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专利名称：一种茶树抗寒性早期鉴定方法
技术领域：
本发明属于植物学领域，涉及ー种茶树抗寒性鉴定方法，尤其是一种通过測定茶树叶片中蔗糖含量进行抗寒性鉴定的方法。
背景技术：
我国是茶树的原产地，也是世界上最早种茶、制茶、饮茶的国家，我国人工栽培茶树有3000多年历史，茶叶是我国的“国炊”，是茶叶生产和消费大国，2009年我国茶树种植面积为180万公顷，产量超过130万吨，均居世界首位。茶叶也是世界公认的最重要的天然 保健饮料，全世界有60个国家种茶，进口茶叶的国家遍及150多个国家和地区，20多亿人钟情于茶饮。随着健康饮料消费观念的变化，茶叶的消费和贸易前景更为广阔。茶叶生产在我国农业经济、农村发展和社会主义新农村建设方面占有举足轻重的地位，尤其在很多丘陵山区，其经济地位更为突出。低温是影响茶树分布与种植的重要生态因子，风冻、霜冻、冰雪冻在我国大部分茶区春、秋、冬季经常发生，致使茶树全部冻死或严重冻伤，造成大幅减产、品质降低。茶树的抗寒性具有较高的遗传力，不同的茶树品种其抗寒能力差异显著，快速、可靠的茶树抗寒性相关的指标可为茶树抗寒性鉴定和抗寒品种的筛选提供重要依据。目前主要是从以下几个方面对茶树的抗寒性进行研究I、叶片解剖结构与茶树抗寒性有研究表明叶片上表皮厚度、栅栏组织厚度、栅状组织厚度与叶片总厚度的比值、栅状组织与海绵组织厚度的比值与抗寒性呈强度正相关。该指标与茶树生长的实际抗寒性表现有时有矛盾，不够准确和可靠。2、组织自由水和束缚水含量与茶树抗寒性叶片自由水与束缚水所起的作用是不同的，束缚水的相对含量较高，自由水的相对含量较低吋，有利于抗冻。有人认为，叶片组织自由水含量、组织束缚水含量两者之比值可以作为衡量茶树品种抗寒性的ー个生理指标。该指标未做深入、系统的研究，还处于理论推测阶段。3、细胞液浓度与茶树抗寒性细胞液浓度反映细胞内含物和水分比例的关系，细胞液浓度高，可溶性糖和蛋白质的含量高，细胞内的束缚水含量就高，自由水含量则相对減少，抗冻性就強。叶片汁液的折射率反映了细胞液的浓度，细胞液浓度高，汁液的折射率大。因此，有人认为，叶片汁液折射率可以作为茶树抗寒性鉴定指标。该指标也未做深入、系统的研究，还处于理论推测阶段。4、电导率和电阻值与茶树抗寒性有研究结果显示，抗寒性强的品种或受害轻者不仅膜透性増大的程度较小，并且透性的变化可以逆转，易于恢复正常，故电阻值大。反之，抗寒性弱的品种或受害严重者不但膜透性増加，而且这种变化不可逆转，不能恢复正常，以至造成伤害甚至死亡。有人认为，叶片电阻值和电导率可作为茶树抗寒性強弱的一个理化指标。电导法在实际測定中所受到的影响因素较多，温度、浸泡时间以及空气中CO2的溶解等等都会对实际測定的电导值产生影响，故而使得測定结果重复性较差。5、丙ニ醛(MDA)含量与茶树抗寒性有研究认为，不同茶树品种遭受冻害后，其丙ニ醛含量变化存在差异，积累越多表明组织的保护能力越弱，细胞膜遭受破坏越严重，抗寒性也就越弱。但MDA含量只是在不同低温下存在差异，在各品种间则差异不显著。
6、保护性酶类与茶树抗寒性植物体在低温条件下细胞内的自由基产生和消除的平衡会遭到破坏，积累的自由基对植物的膜系统造成伤害，使膜脂产生过氧化作用，导致细胞膜的结构和功能受到破坏。而自由基的产生和消除又被细胞中的保护酶系所控制，保护系统包括SOD (超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)、POX(过氧化物酶)、谷胱甘肽过氧化物酶等酶类以及Ve、Va、Vc,辅酶Q、类胡萝卜素等还原性物质。茶树体内这些酶受低温直接或间接的影响而发生活性变化，有人认为，可利用酶的活力作茶树抗寒性鉴定指标。该指标与茶树生长的实际抗寒性表现有矛盾，不够准确和可靠，还需做深入、系统的研究。

发明内容
本发明是为了解决现有技术存在的不足，提供一种通过測定茶树叶片中蔗糖含量来鉴定茶树抗寒性(蔗糖含量与茶树抗寒性正相关)，为鉴定和筛选抗寒性强的茶树品种及茶树引种提供依据。一种茶树抗寒性早期鉴定方法，通过测定茶树叶片中蔗糖含量来鉴定茶树抗寒性，所述蔗糖糖含量測定方法包含以下步骤A.样品提取液制备I)取茶树成熟鲜叶片25g，剪成0. 2-0. 5cm2碎片；2)将步骤I)剪碎后的叶片加入纯水中，密封条件下，在90°C水浴中浸提Ih ;叶片与纯水浸提百分比是I : 103)将步骤2)中的浸提液取出冷却至室温，转入离心管中5000rpm离心15min，去杂，收集上清液；4)将步骤3)中的上清液浓缩至原体积的1/10，经0. 45 y m水系滤膜过滤获得过滤液，所述过滤液即为样品提取液。B.蔗糖含量测定I)色谱条件高效液相色谱泵，蒸发光散射检测器，碳水化合物分析柱，配有预柱，流动相为こ腈水=3 1，流速lmL/min，喷雾器级别60%，漂移管温度为55°C，气压25psi ;2)标准曲线制作准确称取蔗糖标准品20mg，加入ImL超纯水配制浓度为20mg/mL的蔗糖标准母液，然后用超纯水稀释成0. 5、I. 0,2. 0,8. O、10. Omg/mL系列标准溶液。在測定条件下分别进样10 yL，记录出峰时间并測定峰面积，然后以测定的峰面积Ig值对相应的蔗糖标准液浓度Ig值进行线性回归得到标准曲线方程y = ax+b, X代表鹿糖标准液浓度的Ig值,y代表峰面积的Ig值，a、b为常数。3)含量测定
取样品提取液IOii L进样，參照2)中记录的蔗糖标准品的出峰时间，确定样品提取液中蔗糖峰(样品中蔗糖的出峰时间应与蔗糖标准品的出峰时间一致)，測定其峰面积，根据标准曲线方程计算出样品提取液中蔗糖浓度；4)根据如下公式计算获得茶叶中蔗糖含量鹿糖含量(mg/g)= (CXnXV)/mC-标准方程求得蔗糖浓度(mg/mL) ;n_样品提取液稀释倍数；V_样品提取液总体积(mL) ;m-样品重(g)；注冬季低温会引起叶片含水量下降，因此可通过预先測定叶片含水量，获得样品干重，计算每克干重蔗糖含量，会使结果更加准确。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在由理论知识可知，当细胞内可溶性糖含量(主要是蔗糖)增多时，可使细胞渗透压増大，提高了细胞液的浓度，使冰点降低，保护细胞质胶体不致遇冷凝固，增强了茶树植株的抗寒能力。此外，糖还具有保护蛋白质避免低温所引起的凝固作用。由此可见，可溶性糖含量(主要是蔗糖)是茶树抗寒性強弱的ー个重要生理指标。传统的測定可溶性糖含量的方法，如蒽酮硫酸法，由于硫酸的水解作用，可能会引起细胞内ー些大分子物质水解成糖类，从而影响测定的准确性。由于越冬植物体内淀粉含量減少，可溶性糖，主要是蔗糖含量增多，含糖量与温度呈负相关(潘瑞炽.植物生理学[M],北京高等教育出版社，2008)，并通过实验证实，冬季低温条件下，茶树叶片可溶性糖的最主要成分是蔗糖(图I和图2)，因此，蔗糖含量的高低直接反应了细胞内可溶性糖的水平。本发明正是建立一种通过測定低温条件下茶树叶片蔗糖含量来进行抗寒性鉴定的方法，以克服传统方法的不足，使结果更加准确可靠。


图I是低温条件下舒茶早叶片可溶性糖成分液相分析图。图2是低温条件下乌牛早叶片可溶性糖成分液相分析图。图3是本实施例地区10月至I月份平均气温变化图。图4是本实施例乌牛早和舒茶早在10月到I月份的蔗糖含量变化图。以下通过实施例对本发明做进ー步说明。
具体实施例方式I、试材处理从10月份开始，随着气候逐渐由秋入冬，温度逐渐下降，毎月于安徽省合肥市大杨镇茶园取舒茶早和乌牛早两个品种，通过高效液相色谱法測定其叶片中蔗糖含量，持续到翌年I月，井比较两个品种的蔗糖含量变化。2、蔗糖含量的测定A.样品提取液制备I)取茶树成熟鲜叶片25g，剪成0. 2-0. 5cm2碎片；
2)将步骤I)剪碎后的叶片加入250mL纯水中，密封条件下，在90°C水浴中浸提Ih;叶片与纯水浸提重量百分比为是I : 10;3)将步骤2)中的浸提液取出冷却至室温，转入离心管中5000rpm离心处理15min，去杂，收集上清液；4)将步骤3)中的上清液浓缩至25mL，即原体积的1/10，经0.45 iim水系滤膜过滤获得过滤液，所述过滤液即为样品提取液。B.蔗糖含量测定I)色谱条件 Waters515高效液相色谱泵，Waters2420蒸发光散射检测器，Agilent Zorbax碳水化合物分析柱(配有预柱)，流动相为こ腈水=3 I,流速lmL/min,喷雾器级别60%,漂移管温度为55°C，气压25psi。2)标准曲线制作准确称取蔗糖标准品20mg，加入ImL超纯水配制浓度为20mg/mL的蔗糖标准母液，然后用超纯水稀释成0. 5、I. 0,2. 0,8. O、10. Omg/mL系列标准溶液。在測定条件下分别进样10 yL，记录出峰时间并測定峰面积，然后以测定的峰面积的Ig值对相应的蔗糖标准液浓度的Ig值进行线性回归得到标准曲线方程。3)含量测定取样品提取液100 U L，加400 U L超纯水，将样品提取液稀释5倍(若样品提取液中蔗糖浓度过大，測定过程中出现平头峰，可将样品提取液稀释适当倍数再进样)，然后取IOy L进样，參照蔗糖标准品的出峰时间，确定样品提取液中蔗糖峰，測定其峰面积，根据标准曲线方程计算出样品提取液中蔗糖浓度。4)根据如下公式计算获得茶叶中蔗糖含量鹿糖含量(mg/g)= (CXnXV)/mC-标准方程求得蔗糖浓度(mg/mL) ;n_样品提取液稀释倍数；V_样品提取液总体积(mL) ;m-样品重(g)；3、结果说明从图2中可以看出，从10月到翌年I月，温度逐渐下降，12月平均温度下降到6°C左右，I月份平均温度下降到0°c左右。随着温度的下降，茶树叶片蔗糖含量稳步上升(图3)，从10月到I月，生产中抗寒性强的茶树品种舒茶早蔗糖含量从23. 13mg/g (干重)上升到137. 03mg/g(干重)，増加了 5倍，生产中抗寒性较弱的茶树品种乌牛早蔗糖含量从42. 46mg/g (干重)上升到112. 14mg/g (干重)，也増加了 I. 6倍，舒茶早蔗糖含量的増幅明显大于乌牛早。測定结果说明在低温条件下(12月和I月)，生产中抗寒性强的茶树品种舒茶早叶片蔗糖含量显著高于抗寒性较弱的茶树品种乌牛早，且两个品种间存在着显著差
巳升。由理论知识可知，当细胞内可溶性糖含量(主要是蔗糖)增多时，可使细胞渗透压増大，提高了细胞液的浓度，使冰点降低，保护细胞质胶体不致遇冷凝固，增强了茶树植株的抗寒能力。此外，糖还具有保护蛋白质避免低温所引起的凝固作用。由此可见，可溶性糖含量(主要是蔗糖)是茶树抗寒性強弱的ー个重要生理基�。�是茶树品种适应低温能力的ー个重要表现，随着冬季来临温度不断降低，茶树叶片蔗糖含量稳步增加，抗寒性强的品种比抗寒弱的增加的要多。
本实施例供试的两个茶树品种舒茶早和乌牛早，根据多年的栽培实践，舒茶早抗寒性高于乌牛早。蔗糖測定结果表明在低温条件下(12月和I月)，两个茶树品种的叶片蔗糖含量都明显增加，而且从10月到I月，生产中抗寒性强的茶树品种舒茶早蔗糖含量增加了 5倍，生产中抗寒性较弱的茶树品种乌牛早蔗糖含量只増加了 I. 6倍，舒茶早蔗糖含量的増幅明显大于乌牛早，两个品种间存在着显著差异。因此，蔗糖含量与茶树抗寒性正相关，它可以作为茶树抗寒性鉴定的ー个指标。
权利要求
1.一种茶树抗寒性早期鉴定方法，其特征在于通过测定茶树叶片中蔗糖含量来鉴定茶树的抗寒性。
2.根据权利要求2所述的一种茶树抗寒性早期鉴定方法，其特征在于所述蔗糖含量测定方法包含以下步骤 A.样品提取液制备 1)取茶树成熟鲜叶片25g，剪成0.2-0. 5cm2碎片； 2)将步骤I)剪碎后的叶片加入纯水中，密封条件下，在90°C水浴中浸提Ih;叶片与纯水浸提百分比是I : 10; 3)将步骤2)中的浸提液取出冷却至室温，转入离心管中5000rpm离心15min，去杂，收集上清液； 4)将步骤3)中的上清液浓缩至原体积的1/10，经0.45水系滤膜过滤获得过滤液，所述过滤液即为样品提取液； B.蔗糖含量测定 1)色谱条件 高效液相色谱泵，蒸发光散射检测器，碳水化合物分析柱，配有预柱，流动相为乙腈水=3 1，流速lmL/min，喷雾器级别60%，漂移管温度为55°C，气压25psi ； 2)标准曲线制作 准确称取鹿糖标准品20mg,加入ImL超纯水配制浓度为20mg/mL的鹿糖标准母液,然后用超纯水稀释成0. 5,1. 0,2. 0,8. 0,10. Omg/mL系列标准溶液，在测定条件下分别进样10yL，记录出峰时间并测定峰面积，然后以测定的峰面积Ig值对相应的蔗糖标准液浓度Ig值进行线性回归得到标准曲线方程y = ax+b,x代表鹿糖标准液浓度的Ig值代表峰面积的Ig值，a、b为常数； 3)含量测定 取样品提取液10 UL进样，参照步骤2)中记录的蔗糖标准品的出峰时间，确定样品提取液中蔗糖峰，测定其峰面积，根据标准曲线方程计算出样品提取液中蔗糖浓度； 4)根据以下公式计算获得茶叶中蔗糖含量 鹿糖含量(mg/g) = (CXnXV)/m, C-标准方程求得蔗糖浓度(mg/mL) ;n-样品提取液稀释倍数；V_样品提取液总体积(mL) ；m-样品重(g)。
全文摘要
本发明属于植物学领域，涉及一种茶树抗寒性早期鉴定方法，可溶性糖含量(主要是蔗糖)是茶树抗寒性强弱的一个重要生理基�。�是茶树品种适应低温能力的一个重要表现，随着冬季来临温度不断降低，茶树叶片蔗糖含量稳步增加，但抗寒性强的品种比抗寒弱的增加的要多。本发明通过测定茶树叶片中蔗糖含量来鉴定茶树的抗寒性，为鉴定和筛选抗寒性强的茶树品种及茶树引种提供依据。
文档编号G01N30/06GK102650622SQ20111004501
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者朱政, 江昌俊 申请人:安徽农业大学