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专利名称：一种从蚕体提取的墨蝶呤的鉴定方法
技术领域：
本发明属色素种类的鉴定技术领域，尤其涉及一种从蚕体提取的墨蝶呤的鉴定方法。
背景技术：
墨蝶呤(sepiapterin)是ー种黄色的蝶唳类化合物，分子式为C9H11N5O3,分布于许多生物体内，但正常情况下含量极微。对于哺乳动物而言，墨蝶呤是生成四氢生物蝶呤(BH4)的前体物质之一。BH4是催化生成多巴胺、5-羟色胺等神经传导递质的酶类的重要辅酶。大量动物实验和临床研究证明，补充BH4对BH4缺陷型疾病有明显的治疗效果，ネト充墨蝶呤对某些疾病也有良好的治疗效果。黄体色蚕是家蚕的一种突变体，其幼虫体壁含有大量的墨蝶呤色素、墨蝶呤的脱氨产物和少量的核黄素，因此黄体色蚕是回收天然墨蝶呤的宝贵资源。我们利用溶剂浸提法和柱层析法将黄体色蚕体内的色素分离、纯化得到两 种不同的色素。目前对墨蝶呤及其脱氨产物的鉴定方法仅有纸色谱法和紫外可见吸收光谱法。其中纸色谱法操作程序复杂，虽然能够根据Rf值对墨蝶呤进行简单的定性分析，但是不能确定所提取的墨蝶呤的纯度以及含量的多少；紫外吸收光谱法和高效液相色谱法都能对物质进行定性定量分析，相比之下高效液相色谱法具有更高的准确度。高效液相做为ー种重要的色谱方法具有分辨率高、速度快、重复性高、自动化操作、分析精确度高、色谱柱可反复使用等优点，它不仅能对物质进行定性分析，同时也能够准确的測定出物质的含量，但目前还没有用高效液相色谱法对从蚕体提取的墨蝶呤进行鉴定的研究。本发明正是基于用高效液相色谱法对从黄体色蚕体表分离得到的两种色素的种类进行鉴定的研究创造而成。

发明内容
本发明的目的是提拱ー种操作精密度高、简便、准确、重复性好、稳定性好，有效的从蚕体提取的墨蝶呤的鉴定方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种从蚕体提取的墨蝶呤的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤
(1)、将蚕体的体壁按照料液比1:20加入50%こ醇匀浆，煮沸IOmin左右，离心，浓縮，经ECTE0LA纤维素柱分离得到两种色素，即色素A和色素B，分别将两种色素依次经Sephadex G_25_150柱和磷酸纤维素柱纯化，最后得到两种色素的高纯度粉末；
(2)、将墨蝶呤标准品和两种提取的色素的高纯度粉末分别溶于2ml超纯水中，用
0.45um滤膜过滤，滤液供试；
(3)、色谱条件用ODSC18色谱柱，选用超纯水、浓度>99. 9%的甲醇和浓度>99. 9%的冰こ酸的混合液为流动相，将流动相用0.45um膜过滤，超声脱气20min，流速为lml/min，柱温为25°C，进样量20ul，检测波长为420nm;
(4)、按照(3)中的色谱条件平衡系统，平衡至基线漂移小于0.01mV/min，噪声小于
0.OOlmV ;待系统平衡好后，分别进样分析墨蝶呤标准品和两种提取的色素，通过样品的保留时间对墨蝶呤进行鉴定分析。所述的ー种对从蚕体提取的墨蝶呤进行鉴定的方法，其特征在于步骤(3)的ODSC18色谱柱规格为为250mm X 4. 6mm，填料粒度为5um。所述的ー种对从蚕体提取的墨蝶呤进行鉴定的方法，其特征在于步骤(3)的超纯水、99. 9%甲醇、99. 9%冰こ酸的体积比为79. 5:20:0. 5。本发明的有益效果 1、本发明所用的流动相为甲醇-0.006%こ酸混合液，体积比为20:80，当使用此流动相时从蚕体提取的两种色素的保留时间明显不同，根据标样墨蝶呤的保留时间，可有效地对从蚕体提取的色素进行鉴定分析；
2、本发明所用的柱温为25°C，因为色谱过程中的強度和温度影响墨蝶呤的稳定性，都能使其被氧化成其他物质，所以把柱温设定为25°C，可以有效地防止墨蝶呤在色谱分析的过程中被氧化；
3、本发明所使用的检测波长为420nm，根据墨蝶呤的紫外可见吸收光谱，墨蝶呤在269nm和420nm处有最大吸收波峰，因此本发明选择墨蝶呤的最大吸收波长之一 420nm为检测波长；
4、本发明操作精密度高、简便、准确、重复性好、稳定性好，可有效地对从蚕体提取的墨蝶呤进行定性定量分析。


图I为墨蝶呤标准品的HPLC色谱 图2为色素A的HPLC色谱 图3为色素B的HPLC色谱图。
具体实施方式
、
5龄黄体色家蚕幼虫体壁10g，按照料液比1:20加入50%こ醇，经ECTE0LA纤维素柱分离得到两种色素，分别将两种色素依次经S印hadex G-25-150柱和磷酸纤维素柱纯化，最后得到两种色素的高纯度粉末色素A和色素B。将色素A、色素B和墨蝶呤标准品分别溶于适量超纯水中，用0. 45um滤膜过滤。用ODS C18色谱柱(250mmX4. 6mm，5um)，以甲醇-0. 006%こ酸混合液(体积比20:80)为流动相，在流速为lml/min，柱温为25°C，进样量20ul，检测波长为420nm的色谱条件分别对墨蝶呤标样、色素A和色素B进行鉴定分析。结果如下图所示，色素A的保留时间(图2)与墨蝶呤标样(图I)一致，而色素B的保留时间与墨蝶呤标样截然不同(图3)，即可说明色素A为墨蝶呤。同时，本研究进行了精密度、稳定性和重复性的測定，测得的相对标准偏差分别为0. 17%、0. 18%,3. 46%，结果表明本发明的精密度、稳定性和重复性良好。本实施例所用的高效液相色谱仪是岛津LC-20AT型，紫外检测仪为SPD-20AV ；
本实施例所用的色谱柱为岛津ODS C18 (250mmX4. 6mm, 5um)；
本实施例所用的流动相为甲醇-0. 006%こ酸混合液，体积比为20:80，当使用此流动相时从蚕体提取的两种色素的保留时间明显不同，根据标样墨蝶呤的保留时间，可有效地对从蚕体提取的色素进行鉴定分析；
本实施例所用的流动相的流速为lml/min ；本实施例所用的柱温为25°C，因为色谱过程中的強度和温度影响墨蝶呤的稳定性，都能使其被氧化成其他物质，所以把柱温设定为25°C，可以有效地防止墨蝶呤在色谱分析的过程中被氧化；
本实施例所使用的检测波长为420nm，根据墨蝶呤的紫外可见吸收光谱，墨蝶呤在 269nm和420nm处有最大吸收波峰，因此本实施例选择墨蝶呤的最大吸收波长之一 420nm为检测波长。
权利要求
1.一种从蚕体提取的墨蝶呤的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)、将蚕体的体壁按照料液比1:20加入50%こ醇匀浆，煮沸IOmin左右，离心，浓縮，经ECTEOLA纤维素柱分离得到两种色素，即色素A和色素B，分别将两种色素依次经Sephadex G_25_150柱和磷酸纤维素柱纯化，最后得到两种色素的高纯度粉末； (2)、将墨蝶呤标准品和两种提取的色素的高纯度粉末分别溶于2ml超纯水中，用0.45um滤膜过滤，滤液供试； (3)、色谱条件用ODSC18色谱柱，选用超纯水、浓度>99. 9%的甲醇和浓度>99. 9%的冰こ酸的混合液为流动相，将流动相用0.45um膜过滤，超声脱气20min，流速为lml/min，柱温为25°C，进样量20ul，检测波长为420nm ； (4)、按照(3)中的色谱条件平衡系统，平衡至基线漂移小于0.01mV/min，噪声小于0.OOlmV ;待系统平衡好后，分别进样分析墨蝶呤标准品和两种提取的色素，通过样品的保留时间对墨蝶呤进行鉴定分析。
2.根据权利要求I所述的ー种对从蚕体提取的墨蝶呤进行鉴定的方法，其特征在于步骤(3)的ODS C18色谱柱规格为250mmX 4. 6mm，填料粒度为5um。
3.根据权利要求I所述的ー种对从蚕体提取的墨蝶呤进行鉴定的方法，其特征在于步骤(3)的超纯水、99. 9%甲醇、99. 9%冰こ酸的体积比为79. 5:20:0. 5。
全文摘要
本发明公开了一种从蚕体中提取的墨蝶呤的鉴定方法，该方法利用高效液相色谱法，色谱条件为以ODSC18为色谱柱，以甲醇-0.006%乙酸混合液为流动相，流速为1ml/min,柱温为25℃，进样量20ul，检测波长为420nm。按照该色谱条件对所提取的色素进行分析，能够有效地鉴定出目标产物墨蝶呤。本发明具有精密度高、简便、准确、重复性好、稳定性好等优势，为从蚕体提取墨蝶呤的鉴定提供了一种简便、高效，精准的方法。
文档编号G01N30/02GK102650621SQ20121013330
公开日2012年8月29日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者刘朝良, 孟艳, 王敬, 王文静, 高俊山 申请人:安徽农业大学