专利名称：用于侦测调节细胞里细胞成分活性的调节子的方法
技术领域：
本发明关于一种用于侦测一调节子的方法，该调节子能调节细胞里的一细胞成分的生物及/或生理的活性。特别是关于一种通过成像能显示沿着一磁力线的一方向的图样的标记，用于侦测参照品与调节子间，对于一细胞内的该细胞成分，是否存在竞争反应的方法。
背景技术：
一个细胞生物及/或生理的功能，通过各种细胞内的细胞成分而调节与维护，该细胞成分比如大分子，包括蛋白质、核酸、多糖与酯类，及小分子，包括氨基酸，核苷酸、磷酸、维生素、胺类化合物与其他有机化合物。当正常细胞成分生物及/或生理的功能被干扰 或抑制时，某些疾病会发生。通过使用生物技术和制药领域里的一种调节子，许多努力被用于恢复细胞的活动及治疗导因于细胞成分不正常功能的疾病。为了研发新的调节子，某些传统方法，比如体外结合试验、噬菌体显示技术(请见美国专利公开号第US2005/0009099A1号与第US2008/0058219A1号)或亲和层析技术(请见PCT公开号第WO 2006/134056A1号)已被广泛地使用。然而，在上述的传统方法中，人源性蛋白质必须被改良以允许其被表达于大肠杆菌中及自大肠杆菌中获得，而该改良的蛋白质通常小于原尺寸。因为人源性蛋白质是通过使用大肠杆菌系统而获得，该蛋白质的属性及功能可能异于真实的蛋白质的属性及功能。此外，传统的标靶导向药物筛选典型地执行在一个人工缓冲系统中，该人工缓冲系统使得一蛋白质标靶及一药物的反应异于真实细胞的活动。尤其，当传统方法中标靶蛋白质-药物交互作用是通过额外实验过程而间接确定，且该额外实验过程会导致假阳性的情况过高下，会是一个问题。此外，在传统方法里，结果高度依赖实验条件，比如细胞裂解液，用于药-蛋白质结合的结合缓冲液等等。因此，随着外部环境或肇因于实验步骤复杂性的技术错误而定，根据传统方法实验的再现性可能会下降。总之，可在体外执行的传统方法在药物开发时，具有预测一种药物在细胞内及/或体内的疗效的困难。因此，在既有技术里有对一种用以有效地筛选一调节子的方法的需要，该调节子通过其与该细胞成分结合，能调节在细胞里的一细胞成分生物及/或生理的活性。为了解决前述的传统方法的问题，本发明已开发了用以辨认调节子的一种方法。该调节子能通过比较有竞争力的反应以调节在细胞里的一细胞成分的生物及/或生理的活性，而该比较是介于一参照品(已知物质用于调节某细胞成分生物及/或生理的活性)与用于一细胞内的该细胞成分的发明的调节子间，通过成像能显示沿着一磁力线的一方向的图样的一标记而达成。
发明内容
本发明的主旨在通过成像在一磁力线方向上磁化之磁性物质的一磁性图样与结合至一细胞成分的一标记的图案，提供一种侦测一参照品与一调节子间，对于该细胞内的该细胞成分，是否存在竞争反应的方法。进一步，本发明的主旨在于提供一种用于侦测一调节子的方法，该调节子能调节一细胞成分生物及/或生理的活性。该方法能通过成像在一磁力线方向磁化的一磁性物质的磁性图样及结合至该细胞成分的一标记的图样，决定是否对于在一细胞内的该细胞成分，一参照品与一调节子间有竞争反应后，侦测一调节子。首先，使用于此的术语将解释如下术语“细胞成分”指的是任何生物的物质，其调节一细胞内生物及/或生理的活动。氨基酸、核苷酸、磷酸、维生素、胺类化合物与其他有机化合物，其可被视为体内关于疾病或生理的代谢之物。术语“调节子”指的是能正常化一细胞成分不正常的功能的一种物质，该细胞成分的正常生物及/或生理的功能在一细胞中被干扰或抑制了。它通常能正常化生理的代谢作 用且具有治疗某些疾病的潜能。例如药物的小分子、比如抗体的蛋白质、激素或生长因子、蛋白质结构域、蛋白质图案及肽都能作为一调节子。术语“参照品”指的是调节一细胞成分的某生物及/或生理的活性的任何已知物质，且如上所述般，对于该细胞成分，能与该调节子竞争。它也是一个强有力的已知物质以正常化该生理的代谢作用，或通过于体内正常化该细胞的代谢，治疗某疾病例如药物的小分子、比如抗体的蛋白质、激素或生长因子、蛋白质结构域、蛋白质图案及肽也能作为一参照品。术语“标记物质或标记”指的是一种物质，其是否能成像在该参照品与调节子间，对于细胞成分，有一种竞争反应，且能通过一图案可视化该竞争反应。它可包括放射性物质、荧光或发光材料。例如，荧光蛋白质，比如增强型绿色荧光蛋白质(GFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、青色荧光蛋白质(CFP)或红色荧光蛋白质(RFP)能被用于辨认该细胞成分的存在、位置与整体图样。同时，术语“表面改良”描述于此乃意味改良或变更一种物质表面以促成其与其他物质的结合，但不必受限改良而改变该物质的基本物性。举例而言，这表示，但不限于一抗原用以结合至一特别抗体或一受体以进行配体结合，该抗原是连接到比如一磁性物质的粒子表面。此外，术语“联合或联合的”描述于此乃意味直接或间接结合二物质。举例而言，这表示,但不限于当一粒子的表面通过一抗体或一受体而改良时,该抗原或受体在粒子的表面允许该粒子各别结合至对应于该抗原或配体的一抗体或配体。以下，本发明的构造将利用上述术语而描绘。在一实施例中，本发明提供一方法用以侦测一调节子，该调节子能调节在一细胞里的一细胞成分的生物及/或生理的活性，包含步骤准备复数个磁性物质，该复数个磁性物质通过一磁场在一磁力线的一方向上磁化，至少一磁性物质被配置进一奈米粒子且该至少一磁性物质的表面是被改良的；联合能调节能该细胞成分的活性的一参照品与磁性物质，且接着引入该参照品与磁性物质至一细胞中，复数个与该参照品联合的磁性物质被引入至每一细胞中；联合被结合至该参照品的细胞成分与一标记，该标记能成像磁性物质的一图样，及提供该细胞成分与该标记至该细胞中；引入一调节子至该细胞中，该调节子被测试决定对于该细胞成分，是否其竞争得过该参照品；通过应用一磁场至该细胞，允许一束磁力线在一方向上通过该细胞；通过该应用的磁�。词鲈诟孟赴诘拇判晕镏视敫么帕ο叩姆较蚨云耄患氨嫒弦煌佳诟猛佳锔词龈么判晕镏识云敫么帕ο叩姆较颍案帽昙堑囊煌佳幢怀上竦耐佳�。在本发明的一个实施例里，该方法进一步包含辨认该磁性物质的成像图样与标记的成像图样，及是否该成像图样彼此共定位。在另一实施例中，本发明包含一方法，其中当对于结合至该细胞成分，该调节子可与参照品竞争时，该调节子结合至该细胞成分，且该磁性物质的成像图样不与标记的成像图样共定位。如果该成像图样不共定位，因此，它可以被视为调节子结合至细胞成分。在一进一步实施例里，本发明包含一方法，其中当对于结合至该细胞成分，该调节子无法与参照品竞争时，该参照品结合至该细胞成分，且该磁性物质的成像图样与标记的成像图样共定位。如果该成像图样共定位，因此，它可以被视为调节子无法结合至细胞成分。较佳的情况是该方法进一步包含将该参照品与磁性物质两者引入至一活细胞内，且接着将该参照品与磁性物质两者显露至该活细胞的细胞质中。更佳的情况是，在该参照品与磁性物质显露至该活细胞的细胞质前，该调节子可被引入该活细胞中。在一实施例中，本发明包含一方法，其中该细胞成分、参照品及/或调节子可包括大分子，比如蛋白质、核酸、多糖与酯类及小分子，比如氨基酸、核苷酸、磷酸、维生素、胺类化合物和其他有机化合物。在本发明的另一实施例里包含了一方法，如果该细胞成分该细胞成分具有一能结合至一细胞膜的特性，该方法能移除结合至该细胞膜的细胞成分的特性。在这种情况下，由该标记在应用一磁场后，磁性物质成像图样的失败情形能被避免，而失败可能是导因于固定至细胞膜的被标记的细胞成分。
在另一实施例中，本发明的方法包含如果该细胞成分为BLK、FGR、LYN、RC或YES I蛋白质，通过以丙氨酸替代该蛋白质的第二氨基酸、甘氨酸，移除该细胞成分能结合至该细胞膜的特性。此外，在本发明的另一个实施例里，如果该细胞成分是KIT蛋白质，该细胞成分能结合至该细胞膜的特性，能通过仅提供该KIT蛋白质之氨基酸的545至976区域至一活细胞而移除。在本发明的另一个实施例中，如果该细胞成分是ABLl蛋白质，该细胞成分能结合至该细胞膜的特性，能通过仅提供ABLl的催化区至一活细胞而移除。本发明能通过成像一磁性物质在一磁力线的方向的磁性图样及结合至该细胞成分的一标记的图样，侦测对于在细胞里的一细胞成分，是否在一参照品与调节子间有竞争反应，且它也能通过确定在一细胞内是否对于该细胞成分，该参照品与调节子间有竞争反应，而侦测一调节子，该调节子能调节细胞成分生物及/或生理的活性。根据本发明的方法，因为无须纯化或改良细胞成分，比如蛋白质，该细胞成分在细胞内具有其原始的形式及功能。此外，不似传统的筛选方法，其能通过使用纯化的细胞成分侦测药物疗效，本发明能监视一细胞成分的选择性以供在一细胞内的一调节子。这给予了一种好处能精确预测该调节子，比如一种药物，在人体内的反应。
此外，根据本发明的方法，因为细胞成分与该参照品及调节子，比如一种药物的反应是发生于一细胞里，对于该细胞成分，该参照品与调节子间的竞争反应能反映在一细胞内发生的真实代谢作用。本发明也允许在该细胞成分与调节子(比如一种药物)间，交互作用结果可为可视化及在一细胞里直接地被确认。此外，因为本方法使用在该参照品与调节子间，对于该细胞成分的竞争反应，该细胞成分与调节子间的交互作用结果能简易地被确认。举例而言，如果该磁性物质的成像图样成形，该细胞成分与调节子间的反应被确定为阴性，而如果该磁性物质的成像图样不能成形，该细胞成分与调节子间的反应被确定为阳性。这更进一步提供了使用一些参照品筛选许多调节子，及侦测该调节子在一细胞内的功能的好处，比方说，其功效无须通过引入该参照品而修改该调节子。
本发明的这些及其他对象和功能，对于参照下列图示，阅读且了解以下本发明较 佳实施例的详细描述，对本领域技术人员而言，将是显而易见的。第I图包含一不意图，显不辨认一小分子复合物(一反应竞争物)的观念，该复合物通过使用竞争反应，能结合至一细胞成分。第2图包含了由一个荧光显微镜所拍摄的图像，显示一荧光图样，当一个荧光标记的细胞成分结合至与一表面改良的磁性物质有关的一参照品时，该荧光图样与一感应磁化图样是重迭的(共定位的)，该感应磁化乃通过磁性物质在一磁场方向而形成。第3与第4图包含了由一个荧光显微镜所拍摄的图像，显示是否一反应竞争物结合至一细胞成分，取决于处理或不处理非生物素达沙替尼的反应竞争物。当不处理一反应竞争物时，可证实的是一荧光图样与一感应磁化图样重迭的(共定位的)，因为达沙替尼-生物素与结合至一荧光标记细胞成分，表面改良的磁性物质有关，而该感应磁化乃通过磁性物质在一磁场方向形成。反之，当处理一反应竞争物时，可证实的是一感应磁化图样通过磁性物质在一磁场方向而形成，但因一反应竞争物结合至一细胞成分，一突光图样与该感应磁化图样重迭无法被察觉。第5图包含一个表，显示筛选调节子(小分子复合物)的结果，该调节子能通过该竞争反应，结合至一细胞成分。在不同天里，最少两个独立实验中，小分子复合物已被证实为能结合至该细胞成分的调节子，该小分子复合物体现为“抑制”。
具体实施例方式本发明实际且较佳的实施例将被更清楚地描绘于以下实施例里。然而，本领域技术人员基于揭露内容的考虑，在本发明的精神和范围内可做改良与改进，是值得赞赏的。在说明书内引用的参考文献亦纳入本发明的范畴。实施例I.辨认一参照品与一细胞成分的结合在本发明的实施例中，它确定是否应用一磁场形成的复数个磁性物质的磁化图样能依据一荧光物质成像以用为标记，及是否在磁力线方向的磁性物质的图样与标记的荧光图样重迭(共定位)，当该磁性物质(表面-改良的与一参照品相关联的)图样磁化在一磁力线方向，且结合至一细胞成分的标记图样是成像的。例如，一列的激酶，包含但不限于一细胞成分。为了确认是否一参照品结合至在细胞里的一细胞成分，进行了接下来的实验。开始时，被考虑用以与选取的参照品相互作用的细胞成分，当结合至在一细胞内的一荧光蛋白质时，是明示的。关于该参照品的一表面-改良的磁性物质被引入至该细胞中后，当应用一磁场时，通过结合该参照品与细胞成分，观察是否该磁性物质的图样在一磁力线方向与该荧光蛋白质的荧光图样重迭。(I)参照品
一个用于慢性髓性白血病的治疗剂，达沙替尼，选为一参照品，其如众所周知用以调节一细胞成分生物及/或生理的活性[Lombardo, L. J.，Lee, F. Y.，Chen, P.，etal.Discovery of N-(2-chloro-6-methyl-phenyl)~2~(6-(4-(2-hydroxyethyl)-piperazin-l-yl)-2-methylpyrimidin-4-ylamino)thiazole-5-carboxamide(BMS-354825), a dual Src/Abl kinase inhibitor with potent antitumor activity inpreclinical assays. J. Med. Chem. 47, 6658-6661 (2004) ; Shah, N. P. , Tran, C. , Lee, F. Y.Chen, P. , Norris, D. , Sawyers, C. L. Oerriding imatinib resistance with a novel ABLkinase inhibitor.Science305, 399-401(2004)]。达沙替尼-生物素乃合成以允许达沙替尼与一磁性粒子结合，该磁性粒子的表面以链霉亲和素改良。达沙替尼-生物素的合成乃根据描述于韩国专利申请第10-2008-0111326号(由该发明的发明人于2008年11月10日完成申请)的方法而进行。在此例中，达沙替尼为一参照品；然而，发明不仅限于此。本领域技术人员很容易理解，各种小分子复合物，其能附着于一磁性物质且被引介日一细胞、蛋白质比如抗体、激素和生长因子、蛋白质域、蛋白质图案，及肽者，能被用为一参照品。(2)细胞成分对于调节一细胞内生物及/或生理的活性的细胞成分，ABL1、ABL2、BLK、BMX、BTK、CSK、FGR、LYN、SRC、YES1、KIT、MAPK14、RIPK2与SNFlLK被用来与达沙替尼交互作用。用于PCR的DNA模板由开放生物系统公司(Open Biosystems)购入,或使用cDNA库中的DNAs。为了以一个融合荧光蛋白质的形式表达编码在一人源性细胞内的每一基因蛋白质，根据描述于韩国专利申请第10-2008-0111326号(2008年11月10日完成申请)的方法，每一基因的无终止密码子的ORF通过PCR被扩增且接着克隆至一表达载体。同时，该蛋白质比如BLK、FGR、LYN、SRC与YESl的第二氨基酸，，众所周知“甘氨酸”经由宣蘧酰化结合至该细胞膜[McCabe, J. B. &Berthiaume, L. G. (1999)Functionalroles for fatty acylated amino-terminal domains in subcellular localization.Mol. Biol. Cell 10，3771]。因此，在本发明的此实施例中，该第二氨基酸为丙氨酸所取代且接着该代表性蛋白质被复制以防止该蛋白质的宣蘧酰化[McCabe, J. B. &Berthiaume, L.G. (1999)Functional roles for fatty acylated amino-terminal domains insubcellular localization. Mol. Biol. Cell 10,3771]。KIT也是一膜受体激酶，具有一单一跨膜结构域[Yarden, et al. (1987)Humanproto—oncogene c-kit:a new cell surface receptor tyrosine kinase for anunidentified ligand. EMBO J. 6，3341]。如此一来,本发明的此实施例中，为了移除该KIT的跨膜结构域，仅该氨基酸的545至976区域通过PCR扩增以制造一表达载体。
倘若是AB LI，该ABLl催化区被复制生产ABLlcat表达载体。此外，完整的表达载体通过末端测序而被确认。下列表I显示了基因名称、基因库
账号与表达的蛋白质激酶的特性，而该蛋白质激酶在本发明的此实施例中用为细胞成分。同时，本发明可用的细胞成分不限于蛋白质激酶，如表I所提及；然而该细胞成分
可包括较广域的物质，该等物质调节在一细胞内生物及/或生理的活性，比如，该物质被认
为是关于活体内生理的代谢作用与疾病。表I
权利要求
1.一种用于侦测调节细胞里细胞成分的生物及/或生理活性的调节子的方法，包括下列步骤 准备复数个磁性物质，该复数个磁性物质通过一磁场在一磁力线的一方向上磁化，至少ー磁性物质被配置进一奈米粒子且该至少ー磁性物质的表面是被改良的； 联合能调节该细胞成分活性的參照品与磁性物质，且接着引入该參照品与磁性物质至ー细胞中，复数个与该參照品联合的磁性物质被引入至每ー细胞中； 联合限于被结合至该參照品的细胞成分与ー标记，该标记能成像磁性物质的图样，及提供该细胞成分与该标记至该细胞中； 引入一调节子至该细胞中，该调节子限于决定对于细胞成分，是否其竞争得过该參照品; 通过应用一磁场至该细胞，允许一束磁力线在一方向上通过该细胞； 通过该应用的磁场，将复数个在该细胞内的磁性物质与该磁力线的方向对齐；及 辨认ー图样，在该图样里复数个该磁性物质对齐该磁力线的方向，及该标记的一图样，即被成像的图样。
2.如权利要求I所述的方法，进ー步包括辨认该磁性物质的成像图样与标记的成像图样，及是否该成像图样彼此共定位。
3.如权利要求2所述的方法，其中当该调节子可和该參照品在与细胞成分结合方面竞争时，该调节子结合至该细胞成分，且该磁性物质的成像图样不与该标记的成像图样共定位。
4.如权利要求2所述的方法，其中当该调节子无法和该參照品在与细胞成分结合方面竞争时，该參照品结合至该细胞成分，且该磁性物质的成像图样与该标记的成像图样共定位。
5.如权利要求I至4项中任一项所述的方法，进ー步包括将该參照品与磁性物质两者提供至一活细胞，且接着将该參照品与磁性物质两者显露至该活细胞的细胞质。
6.如权利要求5所述的方法，其中该调节子在该參照品与磁性物质显露至该活细胞的细胞质前，被引入至该活细胞中。
7.如权利要求I至4项中任一项所述的方法，其中如果该细胞成分具有一能结合至该细胞膜的特性，该能结合至该细胞膜细胞成分的特性将被移除。
8.如权利要求7所述的方法，其中如果该细胞成分是BLK、FGR、LYN、SRC或YESl蛋白质，该细胞成分能结合至该细胞膜的特性，可通过以丙氨酸取代该蛋白质的第二氨基酸与甘氨酸而被移除。
9.如权利要求7所述的方法，其中如果该细胞成分是KIT蛋白质，该细胞成分能结合至该细胞膜的特性，可通过仅提供该KIT蛋白质的氨基酸545至976的区域至ー活细胞中而被移除。
10.如权利要求7所述的方法，其中如果该细胞成分是ABLl蛋白质，该细胞成分能结合至该细胞膜的特性，可通过仅提供该ABLl的催化区至一活细胞中而被移除。
全文摘要
本发明提供了一种用于侦测调节细胞里细胞成分的生理活性的调节子的方法。该方法能通过成像在一磁力线方向磁化的一磁性图样及结合至该细胞成分的一标记的图样，决定是否对于在细胞内的该细胞成分，参照品与调节子间有竞争反应后，侦测调节子。本方法的一个好处是，因为细胞成分与参照品及诸如药物的调节子的反应发生于细胞里，该参照品与调节子间对于细胞成分的竞争反应，能反应发生于活细胞里的真实代谢作用。它也能允许该细胞成分与诸如药物的该调节子间互动的结果可视化和直接于细胞内被确定。另外，该方法具有使用一些参照品筛选许多调节子，及侦测该调节子在细胞内的功能的好处，比方说，其功效无须通过引入该参照品而修改该调节子。
文档编号G01N27/00GK102782494SQ201180009160
公开日2012年11月14日 申请日期2011年2月8日 优先权日2010年2月12日
发明者金大中 申请人:麦德斯科股份有限公司
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