亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：一种金标银染定量检测汞离子的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种汞离子的检测方法，尤其是涉及一种金标银染定量检测汞离子的方法及其试剂盒。
背景技术：
汞(Hg)，是常温下唯一的液态金属，是重金属之一。近年来，人类对重金属汞的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，大量的汞进入大气、水、土壤中存留、积累和迁移。汞的毒性大，在生物体内和环境中残留时间长，严重威胁人类健康，故美国、欧盟、加拿大以及我国等许多国家和地区对食品、生活用品、环境中汞含量都做了严格限定，汞污染的检测 与监控已经成为重点关注的问题。自然界中的汞主要以离子形式(Hg2+)存在，故实现对汞离子的准确、灵敏、快速的现场检测非常重要。目前检测汞离子的方法主要有紫外一可见分光光度法、冷原子吸收光谱法、荧光光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法、重金属快速测定仪法、试纸条法等。紫外一可见分光光度法选择性差，检出限高；原子吸收光谱法、荧光光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法，准确度和灵敏度高，但均需使用特定的仪器，价格昂贵，操作繁琐，且要求检测人员具备一定的专业知识，分析成本高，无法应用于现场检测，难以普及；重金属快速测定仪法可应用于现场检测，但灵敏度不高、选择性差，样品预处理复杂；试纸条法以其快速、简便、灵敏而在现场检测中别具优势，但其只能够定性判断是否含有检测限含量以上的Hg2+，无法定量分析得到Hg2+的准确浓度。金标银染(Gold label silver stain)技术是采用一个“夹心式”的基因杂交系统，通过探针DNA识别靶DNA或者其他研究对象，并将纳米金颗粒与DNA杂交系统结合在一起后，浸入含银离子的银染试剂中，由于纳米金颗粒对银离子的还原有催化作用，银染试剂中的银离子在纳米金颗粒表面被还原为单质银而沉积，呈现出黑色的银染信号。纳米金颗粒数目越多，银染信号的灰度值越大，而纳米金颗粒数目取决于体系中靶DNA或者其他研究对象的数目，因此根据银染信号的灰度值即可定量检测靶DNA或者其他研究对象的浓度。目前，国内外还没有关于将金标银染技术应用于定量检测汞离子的相关研究报道。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高选择性且可定量分析汞离子浓度的金标银染定量检测汞离子的方法及其试剂盒。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种金标银染定量检测汞离子的方法，具体包括以下步骤
(I)娃烧化载玻片的制备
将载玻片置于piranha洗液中，于90-100°C加热20-40 min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入l-3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用乙醇洗净后，于110-130°C真空干燥l_3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7 3的比例混合得到；
(2)特异性DNA-纳米金探针溶液的制备
将 30-40ul 的 100 uM 序列为 HS-5’-TTTTTTTTTT-3’的 DNA 和 O. 5-1. 5 mL 浓度为 20-25nM的纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育12-20小时后，加蒸馏水稀释50-100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液；
(3)探针与样品反应及银染放大
将步骤(2)所得的特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液按体积比1-3 :2-6混合，振荡摇勻10-20 min后,取2-4 uL滴在娃烧化载玻片上,于室温下至试样点完全干燥后,在试样点上滴银染试剂4-6 uL，室温下暗箱静置10-20 min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试齐U，然后干燥载玻片；
(4)金标银染信号的定量分析
将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度。步骤(2)中所述的纳米金颗粒的直径为15-30 nm，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构为 AuNPs-HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’。步骤(3)中所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含O. 25 g/mL的AgNO3溶液,组分B为O. 0425 g/mL的氢醌、O. 064 g/mL的朽1檬酸、O. 059 g/mL的朽1檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3 : 100混合即得银染试剂。步骤(4)的具体过程如下
A.用扫描仪将载玻片上的金标银染试样点扫描成图片；
B.利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，令信号的灰度值=255一读出的灰度值，使信号的灰度值仍介于O至255之间,无色最小为O,全黑色最大为255,颜色越深，信号的灰度值越大；
C.设置信号的灰度值阈值为10，取信号的灰度值>10时的有效像素点，求出有效像素点数目；
D.将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，即得金标银染信号的灰度总
值；
E.用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，即得到金标银染信号的灰度平均
值；
F.配制一系列不同浓度的汞离子溶液，按照前述步骤获得金标银染信号及其灰度平均值，建立金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系；
G.根据上述步骤获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度。一种金标银染定量检测汞离子的试剂盒，包括硅烷化载玻片、特异性DNA-纳米金探针和银染试剂，所述的特异性DNA-纳米金探针在纳米金上结合有特异性DNA，所述的特异性 DNA 的序列如下HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’。所述的纳米金颗粒的直径为15-30 nm，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构为AuNPs-HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’ ；
所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含O. 25 g/mL的AgNO3溶液，组分B为O. 0425 g/mL的氢醌、O. 064 g/mL的朽1檬酸、O. 059 g/mL的朽1檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3 : 100混合即得银染试剂。发明原理纳米金颗粒表面结合有含10个T碱基的DNA，Hg2+存在时，不同纳米金颗粒表面结合的DNA通过T一Hg2+—T错配相互绞合,使纳米金颗粒聚集，纳米金颗粒数目减少，其对银离子的还原能力降低，还原出来的银离子量减少，产生的金标银染信号颜色变浅，金标银染信号灰度平均值降低。Hg2+浓度越高，纳米金颗粒聚集程度越高，其对银离子的还原能力越低，还原出来的银离子量越少，产生的金标银染信号颜色越浅，金标银染信号灰度平均值越低。另外，通过控制DNA用量以控制同一纳米金颗粒表面DNA相互之间的距离，可以确保纳米金颗粒表面结合的DNA之间并不会发生T一Hg2+— T错配。与现有技术相比，本发明的优点在于(1)高选择性，常见金属离子如Pb2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+ 对检测均无干扰。原因在于特异性DNA-纳米金探针的T-Hg2+-T错配对汞离子具有高特异性的识别能力，其它金属离子的干扰可忽略；
(2)高灵敏度，检测限达到O.I nM的Hg2+ ；
(3)可定量分析，通过建立金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，可以得到待测汞离子溶液的准确浓度；
(4)操作简单，无需使用特定的仪器，一台扫描仪即可，价格低廉，操作简单，不要求检测人员具备一定的专业知识，分析成本低，可应用于现场检测，易于普及。综上所述，本发明一种基于纳米金(AuNPs)、特异性DNA、金标银染技术的金标银染定量检测汞离子的方法及其试剂盒，具有高灵敏度、高选择性且可定量分析汞离子浓度，不仅操作简单而且可现场检测。


图I为本发明金标银染信号灰度平均值与汞离子浓度的对数之间的线性关系图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。实施案例I
本发明一种金标银染定量检测汞离子的方法，具体包括以下步骤
(1)娃烧化载玻片的制备
将载玻片置于piranha洗液中，90-100°C加热20-40 min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入l-3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用乙醇洗净后，于110-130°C真空干燥l_3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7 3的比例混合得到；
(2)特异性DNA-纳米金探针溶液的制备
将 30-40ul 的 100 uM 序列为 HS-5’-TTTTTTTTTT-3’的 DNA 和 O. 5-1. 5 mL 浓度为 20-25nM的纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育12-20小时后，加蒸馏水稀释50-100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液；上述纳米金颗粒的直径为15-30 nm，特异性DNA-纳米金探针的结构为 AuNPs-HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’ ；
(3)探针与样品反应及银染放大
将步骤(2)所得的特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液按体积比1-3 :2-6混合，振荡摇勻10-20 min后,取2-4 uL滴在娃烧化载玻片上,于室温下至试样点完全干燥后,在试样点上滴银染试剂4-6 uL，室温下暗箱静置10-20 min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试齐U，然后干燥载玻片；上述银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含O. 25 g/mL的AgNO3溶液,组分B为O. 0425 g/mL的氢醌、O. 064 g/mL的朽1檬酸、O. 059 g/mL的朽1檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3 : 100混合即得银染试剂；
(4)金标银染信号的定量分析
将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度，具体过程如下
A.用扫描仪将载玻片上的金标银染试样点扫描成图片；
B.利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，每个像素点读出的灰度值介于O至255之间,全黑色最小为O,无色最大为255。考虑数据处理的方便,令信号的灰度值=255 —读出的灰度值，通过这种处理，信号的灰度值仍介于O至255之间，无色最小为0，全黑色最大为255，颜色越深，信号的灰度值越大；
C.由于金标银染信号大致为圆形，扫描出的图片周围有很多空白，不能计为有效像素点。因此，设置信号的灰度值阈值为10，也就是信号的灰度值>10时才计为有效像素点，求出有效像素点数目；
D.将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，即得金标银染信号的灰度总
值；
E.用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，即得到金标银染信号的灰度平均
值；
F.配制一系列不同浓度的汞离子溶液，按照前述步骤获得金标银染信号及其灰度平均值，建立金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系；
G.根据上述步骤获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度。实施案例2
本发明一种金标银染定量检测汞离子的试剂盒，包括硅烷化载玻片、特异性DNA-纳米金探针和银染试剂，特异性DNA-纳米金探针在纳米金上结合有特异性DNA，特异性DNA的序列如下HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’。在此具体实施例中，纳米金颗粒的直径为15-30 nm，特异性DNA-纳米金探针的结构为AuNPs-HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’。银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含
O.25 g/mL 的 AgNO3 溶液,组分 B 为 O. 0425 g/mL 的氢醌、O. 064 g/mL 的朽1 檬酸、O. 059 g/mL 的柠檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3 : 100混合即得银染试剂。
在此具体实施例中，娃烧化载玻片过程为将载玻片置于piranha洗液中，90-100°C加热20-40 min后取出，用蒸懼水洗漆三次,置于N2氛中干燥后,浸入l-3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用乙醇洗净后，于110-130°C真空干燥l_3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7 3的比例混合得到。实施案例3
本发明金标银染信号灰度平均值与汞离子浓度的定量关系的建立，具体包括以下步
骤
(1)载玻片的硅烷化
将载玻片置于Piranha洗液中，90°C加热40 min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入2%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液于室温下硅烷化处理6 h，再用 乙醇洗净后110°C真空干燥3 h，上述piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水以7 : 3的体积比例混合得到；
(2)特异性DNA-纳米金探针溶液的制备
将 34 μ L 的 100 μ M 序列为 HS-5’ -TTTTTTTTTT-3 的 DNA 和 I mL 浓度为 22. 4 nM的纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育18小时后，加蒸馏水稀释100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液。上述纳米金颗粒的直径为30 nm,特异性DNA-纳米金探针的结构为AuNPs-HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’ ；
(3)探针与样品反应及银染放大
取10 μ L上述步骤(2)所得的特异性DNA-纳米金探针溶液，分别与20 μ L浓度为O. IηΜ、0·2 ηΜ、0·5 ηΜ、1·0 ηΜ、10·0 ηΜ、20· O ηΜ、50· O ηΜ、100·0 ηΜ、200· O ηΜ、500· O ηΜ 的硝
酸汞混合，振荡摇匀，20 min后，取3 μ L所得的混合溶液滴在硅烷化处理过的载玻片上，室温至试样点完全干燥后，在试样点上滴银染试剂5 μ L，准确计时，室温下暗箱静置20 min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，干燥载玻片；上述银染试剂由组分A、组分B组成，其中，组分A为含O. 25 g/mL的AgNO3溶液,组分B为O. 0425 g/mL的氢醌、O. 064 g/mL的朽1檬酸、O. 059 g/mL的柠檬酸三钠的混合溶液，临用前将组分A、组分B按体积比3 : 100混合即得银染试剂；
(4)金标银染信号的定量分析
第一步、用扫描仪将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片；
第二步、利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，每个像素点读出的灰度值介于O至255之间,全黑色最小为O,无色最大为255。考虑数据处理的方便,令信号的灰度值=255 —读出的灰度值，通过这种处理，信号的灰度值仍介于O至255之间，无色最小为0，全黑色最大为255，颜色越深，信号的灰度值越大；
第三步、因为金标银染信号大致为圆形，扫描出的图片周围有很多空白，不能计为有效像素点。因此，设置信号的灰度值阈值为10，也就是信号的灰度值>10时才计为有效像素点，得到有效像素点数目分别为0. I ηΜ 45735个、0.2 ηΜ 50471个、O. 5 ηΜ 43718个、LOnM 34316 个、10.0 ηΜ 56682 个、20. O ηΜ 38969 个、50. O ηΜ 37001 个、100. O ηΜ38916 个、200. O ηΜ 35288 个、500. O ηΜ 34705 个；
第四步、将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，得到金标银染信号的灰度总值为 O. I ηΜ 3833656,0. 2 ηΜ 4189917,0. 5 ηΜ 3569275、I. O ηΜ 2716516、10. O ηΜ4346359,20. O ηΜ 2900466,50. O ηΜ 2633438、100. O ηΜ 2707007,200.O ηΜ 2411092、500. O ηΜ 2277350 ；
第五步、用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，得到金标银染信号的灰度平均值为 O. I ηΜ 83. 8232425,0. 2 ηΜ 83. 0163262,0. 5 ηΜ 81. 6431447、I. O ηΜ79.1617904、10. O ηΜ 76.6797043,20. O ηΜ 74.4300854,50. O ηΜ 71.1720764、100. O ηΜ69.5602579,200. O ηΜ 68.3261165,500. O ηΜ 65.6202276 ；
第六步、由以上步骤获得的金标银染信号及其灰度平均值，建立金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系；
以灰度值(y)为纵坐标，汞离子浓度(X，ηΜ)为横坐标作图，如图I所示，金标银染信号灰度平均值与汞离子浓度的对数之间呈现线性关系，线性方程为y = 79.75303 -4. 9000*logxo 线性相关系数 R= — 0.9911。 实施案例4
本发明金标银染定量检测样品溶液中汞离子的方法，具体步骤如下
(1)载玻片的硅烷化
将载玻片置于piranha洗液中，95°C加热30 min后取出，用蒸懼水洗漆三次,置于N2氛中干燥后，浸入2%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液于室温下硅烷化处理4h，再用乙醇洗净后120°C真空干燥2 h，上述piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水以7 : 3的体积比例混合得到；
(2)特异性DNA-纳米金探针溶液的制备
将 35 μ L 的 100 μ M 序列为 HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’ 的 DNA 和 I mL 浓度为 22. 4 ηΜ的纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育18小时后，加蒸馏水稀释80倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液，上述纳米金颗粒的直径为25 nm,特异性DNA-纳米金探针的结构为AuNPs-HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’。(3)探针与样品反应及银染放大
取10 μ L上述步骤(2)所得的特异性DNA-纳米金探针溶液，与20 μ L的未知浓度的Hg2+试样混合,振荡摇勻15 min后,取3 μ L所得的混合溶液滴在娃烧化处理过的载玻片上，室温至试样点完全干燥后，在试样点上滴银染试剂5 μ L，准确计时，室温下暗箱静置15min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，干燥载玻片。上述银染试剂由组分A、组分B组成，其中，组分A为O. 25 g/mL的AgNO3溶液，组分B为含O. 0425 g/mL的氢醌、O. 064 g/mL的柠檬酸、O. 059 g/mL的柠檬酸三钠的混合溶液，临用前将组分A、组分B按体积比3 : 100混合即得银染试剂；
(4)金标银染信号的定量分析
第一步、用扫描仪将载玻片上的金标银染信号扫描成图片；
第二步、利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，每个像素点读出的灰度值介于O至255之间,全黑色最小为O,无色最大为255。考虑数据处理的方便,令信号的灰度值=255 —读出的灰度值，通过这种处理，信号的灰度值仍介于O至255之间，无色最小为0，全黑色最大为255，颜色越深，信号的灰度值越大；
第三步、因为金标银染信号大致为圆形，扫描出的图片周围有很多空白，不能计为有效像素点。因此，设置信号的灰度值阈值为10，也就是信号的灰度值>10时才计为有效像素点，得到有效像素点数目为32825个；
第四步、将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，得到金标银染信号的灰度总值为2297685 ；
第五步、用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，得到金标银染信号的灰度平均值为69. 9980198 ；
第六步、未知浓度的汞离子溶液，按照上述步骤获得金标银染信号及其灰度平均值，根据实例2建立的金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，求算出其准确浓度。根据求得的平均灰度值，带入线性方程y = 79. 75303 - 4. 9000*Igx，可知Hg2+浓度为 97. 7 ηΜ。实施案例5
闻选择性和闻灵敏性的检测试验
按照实施例3的方法分别检测混合溶液(含Pb2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Μη2+、Ζη2+，各离子浓度均为O. I mM)、0. I ηΜ的Hg2+溶液及空白溶液，结果如表I所示，说明本发明金标银染汞离子定量检测方法具有高选择性。表I
Γ: ' 7H ^· .Ti"V.f i
.T.. ...; K τ , r' < ···”·,λ ·ν· SS ·· ·、·· : d <Tr;
.........................——j..............mmmmmmmmmmmmmmmmm...................-|· ι..................................................w|
* . ,* ·ι 打 Β·U· · · ·f'V 4 I*... .."... ............_................·■■I
IAau f· :· ··* V '·, · ··· ·RI ΠΙ -NI "HI.ill NnIK :ΙΙ""Ι: IU mill. -H. Ij1 m■Ιμ.μH·- ..IiF L·.·11…I■ .Ii .,I"-" Λ_- II1Ii I" .!"IIIillliI
.>·> ! J j, ,ι ' · ■·. · · : :···，，·；
%........................................................................................ ........................................................................................Λ.....................................................................V....................................................................................................................................V
表 I 所示的数据表明混合溶液(含 Pb2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+，各离子浓度均为O. I mM)的平均灰度值与空白溶液的平均灰度值基本一致，而远远大于O. IηΜ的Hg2+溶液的平均灰度值，表明本检测方法具有高选择性且具有高灵敏度，常见金属离子 Pb2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+ 对检测无干扰。当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.ー种金标银染定量检测汞离子的方法，其特征在于具体包括以下步骤 (1)娃烧化载玻片的制备 将载玻片置于piranha洗液中，90-100°C加热20-40 min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入l-3wt%的3-氨丙基三こ氧基硅烷(APTES)溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用こ醇洗净后，于110-130°C真空干燥l_3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7 3的比例混合得到； (2)特异性DNA-纳米金探针溶液的制备 将 30-40ul 的 100 uM 序列为 HS-5’-rmTmTT-3’的 DNA 和 0. 5-1. 5 mL 浓度为 20-25nM的纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育12-20小时后，加蒸馏水稀释50-100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液； (3)探针与样品反应及银染放大 将步骤(2)所得的特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液按体积比1-3 :2-6混合，振荡摇勻10-20 min后,取2-4 uL滴在娃烧化载玻片上室温至试样点完全干燥后,在试样点上滴银染试剂4-6 uL，室温下暗箱静置10-20 min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，然后干燥载玻片； (4)金标银染信号的定量分析 将载玻片上的金标银染信号扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度。
2.根据权利要求I所述的ー种金标银染定量检测汞离子的方法，其特征在于步骤(2)中所述的纳米金颗粒的直径为15-30 nm，所述的特异性DNA纳米金探针的结构为AuNPs-HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’。
3.根据权利要求I所述的ー种金标银染定量检测汞离子的方法，其特征在于步骤(3)中所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含0. 25 g/mL的AgNO3溶液，组分B为0. 0425 g/mL的氢醌、0. 064 g/mL的朽1檬酸、0. 059g/mL的朽1檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3 : 100混合即得银染试剂。
4.根据权利要求I所述的ー种金标银染定量检测汞离子的方法，其特征在于步骤(4)的具体过程如下 A.用扫描仪将载玻片上的金标银染信号扫描成图片； B.利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，令信号的灰度值=255一读出的灰度值，使信号的灰度值仍介于0至255之间,无色最小为0,全黑色最大为255,顔色越深，信号的灰度值越大； C.设置信号的灰度值阈值为10，取信号的灰度值>10时的有效像素点，求出有效像素点数目； D.将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，即得金标银染信号的灰度总值； E.用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，即得到金标银染信号的灰度平均值； F.配制一系列不同浓度的汞离子溶液，按照前述步骤获得金标银染信号及其灰度平均值，建立金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系； G.根据上述步骤获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度。
5.一种金标银染定量检测汞离子的试剂盒，其特征在于包括硅烷化载玻片、特异性DNA-纳米金探针和银染试剂，所述的特异性DNA-纳米金探针在纳米金上结合有特异性DNA，所述的特异性DNA的序列如下HS-5’ -mmnTT-3’。
6.根据权利要求5所述的一种金标银染定量检测汞离子的试剂盒，其特征在于所述的纳米金颗粒的直径为15-30nm，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构为AuNPs-HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’。
7.根据权利要求5所述的一种金标银染定量检测汞离子的试剂盒，其特征在于所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含0. 25 g/mL的AgNO3溶液，组分B为0.0425 g/mL的氢醌、0. 064 g/mL的朽1檬酸、0. 059 g/mL的朽1檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3 : 100混合即得银染试剂。
全文摘要
本发明公开了一种金标银染定量检测汞离子的方法及其试剂盒，特点是包括将载玻片加热清洗干燥，浸入APTES溶液中，于室温下硅烷化处理再用乙醇洗净后，于110-130℃真空干燥1-3h后得到硅烷化载玻片的步骤；将DNA和纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育加水稀释得到特异性DNA-纳米金探针溶液的步骤；将特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液混合后，滴在硅烷化载玻片上室温至试样点完全干燥后，滴银染试剂暗箱静置后，立即用蒸馏水冲洗再干燥的步骤；最后进行金标银染信号的定量分析，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度的步骤。优点是具有高灵敏度、高选择性且可定量分析汞离子浓度，不仅操作简单而且可现场检测。
文档编号G01N21/78GK102759526SQ201210225980
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者杜书平, 王泽波, 郝婷婷, 郭智勇, 马青青 申请人:宁波大学