专利名称：针对ha基因检测甲型h1n1流感病毒2009变异株的核苷酸序列和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对HA基因检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)的核苷酸序列和 试剂盒，尤指快速的基于LNA修饰的短探针荧光RT-PCR针对HA基因检测甲型Hmi流感病 毒(2009变异株)的核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于不同动物组织样本中甲型Hmi流感 病毒(2009变异株)的准确检测，还可适用于不同动物活体样本(主要为拭子样品)的甲 型Hmi流感病毒(2009变异株)的检测，可用于动物甲型Hmi流感病毒(2009变异株) 的筛查，出入境检疫等，属于检验检疫领域。
背景技术：
2009年4月由墨西哥开始的甲型Hmi流感疫情造成了全球大流行。对该病毒的 序列进化分析显示，该病毒为一个新型甲型流感变异株，与人季节性Hmi流感病毒和经典 Hmi猪流感病毒，存在明显差异。序列分析显示它的8个基因片段具有明显特殊性。但其 HA片段与北美猪流感病毒HA片段同源性最高，为95%左右；NA和M为欧亚猪源病毒片段 最为相近，同源性分别为92%和97%。因此为在实际的诊断与检测中，采用核酸扩增方法 进行鉴别时，必须进行仔细的序列比对分析。目前研究已经证明该毒株可自然感染猪和犬等多种哺乳动物。2009年5月3日加 拿大报道，加西部艾伯塔省一猪场的猪身上检测出这种Hmi流感病毒，此后很多学者又从 犬、猫等动物体内检出该病原。由上可知该病毒的跨物种传播能力较强。目前新型的核酸扩增检测方法发展快速，由于其简便快捷，结果准确，已经在临床 检疫中广泛应用，取得了良好的效果，目前已有替代传统检测方法的趋势。尽管在甲型Hmi 流感暴发后，国内外很多学者研究建立了荧光RT-PCR检测方法用于检测甲型Hmi流感病 毒(2009变异株)流感病毒。我们在针对M目标基因建立甲型Hmi流感病毒(2009变异 株)荧光RT-PCR检测方法后，针对HA基因采用可提高探针特异性的LNA修饰短探针建立 了针对HA基因检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)荧光RT-PCR检测方法。LNA，又名 锁核酸，作为一种新颖的核苷酸衍生物在生物学研究领域引起了人们的广泛关注，它是一 种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2' -0,4' -C-亚甲基-β-D-呋喃 核糖核酸单体，核糖的2' -0位和4' -C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲 基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了 核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。对DNA、RNA有很好的识别能力 和强大的亲和力。LNA和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性(Δ Tm = 3 8°C )，具有 抗3 ’脱氧核苷酸酶降解的稳定性，合成方法相对简单，部分或完全修饰的LNA寡核酸链可 用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成。本研究为保证方法的特异性，保证探针的匹配性，我们在大量序列分析基础上，在 国内首次设计LNA修饰的短探针针对HA基因用于检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)， 缩短了探针的核苷酸数量，并提高了方法的特异性和灵敏度。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的针对HA基因检测甲型 HlNl流感病毒2009变异株的核苷酸序列，包括引物序列和基于LNA修饰的短探针序列。本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的基于LNA修饰的针对HA基因 检测甲型Hmi流感病毒2009变异株检测试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案选择甲型Hmi流感病毒(2009变异株)的HA基因核苷酸序列与其他A型流感病 毒HA基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。 引物长度为20个碱基左右，GC含量为50% -60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和 引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5°C。探针的长度为17个碱基左 右，采用LNA修饰，并标记荧光基团。一组针对HA基因检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)核苷酸序列，如下1)5，-AGA CAA AAT AAC ATT CGA AGC AAC TGG-3 ‘ (SEQ ID NO 1)2)5，-ATC GTG GAC TGG TGT ATC TGA AAT GAT AAT—3，(SEQ ID NO 2)3)5，-[FAM]-CAT TTC TTT CCA TT GCG_[TAMRA 或 BHQ1]_3，(SEQ ID NO 3)其中序列1)和2)分别为检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)HA基因的正义 引物和反义引物，序列3)为检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)HA基因的LNA修饰的 荧光短探针，用斜体表示的碱基用LNA进行修饰，即第4、7、10、13、15位的碱基用LNA进行 修饰，探针的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carb0Xy-荧光素)，3’端标记淬灭基团TAMRA 或BHQl。我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了甲型Hmi流感病毒(2009变异株) HA基因检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛�。琈g2+使用浓度 的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)HA基因的LNA修饰短探针检测试剂盒，由 以下组分组成1)裂解液购自INVITR0GEN公司，按15ml/瓶进行分装，2瓶/盒。2) RT-PCR反应液，表1为反应液配方。表IRT-PCR反应液配方组分终浓度5 X RT-缓冲液0.5 X RT-缓冲液IOXPCR缓冲液0.5 X PCFUl 冲液25mM MgCl22.0mmol/L MgCl22.5mM dNTP0.2mmol/L dNTP正义引物0.3 μηιοΙ/L反义引物0.3 μηιοΙ/L甲型HlNl流感病毒(2009变异株)HA基因LNA 短探针0.1 μιηοΙ/L10XPCR 缓冲液、25mM MgC12 购于 Promega 公司；5XRT-缓冲液，2. 5mM dNTP 购 自大连宝生物生物工程有限公司，引物和探针均委托大连宝生物生物工程有限公司合成， 其中 10 XPCR 缓冲液的组成为500mmol/L KC1、100mmol/L Tris-HCl (pH9. O, 25°C ) >1. O% Triton X-100。5XRT-缓冲液组成为 375mmol/L KCl、15mmol/L MgCl2、50mmol/L DTT, 250mmol/L Tris-HCl(pH8. 3，25°C )。3) RT-PCR酶颗粒，购自AMERCIA公司，12粒/盒。4) Taq DNA 聚合酶 5U/ μ L，购自 Promega 公司。5)DEPC水，用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收 取电阻率彡18. ΟΜΩ.αιι的水，Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0. 1%，37°C搅拌 处理12hr，151bf/in2(1.034X105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。6)阴性对照流感病毒阴性组织样品，用0. Olmol/L pH7. 2PBS缓冲盐水制成20% 悬液，70°C作用1小时。7)阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段。将人工合成的甲型Hmi流感 病毒 A/California/04/2009 (HlNl)长度为 1701bp HA 基因克隆于 pET_32a，转化 JM109 感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为 pET-32a-HlNl/2009-HA。以纯化的质粒为模板，酶切线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用 DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备甲型Hmi流感病毒 (2009)HA基因阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。甲型 Hmi 流感病毒 A/California/04/2009 (HlNl) 1701bp HA 目的片段基因具有 序列表SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。对合成的引物和探针做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度 计测定0D260nm/0D280nm的比值在1. 6-2. O之间，即视为合格引物。分别以上述体外转 录后IO5拷贝数的RNA和经典猪流感病毒A/Swine/2003(H1N1)鸡胚尿囊液培养物中提取 的RNA为模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对与探针配合使用，可特异的扩增A/ California/04/2009 (HlNl) HA 基因 RNA，但不能扩增 A/Swine/2003 (HlNl) RNA。将筛选好的引物浓度从0. lymol/L至0. 8ymol/L以0. lymol/L为间距递增，探
5针浓度从0. 025 μ mol/L至0. 2 μ mol/L以0. 025 μ mol/L递增。对引物和探针不同浓度的 配比进行了比较，从多次重复试验中发现采用表1所列引物浓度和探针浓度时荧光增幅 相对较高。我们针对Roche Light Cycler2. 0，Roche480 以及 ABI 7900HT 荧光 PCR 检测仪， 在42°C /30min,94°C /3min的逆转录后，对该实验中对变性温度和时间、退火和延伸温度及 时间进行了优化实验。扩增时，采用循环次数分别为40、45和50，比较扩增结果的Ct值，进 而确定扩增的循环次数为40。最终确定采用扩增效果较好的方案为RT-PCR反应参数反 应条件为94°C /15s，52°C /5s,60°C /35s,40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。研究表明，Mg2+浓度对荧光PCR扩增结果有一定影响，故应用筛选好的引物探针， 将Mg2+的浓度从1. 5mmol/L至6. Ommol/L以0. 5mmol/L为间距递增，对不同Mg2+浓度条件 下的扩增进行了比较。优化后的Mg2+浓度为见表1。我们选择Promega公司生产的Taq酶，一单位的定义74°C作用30分钟，能将IOnM 的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求具DNA聚合酶活性及5’ 一 3’核酸 外切酶活性，无3’ 一 5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94°C 1小时后仍 保持50%活性。从多次重复试验结果中选定1. 25U Taq酶作为使用的Taq酶量。本发明所述针对HA基因检测甲型Hmi流感病毒2009变异株的检测试剂盒的使 用方法1)样品处理对于组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1. Og于研钵中充 分研磨，再加5mL PBS混勻，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。对于液 体样本，用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。采集或处理的样本在 2°C 8°C条件下保存应不超过24h ；若需长期保存，须放置-70°C冰箱，但应避免反复冻融 (最多冻融2次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。2) RNA的提取在样本处理区进行。取η个1. 5ml灭菌离心管(η =样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，作好标记。 首先加入600 μ L裂解液(裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量 清水冲洗并擦干)，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200 μ L ( —份样本换用 一个吸头)；再加入200 μ L氯仿，混勻器上振荡混勻5sec (不宜过于强烈，以免产生乳化 层，也可用手颠倒混勻)。12，00(^离心1511^11(如有条件，于41进行离心)。取与上步中相同数量的1. 5ml 灭菌离心管，加入400 μ L异丙醇(-20°c预冷)，作好标记。吸取离心后的上清液相转移至 相应的管中，颠倒混勻。12，OOOg离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在 吸水纸不同地方沾干)；加入600 μ L 75%乙醇(_20°C预冷)，颠倒洗涤。12，OOOg离心lOmin。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4，OOOg离 心lOsec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一 个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min (不宜过于干燥，以免RNA不溶)。加入IlyL DEPC水，轻轻混勻，溶解管壁上的RNA，2，OOOg离心5sec，冰上保存备 用(注意此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增)。3) RT-PCR扩增从试剂盒中取出RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2，OOOg离心5sec。设所需PCR管数为η (η =样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应 体系需要15 μ L RT-PCR反应液和0. 25 μ L Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体 积试管中，向其中加入η/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均勻，向每个PCR管中各分装15 μ L， 转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10 μ L，盖紧管盖，于 SOOg离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置94°C /15s，52°C /5s,60°C /35s，40个循环；每次循环的退火延伸 时收集荧光。4)结果的判定结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好 超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标 准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应<30.0，并出现特定的扩增曲线。 如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无甲型Hmi (2009变异株)流感病毒；阳性，Ct值< 30. 0， 且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在甲型Hmi (2009)流感病毒。本发明的优点是本发明选择甲型Hmi (2009变异株)流感病毒HA基因编码区作 为靶区域，设计兼并引物和LNA修饰短探针建立并优化了甲型Hmi (2009变异株)流感病 毒荧光RT-PCR检测方法，取得了优异的技术效果1)快速该方法对PCR产物进行实时监 控，RT-PCR结束即可获得结果。2)更为灵敏由于采用了特异性的LNA修饰荧光探针，比普通TaqMan探针的灵敏 度更高，比常规的PCR方法灵敏度高100 1000倍；对已知拷贝数的体外转录RNA进行检 测。结果显示，灵敏度均可达10拷贝/反应，重复性更好。3)特异由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的 特异性高于传统RT-PCR方法；建立的荧光RT-PCR检测方法可特异性检测甲型Hmi (2009) 流感病毒，但不能检出经典猪Hmi流感病毒和人季节性Hmi流感病毒。此外，在检测所收 集的其他病毒以及新城疫病毒，结果为阴性，未发现交叉反应。5)稳定重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；对不同浓度的已知拷贝 数的cRNA进行重复性试验，结果见表2。表2重复性试验结果
权利要求
一组针对HA基因检测甲型H1N1流感病毒2009变异株的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3，其中序列SEQ ID NO1和SEQID NO2分别为检测甲型H1N1流感病毒2009变异株HA基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO3为检测甲型H1N1流感病毒2009变异株HA基因的LNA修饰的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的针对HA基因检测甲型Hmi流感病毒2009变异株的核苷酸 序列，其特征在于所述探针序列SEQ ID NO 3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬 灭荧光基团TAMRA或BHQ1，第4、7、10、13、15位的碱基用LNA进行修饰。
3.一种针对HA基因检测甲型Hmi流感病毒2009变异株的试剂盒，由以下组分组成1)裂解液；2)RT-PCR反应液，包括PCR缓冲液、RT缓冲液、MgCL2, dNTP、正义引物、反义引物和荧 光探针；3)RT-PCR酶颗粒；4)Taq DNA聚合酶；5)DEPC 水；6)阴性对照流感病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7. 2PBS缓冲盐水制成20%悬 液，70°C作用1小时；7)阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQID No. 4所示的核苷酸序列；其中，正义引物为序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQID No. 2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端标记 报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA或BHQ1，第4、7、10、13、15位的碱基用LNA 进行修饰。
4.根据权利要求3所述的针对HA基因检测甲型Hmi流感病毒2009变异株的试剂 盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液0. 5XPCR缓冲液、0. 5XRT缓冲液、2. Ommol/LMgCL2, 0. 2mmol/L dNTP、0. 3 μ mol/L 正义引物、0. 3 μ mol/L 反义引物和 0. 1 μ mol/L 荧光探针。
全文摘要
本发明公开了一组针对HA基因检测甲型H1N1流感病毒2009变异株的核苷酸序列和试剂盒。该H1N1流感病毒2009变异株的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为检测H1N1流感病毒2009变异株HA基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO3为检测H1N1流感病毒2009变异株HA基因的LNA修饰的荧光探针。本发明进一步公开了含有上述引物和探针的检测H1N1流感病毒2009变异株的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、通用性好、重复性好及不易污染的特点。
文档编号G01N21/64GK101962692SQ20101052699
公开日2011年2月2日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者乔彩霞, 刘环, 张伟, 张利峰, 张向东, 张鹤晓, 柏亚铎, 汪琳, 蒲静, 谷强, 高志强 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局
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