专利名称：在整体斑马鱼上进行酶联免疫吸附检测的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶联免疫吸附法，更具体地说，涉及一种在整体斑马鱼上进行 酶联免疫吸附检测的方法，以及此方法在鉴别基因毒性化合物、筛选抗肿瘤药物、修复 DNA损伤的药物中的应用。
背景技术：
基因毒性是指直接或间接的细胞DNA损伤。DNA是细胞内具有遗传信息传递 作用的一种重要的生物大分子，是生物化学与分子生物学的重要研究对象。DNA分子 由反平行的两条多聚核苷酸链经由碱基配对原则构成双螺旋结构，其所携带的遗传信息 由多核苷酸链上的碱基的种类、数量以及排列次序决定，碱基序列深藏于DNA双螺旋的 内部，两条多核苷酸链组成的双螺旋结构形成了稳定的DNA分子并使其能够正确传递遗 传信息(Phillips DH, Arlt VM.Genotoxicity damage toDNA and its consequences.EXS.， 2009,99:87-110.)。然而外界的各种理化及生物因子都可能引起DNA损伤。这些损 伤的形式有单链DNA链损伤，双链DNA损伤、嘧啶二聚体的形成、DNA加合物、点突 变、DNA交联等(马云彤，齐浩，罗明志，细胞DNA单链断裂检测技术.西安文理学院 学报，2005，8(3) 22-25.)。随着工农业的发展与人民生活水平的提高，日常生活中可以造成DNA损伤的化 学物质越来越多，如生物生化药物、工业化学产品、农业化学产品(如农药、除草剂)、 纯天然(植物)产品、食品添加剂、营养保健品、护肤美容产品、工业三废。如果各种 化学物质造成的DNA损伤发生在生殖细胞，则可能会影响生殖细胞遗传稳定性，并可能 对后代产生影响，例如引起流产、死胎、畸形和某些遗传疾病。如果DNA损伤发生在体 细胞中，则有可能造成疾病包括癌症，威胁人类健康(柴国林，朱卫国，DNA的损伤与 修复，中华肿瘤杂志，2005，27(10) 557-580.)。同时对于基因毒性研究(Genotoxicity Study)也是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致突变和致 癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市前必需的毒性检 测资料。癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，攻克癌症一直是世界瞩目的研究课 题。世界卫生组织调查表明癌症患者正在逐年增加，我国癌症年发病人数在120万左 右，每年死于癌症的人数高达90万人以上，现已成为仅次于心血管病的第二大杀手(刘 峰，魏新庭，王冬冬，孙德志，李林尉，抗癌药物的研究现状，聊城大学学报2006， 19:39-43.)。利用基因毒性化合物可以造成癌细胞DNA损伤的性质，基因毒性化合物 有可能用于癌症的治疗。当细胞受到DNA损伤的刺激时，基因组的完整性面临威胁，将产生一系列生物 学效应。DNA损伤无法修复时，将诱导细胞凋亡。细胞凋亡是在生理条件下细胞基因 编码引导的细胞程序性死亡，所以又称为细胞程序死亡。它保证细胞增殖及细胞死亡之 间平衡，是正常生理过程的一部分，是由基因控制的细胞自我消亡过程。细胞凋亡在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟以及维持正常组织和器官的细胞数目恒定与生长平衡， 甚至人体衰老及疾病发生中都起着重要的作用。由于凋亡存在缺陷，细胞死亡程序异常 表达，或者凋亡细胞死亡程序执行有缺陷以及凋亡受到促进，都与疾病发病有关。包括 肿瘤、神经退行性疾病。因而我们可以通过筛选基因毒性药物，调控细胞凋亡。同样， 筛选DNA修复剂，对疾病防治和抗衰老具有重大的现实意义(蒋雪，杨宏莉，细胞凋亡 及其在肿瘤发生发展和治疗中的作用，临床荟萃，1997，12(17) 774-776.)。利用检测DNA单链损伤的方法是筛选基因毒性化合物的有效方法(柴国林，朱 卫国，DNA的损伤与修复，中华肿瘤杂志，2005，27(10) 557-580.),因为在哺乳动物 细胞中DAN单链损伤是发生频率最高的DNA损伤类型。当前鉴别DNA单链损伤的方法，主要是单细胞凝胶电泳(彗星实验)和微核试 验，也是目前最主要的筛选基因毒性化合物方法。单细胞凝胶电泳(singlecell gel electrophoresis assay，简称 SCGE，又名彗星试 验，comet assay)是一个广泛用于真核生物基因毒性检测的手段。该技术是由Ostling于 1984年首创，又由Singh和Olive分别加以改进，形成了目前的碱性和中性裂解二类方 法。其基本原理是在中性或碱性条件下，包埋在琼脂凝胶中的细胞裂解，DNA解螺旋 后进行电泳，如细胞未受损伤，DNA断片较少，片段较大，电泳时DNA因其分子质量大 而停留在核基质中，经荧光染色后呈圆形的荧光团无拖尾现象；若细胞受损，DNA断片 较多，在碱性条件下DNA解螺旋变为单链，电泳时因DNA分子量小可以进入凝胶中， 向阳极伸展，荧光显微镜下呈一个亮的头部和尾部，形似彗星，故又称彗星试验(Klaude M, Eriksson S，Nygren J, Ahnstrom G， The cometassay mechanisms and technical considerations, Mutation Research, 1996，363(2) 89-96.)。细胞和 DNA 受损越严重， 产生的断片越多并且片段越�。缬臼鼻ㄒ频腄NA量也就越大，迁移距离越长，荧光 显微镜下可观察尾长增加、尾部荧光强度增强，通过测定迁移部份的光密度和迁移长度 就可测定单个细胞的DNA损伤程度。其操作过程包括胶板制备、细胞裂解、电泳、 中和、染色、镜检、分析(李宏，微核试验的研究进展，安徽农业科学，2009，37(7) 2864-2866.)。另一种方法是微核试验，它是以动植物为材料，利用细胞生物学方法观 察其出现的微核率来表示材料受遗传损伤程度的一种检测基因毒物的方法。微核 (micronucleus, MN)是指位于生物细胞的细胞质中独立于主核，直径小于主核1/20 1/3，完全与主核分开的圆形或椭圆形的微小核。它可以是整条染色体，也可以是染色体 断片，染色性与主核一致，其中部分微核具有DNA复制能力。微核是由于外界损害因素 使染色体发生断裂，细胞进入下一次分裂时，染色体不能随有丝分裂进入子细胞，而导 致染色体丢失或断裂，从而形成一个或数个小核。微核率是指生物材料经细胞生物学方 法制片后，在显微镜下观测1000个细胞当中微核细胞所占的比率，也可以是以每个细胞 当中含微核数的平均值来计算。具体操作步骤包括涂片、固定、染色、封片、观察与 计数、分析(王兰，刘心荣，单细胞凝胶电泳技术的应用和发展，中国卫生检验杂志， 2008，12(18) 2829-2831.)。这两种方法可以在体外水平上检测基因毒性，任何真核细胞都能用于体外基因 毒性研究，最常用的细胞是人外周血淋巴细胞，鼠外周血淋巴细胞和骨髓红细胞。但是在体外试验中由于细胞不是在体内环境中，没有药物的吸收、分布、代谢、排泄过程， 试验的结果并不能反映药物体内的真实情况，并且这些试验中假阳性结果很普遍，特别 是微核试验，该方法简单，但可信度较低。微核检测将细胞制成图片，固定染色后用显 微镜计数1000多个染红细胞的微核数，技术工作量极大，人为影响因素多，且容易出现 微核误判，操作过程复杂，重复性差。这两个试验也可以通过体内试验鉴别化合物基因毒性，最常用的动物模型是啮 齿动物，大多数体内实验通过药物直接处理实验动物，然后取动物的组织或者血液，制 成单细胞悬液，然后在进行单细胞凝胶电泳或者微核试验。这种类型的体内试验实际上 是体内试验(化合物处理)与体外试验(动物细胞基因毒性分析)相结合的办法，通常实 验周期长，操作复杂，价格昂贵，特异性差，而且不可以进行高通量筛选，假阳性结果 尚O而后出现了利用斑马鱼检测化合物的基因毒性的方法，主要有如下几种方法1)体内实验通过化合物处理斑马鱼、幼鱼或者成鱼，然后将斑马鱼幼鱼、 胚胎碾碎或者取成年斑马鱼的组织或者血液，制成单细胞悬液，通过胶板制备、细胞 裂解、电泳、中和、染色、镜检、分析，利用彗星实验鉴别化合物的基因毒性(Jarvis RB, Knowles JF, DNA damage in zebrafish larvae induced by exposure tolow-dose rate Y -radiation detection by the alkaline comet assay, Mutation Research, 2003, 541 63-69.)。或者是将斑马鱼幼鱼、胚胎碾碎或者取成年斑马鱼的组织或者血液，固定后， 吉姆萨染色，观察细胞中出现微核的概率(Oliveira R，Dominguesl, Effectsoftriclosanon zebrafish early—life stages and adults.Environ.Sci.Pollut.Res.，2009, 16: 679—688.)。但是这 两种方法操作复杂，容易产生假阳性结果，不能进行高通量筛选。2)体外实验将斑马鱼的肝脏细胞进行原代培养，利用待测化合物处理细胞一 段时间，通过彗星实验鉴别基因毒性(Sun LW，Qu MM, Li YQ, et al，Toxic Effectsof Aminophenols on Aquatic Life Using the Zebrafish Embryo Test and the CometAssay.Bull. Environ.Contam.Toxicol., 2004，73: 628-634.)，虽然该方法试验周期短，可以进行高 通量筛�。遣僮鞲丛�、假阳性结果多，更重要的是细胞在体外没有药物的吸收、分 布、代谢、排泄过程，试验的结果并不能反映化合物在体内的真实情况。与单细胞凝胶电泳和彗星实验相比，上述方法具有成本低、用药量少、操作较 简单等优点，但仍存在实验周期长、操作仍然较为复杂、特异性差，而且不可以进行高 通量筛选，假阳性结果高。
发明内容
本发明的目的是解决以上提出的问题，提供一种成本低、用药量少、操作较简 单、实验周期短、可以进行高通量筛选、预测性强、敏感度高、假阳性率低的一种在整 体斑马鱼上进行酶联免疫吸附检测的方法，以及此方法在鉴别基因毒性化合物及筛选抗 肿瘤药物、修复DNA损伤药物中的应用。本发明的技术方案是这样的一种在整体斑马鱼上进行酶联免疫吸附检测的方法，步骤如下1)固定
整体斑马鱼在含有固定液的微孔板中固定，时间为15-17小时；2)水化2.1)将斑马鱼在20-25°C室温下放置5-10分钟；2.2)在不同浓度的甲醇-含0.1 % Tween-20磷酸缓冲液(PBST)溶液中水化，步 骤如下①20-25°C室温下，在10-20ml的75%甲醇/25%含0.1 % Tween-20磷酸缓冲液 (PBST)溶液中水化，时长为5-10分钟；②20-25°C室温下，在10-20ml的50%甲醇/50%含0.1 % Tween-20磷酸缓冲液 (PBST)溶液中水化，时长为5-10分钟；③20-25°C室温下，在10-20ml的25%甲醇/75%含0.1% tween-20磷酸缓冲液 (PBST)溶液中水化，时长为5-10分钟；④20-25°C室温下，在10-20ml含0.1 % tween-20磷酸缓冲液(PBST)溶液中水 化，时长为5-10分钟；3)增加通透性3.1)加入蛋白酶K，在35-37°C下温浴10-15分钟；3.2)用含0.1 % Tween-20磷酸缓冲液(PBST)溶液清洗2次，每次5-10分钟；4)20_25°C室温下，用阻断(blocking)内源性过氧化物酶溶液(含5%羊血清， 牛血清白蛋白，二甲基亚砜的0.1% Tween-20磷酸缓冲液)处理1-1.5小时；5)将斑马鱼与抗单链DNA损伤抗体温�。露�4_6°C，温浴时间15_17小时；6)用含0.1 % Tween-20磷酸缓冲液(PBST)溶液清洗斑马鱼，至少4次，每次 10-15分钟；7)加入稀释好的辣根过氧化物酶(HRP)标二抗，20-25 °C室温下孵育2_3小 时；8)用磷酸缓冲液(PBS, NaCl 8g，KCL 0.2g，Na2HPO4 (12H20) 1.44g, KH2PO40.24g,加蒸馏水至1000ml, PH7.0)溶液洗3次，每次10-15分钟；9)将斑马鱼转移到另一孔微孔板中，每个微孔放入1尾斑马鱼；10)加入染色底物化学发光试剂辣根过氧化物酶底物(PS-atto)，孵育20-30分 钟；11)利用酶标仪读取各个微孔的化学光(chemiluminescence)强度值。作为优�。龅奈⒖装蹇梢允�6孔微孔板或12孔微孔板或24孔微孔板或48 孔微孔板或96孔微孔板或384孔微孔板。作为优�。龅墓潭ㄒ嚎梢允�4%多聚甲醛、邓氏固定液(Dent，s fixation, 甲醇/ 二甲基亚砜=4 1)、生物组织固定剂(Dietrich，s solution)、布安氏固定液 (Bouin' s fixtion,苦味酸饱和水溶液75ml，10%福尔马林液25ml，冰醋酸5ml)。作为优�。龅娜旧孜锘箍梢允窍陨孜锘蛘哂獾孜�。一种定量检测基因毒性化合物或者筛选抗肿瘤药物的方法，步骤如下步骤一，胚胎采集取成年斑马鱼种鱼，配对交配，采集斑马鱼，吸出沉淀物质，放入温度在 20-30°C的培养箱中孵化；
步骤二，将受精后6-72小时的斑马鱼置于微孔板中，在20_30°C的水温中进行 待测化合物处理，处理时间可以是24-72小时；步骤三，对整体斑马鱼进行酶联免疫吸附检测；步骤四，定量分析DNA损伤率计算公式为，
权利要求
1.一种在整体斑马鱼上进行酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于，步骤如下1)固定整体斑马鱼在含有固定液的微孔板中固定，时间为15-17小时；2)水化2.1)将斑马鱼在20-25°C室温下放置5-10分钟；2.2)在不同浓度的甲醇-含0.1% Tween-20磷酸缓冲液(PBST)溶液中水化，步骤如下①20-25°C室温下，在10-20ml的75 %甲醇/25 %含0.1 % Tween-20磷酸缓冲液 (PBST)溶液中水化，时长为5-10分钟；②20-25°C室温下，在10-20ml的50 %甲醇/50 %含0.1 % Tween-20磷酸缓冲液 (PBST)溶液中水化，时长为5-10分钟；③20-25°C室温下，在10-20ml的25 %甲醇/75 %含0.1 % tween-20磷酸缓冲液 (PBST)溶液中水化，时长为5-10分钟；④20-25°C室温下，在10-20ml含0.1%tween-20磷酸缓冲液(PBST)溶液中水化， 时长为5-10分钟；3)增加通透性3.1)加入蛋白酶K，在35-37°C下温浴10-15分钟；3.2)用含0.1%Tween-20磷酸缓冲液(PBST)溶液清洗2次，每次5_10分钟；4)20-25°C室温下，用阻断(blocking)内源性过氧化物酶溶液(含5%羊血清，牛 血清白蛋白，二甲基亚砜的0.1% Tween-20磷酸缓冲液)处理1_1.5小时；5)将斑马鱼与抗单链DNA损伤抗体温浴，温度4-6°C，温浴时间15-17小时；6)用含0.1%Tween-20磷酸缓冲液(PBST)溶液清洗斑马鱼，至少4次，每次10-15 分钟；7)加入稀释好的辣根过氧化物酶(HRP)标二抗，20-25°C室温下孵育2_3小时；8)用磷酸缓冲液(PBS，NaCl8g，KCL 0.2g，Na2HPO4 (12H20) 1.44g, KH2PO40.24g,加蒸馏水至1000ml, PH7.0)溶液洗3次，每次10-15分钟；9)将斑马鱼转移到另一孔微孔板中，每个微孔放入1尾斑马鱼；10)加入染色底物化学发光试剂辣根过氧化物酶底物(PS-atto)，孵育20-30分钟；11)利用酶标仪读取各个微孔的化学光(chemiluminescence)强度值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微孔板可以是6孔微孔板或12 孔微孔板或24孔微孔板或48孔微孔板或96孔微孔板或384孔微孔板。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的固定液可以是4%多聚甲醛、邓 氏固定液(Dent，s fixation,甲醇/ 二甲基亚砜=4 1)、生物组织固定剂(Dietrich，s solution)、布安氏固定液(Bouin，s fixtion,苦味酸饱和水溶液75ml，10%福尔马林液 25ml，冰醋酸 5ml)。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的染色底物还可以是显色底物或者 荧光底物。
5.—种定量检测基因毒性化合物或者筛选抗肿瘤药物的方法，其特征在于，步骤如下步骤一，胚胎采集取成年斑马鱼种鱼，配对交配，采集斑马鱼，吸出沉淀物质，放入温度在20-30°C的 培养箱中孵化；步骤二，将受精后6-72小时的斑马鱼置于微孔板中，在20-30°C的水温中进行待测化合物处理，处理时间可以是24-72小时；步骤三，对整体斑马鱼进行酶联免疫吸附检测；步骤四，定量分析DNA损伤率计算公式为，
6.根据权利要求5所述的定量检测基因毒性化合物的方法，其特征在于，所述的步骤 一中，在斑马鱼卵受精后6-8小时和24-26小时，取出死亡的胚胎。
7.—种筛选修复DNA损伤药物的方法，其特征在于，步骤如下 步骤一，胚胎采集取成年斑马鱼种鱼，配对交配，采集斑马鱼，吸出沉淀物质，放入温度在20-30°C的 培养箱中孵化；步骤二，将受精后6-72小时斑马鱼置于微孔板中，在20-3(rC的水温中进行50μM 星孢菌素(staurosporine)加待测药物处理，处理时间可以是24-72小时； 步骤三，对整体斑马鱼进行酶联免疫吸附检测； 步骤四，定量分析 DNA损伤率计算公式为，
8.根据权利要求7所述的筛选修复DNA损伤药物的方法，其特征在于，所述的步骤 一中，在斑马鱼卵受精后6-8小时和24-26小时，取出死亡的胚胎。
全文摘要
本发明涉及一种在整体斑马鱼上进行酶联免疫吸附检测的方法，以及此方法在鉴别基因毒性化合物、筛选抗肿瘤药物、修复DNA损伤的药物中的应用。该发明一方面可用于评价化合物的基因毒性，包括环境化合物、药物，化妆品、食品添加剂等，另一方面可用于筛选新药，如筛选抗肿瘤药、抗氧化剂、抗衰老、抗神经退行性疾病等药物。本发明对于诊断和治疗某些疾�。杂谛乱┭蟹⒑突衔锒拘陨秆【哂蟹浅Ｖ匾闹傅家庖�。应用斑马鱼评价化合物毒性和筛选新药，既具有花费少、样品用量少、操作可实现自动化等优点，又能够提供活体动物的体内生理环境，因此能够实现评价和筛选工作简便、快速、经济、高效、高通量的目的。
文档编号G01N33/53GK102023207SQ20101054781
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者彭恩泽 申请人:彭恩泽
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
