专利名称：纳米氧化铜为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法
技术领域：
本发明涉及纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法，属于分析化学和纳米技术领域。
背景技术：
胆固醇水平异常可出现于贫血、败血症、营养不良高血压、冠状动脉心脏疾病、动脉硬化、脑栓塞、脂代谢紊乱、心肌梗死等疾病。因此测定血液和食品中的胆固醇水平，在临床诊断和食品质量控制领域受到了广泛关注。常见的胆固醇分析方法包括非酶法、比色法、高效液相色谱法和电化学方法等。然而，这些方法往往存在如特异性和选择性差，试剂不稳定，成本高和标准化困难等缺点。因此，建立高灵敏度，高选择性，低成本和方便快捷的胆固醇水平检测技术具有重要的意义。 化学发光是基于反应体系中某些物质的分子吸收了反应所释放的能量而由基态跃迁到激发态，然后再由从激发态返回基态，同时将能量以光辐射的形式释放出来所产生的一种发光现象。基于分子发光强度和被测物质含量之间的关系建立的分析方法称为化学发光分析法。近年来化学发光法由于检测限低、测定快速、线性范围宽等优点已经在不同的领域引起了人们的广泛兴趣和关注，如分析化学、环境科学、临床医学等。近年来，对于化学发光的研究已拓展至以纳米材料来增加灵敏度和稳定性。纳米材料具有比表面积大、吸附性强、水溶性、高活性和高选择性等特性，随着纳米科技的发展，化学发光分析方法与纳米技术的结合无论是在优化化学发光反应的分析特性方面，还是在拓宽化学发光的应用范围等方面都获得了长足的发展。本发明利用胆固醇氧化酶催化胆固醇氧化产生过氧化氢，基于纳米氧化铜对过氧化氢氧化鲁米诺化学发光的催化作用，结合流动注射技术，提供了一种检测胆固醇的新方法。
发明内容
本发明的目的是利用胆固醇氧化酶催化胆固醇氧化产生过氧化氢，基于纳米氧化铜对过氧化氢氧化鲁米诺化学发光的催化作用，结合流动注射技术，提供了一种检测胆固醇的新方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
本发明所述的一种纳米氧化铜为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法，包括如下步骤将胆固醇、胆固醇氧化酶和磷酸盐缓冲溶液混合温浴后成反应液，将反应液稀释后，经蠕动泵运输进入混合器中与纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定胆固醇。本发明所述的纳米氧化铜为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法，其特征是鲁米诺溶液PH值为11.5。
本发明所述的纳米氧化铜为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法，其特征是鲁米诺溶液浓度为O. 2 mmol/Lo本发明所述的纳米氧化铜为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法，其特征是纳米氧化铜溶液浓度为I. O mg/L。本发明所述的一种纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定奶粉中胆固醇的方法，由以下步骤组成奶粉溶解于KOH/乙醇溶液中，水浴皂化，加入水和正己烷漩涡混匀，离心获得正己烷提取物；取正己烷提取物用氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解已吹干的正己烷提取物作为样品溶液；在EP管中分别加入上述的样品溶液、胆固醇氧化酶和磷酸盐缓冲溶液，所形成的混合液温浴形成反应液，将此反应液稀释，经蠕动泵运输进入混合器中与纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定奶粉中胆固醇。本发明所述的纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定奶粉中胆固醇的 方法，其特征是所述的奶粉2. O g溶解于10 ml 8.9 mol/ L的KOH/乙醇(5. O g KOH溶解于10 ml无水乙醇)溶液中，所述的KOH/乙醇溶液是指5. O g KOH溶解于10 ml无水乙醇形成的溶液，50 1水浴皂化I小时，加入10 ml水和20 ml正己烷漩涡混匀，然后5000rpm离心5分钟获得正己烷提取物；取上述的正己烷提取物氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解上述吹干的正己烷提取物作为样品溶液，在EP管中分别加入上述的样品溶液62. 5 μ 1,27. 7 U/ml胆固醇氧化酶25 μ I和10 mmol/L、pH 6. 5的磷酸盐缓冲溶液162. 5 μ 1，所形成的混合液37 °C温浴10分钟形成反应液，将此反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器中与I. O mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与0.2 mmol/L、pH 11. 5的鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定奶粉中胆固醇。本发明所述的一种纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定血清中游离胆固醇的方法，由以下步骤组成在血清样品中加入乙醇和水稀释，加入正己烷旋涡混匀，离心获得正己烷提取物，取正己烷提取物氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和TritonX-100混合溶剂重新溶解上述吹干的正己烷提取物作为样品溶液；在EP管中分别加入样品溶液、胆固醇氧化酶和磷酸盐缓冲溶液，所形成的混合液温浴形成反应液，将反应液稀释后，经蠕动泵运输进入混合器中与纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定血清中游离胆固醇。本发明所述的纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定血清中游离胆固醇的方法,其特征是在0. 2 ml血清样品中加入I. 8 ml无水乙醇和2. Oml水将其稀释20倍，加入4. O ml正己烷旋涡混匀，然后5000 rpm离心5分钟获得正己烷提取物；取正己烷提取物氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解上述吹干的正己烷提取物作为样品溶液；在EP管中分别加入样品溶液62. 5 μ 1,27.7 U/ml胆固醇氧化酶25 μ I和10 mmol/L、pH 6. 5的磷酸盐缓冲溶液162. 5 μ 1，混合液37 °C温浴10分钟形成反应液，将反应液稀释100倍后，经蠕动泵运输进入混合器中与I. O mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与0.2 mmol/L、pH 11. 5的鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定血清中游离胆固醇。本发明所述的一种纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定血清中总胆固醇的方法，由以下步骤组成在血清样品中加入KOH/乙醇溶液，水浴皂化，加入水和正己烷旋涡混匀，离心获得正己烷提取物，取正己烷提取物氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解上述吹干的正己烷提取物作为样品溶液，在EP管中分别加入样品溶液、胆固醇氧化酶和磷酸盐缓冲溶液，所形成的混合液温浴形成反应液，将反应液稀释后，经蠕动泵运输进入混合器中与纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定血清中总胆固醇。本发明所述的纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定血清中总胆固醇的方法，其特征是在O. 2 ml血清样品中加入I. 8 ml 8.9 mol/L的KOH/乙醇溶液，37 °〇水浴皂化I小时，所述的KOH/乙醇溶液是指5. O g KOH溶解于10 ml无水乙醇形成的溶液，加入2. O ml水和4. O ml正己烷旋涡混匀，然后5000 rpm离心5分钟获得正己烷提取物， 取正己烷提取物氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解上述吹干的正己烷提取物作为样品溶液，在EP管中分别加入样品溶液62. 5 μ 1,27.7 U/ml胆固醇氧化酶25 μ I和10 mmol/L、pH 6. 5的磷酸盐缓冲溶液162. 5 μ 1，所形成的混合液37 V温浴10分钟形成反应液，将反应液稀释100倍后，经蠕动泵运输进入混合器中与
1.0mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合,而后与O. 2 mmol/L、pH 11. 5的鲁米诺溶液混合,三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定血清中总胆固醇。具体如下
(一)纳米氧化铜的制备
取硝酸铜溶液和冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾，快速加入氢氧化钠溶液，加完后，继续搅拌后，得到黑色氧化铜沉淀。将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体。将纳米氧化铜粉体分散于二次蒸馏水中得到棕色纳米氧化铜胶体溶液。纳米氧化铜具体制备步骤如下
(1)取0.02mol/L的硝酸铜溶液150 ml和0. 5ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；
(2)快速加入0.04g/ml的氢氧化钠溶液10 ml，加完后，继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；
(3)将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，即得直径为6nm的纳米氧化铜粉体。(二)流动注射化学发光体系
流动注射化学发光分析系统如图I所示，首先纳米氧化铜胶体溶液与样品溶液分别经蠕动泵运输进入混合器混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。所述的鲁米诺溶液pH值优选为11. 5，鲁米诺溶液浓度优选为0. 2 mmol/L ;纳米氧化铜溶液浓度优选为I. O mg/L。(三)胆固醇的测定在EP管中分别加入不同浓度的胆固醇、胆固醇氧化酶和磷酸盐缓冲溶液，混合液温浴后，将反应液稀释后作为样品溶液，经蠕动泵运输进入混合器与纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。以化学发光强度对胆固醇浓度作图得到标准曲线。将胆固醇标准溶液更换为食品或血清样品，可用于食品或血清中胆固醇浓度的检测。上述反应液稀释倍数按实际试验稀释，具体倍数可以是50倍、100倍等均可，本发明优选100倍。上述混合液温浴温度是可以在37 °C的温度温�。泳咛迨匝橐蠖ǎ馐且话慵际跞嗽蹦苁迪值募际�。本发明的优点本发明所述的纳米氧化铜可催化鲁米诺氧化，增强胆固醇测定中的化学发光信号，增强倍数约为600，利用胆固醇-胆固醇氧化酶-鲁米诺-纳米氧化铜流 动注射化学发光法可对胆固醇含量进行测定，线性范围为O. 625^12. 5 umol/L。该方法灵敏度高、重现性好、样品需求量少、检测速度快，可应用于食品与血液中胆固醇含量的检测。
图I为流动注射化学发光分析系统示意图。图2为纳米氧化铜对化学发光信号的增强作用图。图3为鲁米诺溶液pH值对化学发光的影响图。图4为鲁米诺溶液浓度对化学发光的影响图。图5为纳米氧化铜溶液浓度对化学发光的影响图。图6为胆固醇氧化酶浓度对化学发光的影像图。图7为测定胆固醇的标准曲线图。
具体实施例方式(一)取硝酸铜溶液和冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾，快速加入氢氧化钠溶液，加完后，继续搅拌后，得到黑色氧化铜沉淀。将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体。将纳米氧化铜粉体分散于二次蒸馏水中得到棕色纳米氧化铜胶体溶液。
纳米氧化铜具体制备步骤如下
(1)取O.02 mol/L的硝酸铜溶液150 ml和O. 5 ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；
(2)快速加入O.04 g/ml的氢氧化钠溶液10 ml，加完后，继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；
(3)将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，即得直径为6nm的纳米氧化铜粉体。(二)流动注射化学发光体系
流动注射化学发光分析系统如图I所示，首先纳米氧化铜胶体溶液与样品溶液分别经蠕动泵运输进入混合器混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。
所述的鲁米诺溶液pH值优选为11. 5，鲁米诺溶液浓度优选为O. 2 mmol/L ;纳米氧化铜溶液浓度优选为I. O mg/L。
实施例I :
将胆固醇溶解于异丙醇和Triton X-100 (18: 7，V/V)中配制成5 mmol/L的溶液。在EP管中分别加入5 mmol/L胆固醇溶液62. 5 μ 1,27. 7 U/ml胆固醇氧化酶25μ I和10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6. 5)162. 5 μ 1，混合液37 °C温浴10分钟，将反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器与I. O mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与0. 2mmol/L鲁米诺溶液(pH 11. 5)混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。空白对照试验中以蒸馏水代替纳米氧化铜胶体溶液。如图2所示，纳米氧化铜可显著增强化学发光信号，增强倍数约为600。实施例2
将胆固醇溶解于异丙醇和Triton X-100 (18: 7，V/V)中配制成5 mmol/L的溶液。在EP管中分别加入5 mmol/L胆固醇溶液62. 5 μ 1,27. 7 U/ml胆固醇氧化酶25μ I和10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6. 5)162. 5 μ 1，混合液37 °C温浴10分钟，将反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器与I. O mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与不同pH值(取10. 5^13之间值)0. 2 mmol/L鲁米诺溶液混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。如图3所示，化学发光信号比值随着pH的增大而增大并在pH为11. 5时达到峰值，继续增大pH值则发光信号比值减小。实施例3
将胆固醇溶解于异丙醇和Triton X-100 (18: 7，V/V)中配制成5 mmol/L的溶液。在EP管中分别加入5 mmol/L胆固醇溶液62. 5 μ 1,27. 7 U/ml胆固醇氧化酶25μ I和10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6. 5)162. 5 μ 1，混合液37 °C温浴10分钟，将反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器与I. O mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与不同浓度(取0. 0Γ1. O mmol/L之间值)鲁米诺溶液(pH 11. 5)混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。如图4所示，化学发光信号随着鲁米诺浓度的增大而增大并在浓度为0. 2 mmol/L时达到峰值,继续增大鲁米诺浓度则发光信号减小。实施例4:
将胆固醇溶解于异丙醇和Triton X-100 (18: 7，V/V)中配制成5 mmol/L的溶液。在EP管中分别加入5 mmol/L胆固醇溶液62. 5 μ 1,27. 7 U/ml胆固醇氧化酶25μ I和10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6. 5)162. 5 μ 1，混合液37 °C温浴10分钟，将反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器与不同浓度(取0. 2^15 mg/L之间值)纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与0.2 mmol/L鲁米诺溶液(pH 11. 5)混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。如图5所示，化学发光信号随着纳米氧化铜浓度的增大而增大并在浓度为1.0 mg/L时达到峰值，继续增大纳米氧化铜浓度则发光信号减小。实施例5
将胆固醇溶解于异丙醇和Triton X-100 (18: 7，V/V)中配制成5 mmol/L的溶液。在EP管中分别加入5 mmol/L胆固醇溶液62. 5 μ I、不同浓度(取0 27. 7 U/ml之间值)胆固醇氧化酶25 μ I和10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6. 5) 162. 5 μ 1，混合液37°C温浴10分钟，将反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器与I. O mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与O. 2 mmol/L鲁米诺溶液(pH 11. 5)混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。如图6所示，化学发光信号随着胆固醇氧化酶浓度的增大而增大。实施例6
将胆固醇溶解于异丙醇和Triton X-100 (18:7，V/V)中配制成不同浓度的溶液。在EP管中分别加入不同浓度的胆固醇溶液62. 5 μ 1、27. 7 U/ml胆固醇氧化酶25μ I和10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6. 5)162. 5 μ 1，混合液37 °C温浴10分钟，将反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器与I. O mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与O. 2mmol/L鲁米诺溶液(pH 11. 5)混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。以化学发光强度的对数值对胆固醇浓度的对数值作图得到标准曲线。如图 7所示，化学发光信号的对数值与胆固醇浓度的对数值在O. 625^12. 5 μ mol/L范围内呈线性关系。实施例7
2.0g奶粉溶解于10 ml 8.9 mol/ L的KOH/乙醇(5. O g KOH溶解于10 ml无水乙醇)溶液中，50 1水浴皂化I小时，加入10 ml水和20 ml正己烷漩涡混匀，然后5000 rpm离心5分钟。取正己烷提取物氮气吹干，用异丙醇和Triton X-100 (18:7, V/V)重新溶解作为样品溶液。在EP管中分别加入样品溶液62. 5 μ 1,27. 7 U/ml胆固醇氧化酶25 μ I和10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.5)162.5 μ 1，混合液37 °C温浴10分钟，将反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器与I. O mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与0.2 mmol/L鲁米诺溶液(pH 11. 5)混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。由胆固醇标准曲线中计算出的胆固醇浓度与高效液相色谱法测试得到的数据一致，由此可见本发明的方法可靠适用。实施例8
在0. 2 ml血清样品中加入I. 8 ml无水乙醇和2. O ml水将其稀释20倍，加入4. O ml正己烧旋润混勻，然后5000 rpm离心5分钟。取正己烧提取物氮气吹干,用异丙醇和TritonX-100 (18:7，V/V)重新溶解作为样品溶液。在EP管中分别加入样品溶液62. 5 μ 1,27.7U/ml胆固醇氧化酶25 μ I和10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6. 5) 162. 5 μ 1，混合液37°C温浴10分钟，将反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器与I. O mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与0. 2 mmol/L鲁米诺溶液(pH 11. 5)混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测。由胆固醇标准曲线中计算出的血清中游离胆固醇的浓度与全自动生化分析仪测试得到的数据一致，由此可见本发明的方法可靠适用。实施例9
在0. 2 ml血清样品中加入I. 8 ml 8. 9 mol/L的KOH/乙醇溶液(5. O g KOH溶解于10ml无水乙醇)，37 1水浴皂化I小时，加入2. O ml水和4. O ml正己烷旋涡混匀，然后5000rpm离心5分钟。取正己烧提取物氮气吹干,用异丙醇和Triton X-100 (18:7，V/V)重新溶解作为样品溶液。在EP管中分别加入样品溶液62. 5 μ 1,27.7 U/ml胆固醇氧化酶25μ I和10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6. 5)162. 5 μ 1，混合液37 °C温浴10分钟，将反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器与I. O mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与0. 2mmol/L鲁米诺溶液(pH 11. 5)混合，三者混合进入流动池反应，产生的化学发光强度经光
电倍增管检测。由胆固醇标准曲线中计算出的血清中总胆固醇的浓度与全自动生化分析仪测试得到的数据一致，由此可见本发明的方法可靠适用。
权利要求
1.一种纳米氧化铜为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法，包括如下步骤将胆固醇、胆固醇氧化酶和磷酸盐缓冲溶液混合温浴后成反应液，将反应液稀释后，经蠕动泵运输进入混合器中与纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定胆固醇。
2.根据权利要求I所述的纳米氧化铜为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法，其特征是鲁米诺溶液pH值为11. 5。
3.根据权利要求I所述的纳米氧化铜为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法，其特征是鲁米诺溶液浓度为0. 2 mmol/Lo
4.根据权利要求I或2或3所述的纳米氧化铜为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法，其特征是纳米氧化铜溶液浓度为1.0 mg/L。
5.一种纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定奶粉中胆固醇的方法，由以下步骤组成奶粉溶解于KOH/乙醇溶液中，水浴皂化，加入水和正己烷漩涡混匀，离心获得正己烷提取物；取正己烷提取物用氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解已吹干的正己烷提取物作为样品溶液；在EP管中分别加入上述的样品溶液、胆固醇氧化酶和磷酸盐缓冲溶液，所形成的混合液温浴形成反应液，将此反应液稀释，经蠕动泵运输进入混合器中与纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定奶粉中胆固醇。
6.根据权利要求5所述的纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定奶粉中胆固醇的方法，其特征是所述的奶粉2.0 g溶解于10 ml 8.9 mol/ L的KOH/乙醇(5.0 g KOH溶解于10 ml无水乙醇)溶液中，所述的KOH/乙醇溶液是指5.0 g KOH溶解于10 ml无水乙醇形成的溶液，50 1水浴皂化I小时，加入10 ml水和20 ml正己烧漩涡混匀，然后5000rpm离心5分钟获得正己烷提取物；取上述的正己烷提取物氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解上述吹干的正己烷提取物作为样品溶液，在EP管中分别加入上述的样品溶液62. 5 u 1,27. 7 U/ml胆固醇氧化酶25 和10 mmol/L、pH 6. 5的磷酸盐缓冲溶液162. 5 Ul，所形成的混合液37 °C温浴10分钟形成反应液，将此反应液稀释100倍，经蠕动泵运输进入混合器中与I. 0 mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与0.2 mmol/L、pH 11. 5的鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定奶粉中胆固醇。
7.—种纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定血清中游离胆固醇的方法，由以下步骤组成在血清样品中加入乙醇和水稀释，加入正己烷旋涡混匀，离心获得正己烷提取物，取正己烷提取物氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解上述吹干的正己烷提取物作为样品溶液；在EP管中分别加入样品溶液、胆固醇氧化酶和磷酸盐缓冲溶液，所形成的混合液温浴形成反应液，将反应液稀释后，经蠕动泵运输进入混合器中与纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定血清中游离胆固醇。
8.根据权利要求7所述的纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定血清中游离胆固醇的方法,其特征是在0. 2 ml血清样品中加入I. 8 ml无水乙醇和2. Oml水将其稀释20倍，加入4. 0 ml正己烷旋涡混匀，然后5000 rpm离心5分钟获得正己烷提取物；取正己烷提取物氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解上述吹干的正己烷提取物作为样品溶液；在EP管中分别加入样品溶液62. 5 u 1,27. 7 U/ml胆固醇氧化酶25 ill和10 mmol/L、pH 6. 5的磷酸盐缓冲溶液162. 5 U 1，混合液37 °〇温浴10分钟形成反应液，将反应液稀释100倍后，经蠕动泵运输进入混合器中与I. 0 mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与0.2 mmol/L、pH 11. 5的鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定血清中游离胆固醇。
9.一种纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定血清中总胆固醇的方法，由以下步骤组成在血清样品中加入KOH/乙醇溶液，水浴皂化，加入水和正己烷旋涡混匀，离心获得正己烷提取物，取正己烷提取物氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解上述吹干的正己烷提取物作为样品溶液，在EP管中分别加入样品溶液、胆固醇氧化酶和磷酸盐缓冲溶液，所形成的混合液温浴形成反应液，将反应液稀释后，经蠕动泵运输进入混合器中与纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定血清中总胆固醇。
10.根据权利要求9所述的纳米氧化铜作为催化剂的流动注射化学发光测定血清中总胆固醇的方法,其特征是在0. 2 ml血清样品中加入I. 8 ml 8. 9 mo I/L的KOH/乙醇溶液，37 1水浴皂化I小时，所述的KOH/乙醇溶液是指5. 0 g KOH溶解于10 ml无水乙醇形成的溶液，加入2.0 ml水和4.0 ml正己烷旋涡混匀，然后5000 rpm离心5分钟获得正己烷提取物，取正己烷提取物氮气吹干，用体积比为18:7的异丙醇和Triton X-100混合溶剂重新溶解上述吹干的正己烷提取物作为样品溶液，在EP管中分别加入样品溶液62. 5 u 1,27. 7U/ml胆固醇氧化酶25 ill和10 mmol/L、pH 6. 5的磷酸盐缓冲溶液162. 5 yl，所形成的混合液37 °C温浴10分钟形成反应液，将反应液稀释100倍后，经蠕动泵运输进入混合器中与I. 0 mg/L纳米氧化铜胶体溶液混合,而后与0. 2 mmol/L、pH 11. 5的鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定血清中总胆固醇。
全文摘要
本发明公开一种纳米氧化铜为催化剂的流动注射化学发光测定胆固醇的方法，包括如下步骤将胆固醇、胆固醇氧化酶和磷酸盐缓冲溶液混合温浴后成反应液，将反应液稀释后，经蠕动泵运输进入混合器中与纳米氧化铜胶体溶液混合，而后与鲁米诺溶液混合，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定胆固醇。利用胆固醇氧化酶催化胆固醇氧化产生过氧化氢，结合流动注射技术，增强胆固醇测定中的化学发光信号，增强倍数约为600，利用胆固醇-胆固醇氧化酶-鲁米诺-纳米氧化铜流动注射化学发光法对胆固醇含量进行测定，线性范围为0.625~12.5umol/L。可应用于食品中胆固醇含量测定以及血清中游离胆固醇与总胆固醇的测定。
文档编号G01N21/76GK102798627SQ201210272449
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者陈伟, 洪磊, 刘爱林, 李光文, 林新华 申请人:福建医科大学
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