；以建立的方法对自来水、长江水进行加标回收实验。3.有益效果本发明提供了重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法，在制备 了重金属镉多克隆抗体的基础上，建立了测定环境水样中镉含量的间接竞争酶联 免疫吸附测定方法。本发明的检测限为0.04|jg/L，线性范围为1(T1~103|jg/L， 对镉具有特异性，与Pb2+、 Ni2+、 Mg2+、 Ca2+、 Cu2+、 Mn2+、 Zn2+、 Co2+、 Cr3+、 和Fe"的交叉反应率低于1%，与Hg"交叉反应率为7.4%;加标回收率在 85.5%~116.3%之间。本方法适合环境水样中痕量镉的测定。同时为重金属污染 突发事故的现场快速检测提供技术支持，便于及时对污染事故进行补救和恢复工 作，且可以发展成为环境中其他样品和农产品食品安全检测的重要检测手段，具 有重大的现实意义。
具体实施方式
以下通过实例进一步说明本发明。实施例1抗体的制备步骤1:完全抗原的合成称取10mg ITCBE溶于10mL pH 9.5的磷酸钠缓冲溶液中形成2.275 mM 的金属螯合剂溶液。称取40 mg BSA蛋白溶于pH 7.4 PBS( 137mM NaCI, 3mM KCI， 8mM Na2HP04, 1mM KH2P04)缓冲溶液中形成40 mg/mL的蛋白溶液。 镉(99.999%)溶于热的硝酸中，稀释成4.7mM的使用液。取2.5 mL ITCBE与1.5 mL4.7mM镉使用液反应，得到CcMTCBE复合物。 复合物逐滴滴加至1 mL40 mg/mL BSA蛋白溶液中。反应液在缓慢搅拌下室温 反应24小时后装入EDTA预处理过的透析袋中，PBS缓冲液透析三次，纯水透 析二次，4X:下透析三天，以去除未反应的Cd， ITCBE以及Cd-ITCBE复合物。准确量取透析液，透析液即为免疫原Cd-ITCBE-BSA，低温下保存。相同方法 制备包被原Cd-ITCBE-OVA。紫外分光光度计检测结合物中蛋白的含量。原子吸收法测定其中镉含量。紫 外分光光度计扫描透析液，对偶联物进行分析鉴定。结果表明成功合成了完全抗原。紫外分光光度计检测结合物中蛋白的含量。取0.5mL抗原于比色管中，加 入3.5mL的蒸馏水。采用标准曲线法进行测定。样品的。原子吸收光度法测抗 原中Cd离子含量。免疫原Cd-ITCBE-BSA中蛋白浓度浓度为7.024 mg/mL, 镉浓度为62.49 ppm;包被原Cd-ITCBE-OVA中蛋白浓度浓度为5.27 mg/mL， 镉浓度为8.866 ppm。步骤2:抗体的制备与鉴定Cd-ITCBE-BSA作为免疫原，选取三只1.5-2.0 kg的纯种雄性新西兰大白兔 作为试验动物，试验前一周采集阴性血清。具体免疫程序如下首免采用每只1 mg免疫原与等体积弗氏完全佐剂混和，乳化成油包水结构后进行背部皮下多点 注射(20点左右)。三周后用同样剂量的免疫原与等体积不完全弗氏佐剂进行加 强。此后每隔两周加强一次，加强后一周耳缘静脉采血测效价。最后一次用等体 积的生理盐水稀释免疫原，直接耳缘静脉注射。8天后心脏采血，制备血清，添 加重量百分比浓度为0.01 %的硫柳汞，分装后于一20 'c冻存。通过间接elisa(i-elisa)法测抗体效价，以此确定是否有针对金属离子的抗 体生成。比较三只大白兔的效价，最后选择抗体效价较高的白兔血清用于建立 ci-elisa检测方法。间接非竞争ELISA(I-ELISA)法操作步骤(1)包被，100jjL/孔，4'c过夜，洗涤3次，拍干；(2)封闭，200 pL/ 孔，37'c孵育1 h，洗涤3次，拍干；(3)加入抗血清(分别稀释成4000、 8000、 12000、 20000、 30000、 40000倍)100 ijL/孔，37。c孵育2h,洗涤3次，拍 干；(4)加入羊抗兔酶标二抗(1: 10000稀释)37'c孵育1h,洗涤3次，拍干； (5)加显色液37。c作用15min。 (6) 50pL/孔浓度为2M的硫酸溶液终止显色 反应；(7)酶标仪测OD450值，以空白对照调零，以阴性血清作为对照，以待 测孔OD450值大于或等于阴性孔的2.1倍定为阳性。经测定后，抗体效价达到了 1:128x104，能进行酶联免疫吸附测定实验。 实施例2:酶联免疫吸附测定方法步骤一效价的测定采用方阵滴定法来确定抗原抗体最佳工作浓度包被抗原(Cd-ITCBE-OVA) 系列稀释为1500倍、2500倍、5000倍、10000倍包被酶标板的AB， CD， EF， GH行；用1%0VA作为封闭液；抗血清分别稀释为20000倍、40000倍、80000 倍、160000、 320000倍和640000倍，加入酶标板的1 2， 3 4， 5 6， 7 8, 910， 11 12列；加羊抗兔-辣根过氧化物酶酶标二抗(1: 10000， 1。/。0VA稀释)；TMB 显色，2M硫酸终止，测OD450值。以OD450值为0.8~1.2的抗原抗体浓度作 为最佳工作浓度。最后确定最佳包被原Cd-ITCBE-OVA与抗体浓度分别为1.05 |jg/mL和1:30x104。步骤二 ELISA方法的建立在包被原与抗体的最佳工作浓度条件下，用间接竞争ELISA法(CI-ELISA) 建立抗体对重金属镉的检测方法。用1.0mMEDTA的PBS溶液配制浓度为0.00， 0.10， 1.00， 10.00, 100,00， 1000.00pg/mL的镉标准溶液，与抗体混合过夜 进行前抑制。绘制标准抑制曲线，并计算敏感度(IC50)及最低检测限(IC20)。间接竞争ELISA法的步骤如下(1) 抗体与标样(待测样)预混用PBS稀释抗体到两倍工作浓度(如工 作浓度1:10000，应稀释为1:5000)后与等体积标样(待测样品)室温预混。(2) 包被CBS包被缓冲液将包被原稀释到工作浓度，分别加入96孔酶 标板的ab、 cd、 ef、 gh八行，100ijL/孔，4。c过夜。(3) 封闭每孔加封闭液200ML, 37'c温浴1h。(4) 加样品将预混液体加入酶标板，100ijL/孔，于37X:温浴2h。(5) 加酶标二抗用封闭液将酶标二抗稀释到工作浓度，100jjL/孔加入醇 标板，37。c温浴1h。(以上每一步结束都用洗涤液洗3次)(6) 显色底物溶液100ML/孔加到酶标板，显色15min。(7)终止反应50pL/孔2M H2S04快速加到酶标板，450nm下读取吸光值。步骤三条件优化改变金属标液稀释缓冲液中EDTA浓度，使反应体系中EDTA浓度分别为 0.1mM， 0.5mM， 1.0mM， 5.0Mm， 20mM， 20.0mM， 50.0mM，比较不同EDTA 浓度对阳性血清的抑制作用。竞争ELISA反应中，在抗原抗体最佳工作浓度的条件下，改变基质中盐离 子强度，使反应体系中NaCI的浓度依次为0M、 0.05M、 0.15M、 0.5M、 1.0M 比较不同离子强度对ELISA检测曲线的影响。封闭液的作用是消除非特异性吸附。竞争ELISA反应中，在抗原抗体最佳 工作浓度及最适盐离子强度的条件下，本发明分别采用了 1%明胶、1%0VA、 及3%脱脂奶粉作为封闭液(200yL/孔)，比较其对检测曲线的影响。竞争ELISA反应中，在抗原抗体最佳工作浓度、最适盐离子强度及最佳封 闭物封闭的条件下，通过改变反应基质中的pH值来反映对竞争ELISA结果的 影响。反应体系中pH值分别取5.7、 6.5、 7.4、 8.5，比较不同pH值对ELISA 检测曲线的影响。在间接竞争ELISA反应中，设定金属标液与阳性血清的预混时间为室温过 夜和室温1小时，比较其对抑制曲线的影响。 步骤四方法评价通过对对间接竞争ELISA方法最佳条件的确定，本发明以1: 5000 (蛋白 浓度为1.05叩/mL)的包被原包被96孔酶标板，以1%明胶作为封闭液。抗体 浓度为1: 300000。抗原抗体反应体系中螯合剂EDTA浓度选择为1.0mM， pH 值为7.4，离子强度为0.15M NaCI。抗体与标液的预混时间为1小时。作为最 佳反应条件。在最佳工作条件下，得到了抑制曲线，抑制中浓度IC50为33.0ppb， IC20为2,7ppb， R2为0.9976。以Logit (B/BO)为纵坐标(Y)，才。(12+浓度 (ppb)的负对数值为横坐标(X)，做标准曲线。Cd"在0.1ppb-1000ppb范围 内，Logit (B/BO)与CcP浓度(ppb)的对数值呈显著的线性关系，得到回归 方程Y = 0.6834X + 0.4107，相关系数达0.998。在以上最佳反应条件下，进行方法特异性实验。配制其他金属如Pb2+、 Ni2+、Mg2+、 Ca2+、 Cu2+、 Mn2+、 Zn2+、 Co2+、 Cr3+、 Hg2+和Fe3+的标准溶液，实验 操作同步骤二。与Pb"、 Ni2+、 Mg2+、 Ca2+、 Cu2+、 Mn2+、 Zn2+、 Co2+、 Cp+、 Fe"的交叉反应率低于1%，与Hg^交叉反应率为7.4%。抗体对金属镉具有很有 的特异性。取自来水和长江水进行加标回收率实验，根据步骤三中确定的最佳条件下进 行试验，操作过程同步骤二。自来水和长江水的加标回收率分别为103.5% 116.3%和85.5% 112.5%。
权利要求
1.一种重金属镉多克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤(A)抗原的合成，以1-(4-异硫氰基苯甲基)-乙二胺四乙酸作为双功能螯合剂，采用异硫氰酯法和重金属镉与载体蛋白偶联，获得完全抗原，包括免疫原Cd-ITCBE-BSA和包被原Cd-ITCBE-OVA；(B)抗体的制备与鉴定，以免疫原Cd-ITCBE-BSA，选取三只1.5-2.0kg的纯种雄性新西兰大白兔作为试验动物，试验前一周采集阴性血清，常规免疫方法对大白兔进行免疫，免疫3个月后心脏采血，制备血清，用间接非竞争ELISA法测定抗体效价，间接竞争ELISA法鉴定其对金属镉的特异性，血清添加浓度为0.01％的硫柳汞，分装后于-20℃冻存，即得到重金属镉的多克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的重金属镉多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的 步骤(A)抗原的合成中采用紫外吸收法对完全抗原进行全波扫描，以确定 抗原是否合成功。
3. 根据权利要求1所述的重金属镉多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的 步骤(A)抗原的合成中分别采用考马斯靓蓝法和火焰原子吸收分光光度法 对完全抗原中蛋白含量与重金属镉的含量进行测定。
4. 一种酶联免疫吸附测定方法，其步骤包括(1) 采用方阵滴定法确定包被原Cd-ITCBE-OVA与抗体的最佳反应浓度， 以最佳浓度的包被原Cd-ITCBE-OVA包被96孔酶标板；(2) 用含EDTA的PBS溶液配制镉标准溶液，与等体积的1/2最佳工作浓 度的抗体混合，作为反应液加入酶标板中进行间接竞争酶联免疫吸附测定试 验；(3) 考察螯合剂EDTA及其浓度、盐离子强度、pH值、封闭液、预混时 间对CI-ELISA的影响，优化反应条件；(4) 在已优化的反应条件下，建立CI-ELISA，绘制标准抑制曲线。
5. 根据权利要求4所述的酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在抗原抗体反应 体系中螯合剂EDTA浓度为1.0mM，离子强度为0.15M NaCI，基质及待测 液pH值为7.4，以1%明胶为封闭液、抗体与标液的预混时间为1小时的最 佳反应条件下进行，获得竞争抑制标准曲线。
全文摘要
本发明公开了重金属镉多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定方法。其中重金属镉多克隆抗体的制备方法，步骤包括(A)完全抗原的合成，完全抗原的合成是多克隆抗体制备的关键；(B)抗体的制备。酶联免疫吸附测定方法步骤包括(1)采用方阵滴定法确定包被原Cd-ITCBE-OVA与抗体最佳反应浓度，以最佳浓度的包被原Cd-ITCBE-OVA包被96孔酶标板；(2)间接竞争酶联免疫吸附测定试验；(3)考察各种条件对CI-ELISA的影响，优化反应条件；(4)在已优化的反应条件下，建立CI-ELISA，绘制标准抑制曲线。本发明的检测限为0.04μg/L，线性范围为10<sup>-1</sup>～10<sup>3</sup>μg/L，对镉具有特异性，适合环境水样中痕量镉的测定。同时为重金属污染突发事故的现场快速检测提供技术支持，便于及时对污染事故进行补救和恢复工作。
文档编号G01N33/53GK101240023SQ200810019780
公开日2008年8月13日 申请日期2008年3月14日 优先权日2008年3月14日
发明者欢 何, 刘振宇, 刘贤进, 成 孙, 川 张, 杨绍贵, 成 陈 申请人:南京大学
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