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专利名称：：检测载体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及组织化学检测载体，尤其涉及免疫组织化学检测载体，更具体的是涉及一种亲和素包被的检测载体。
背景技术：
：目前，许多领域，如核酸的分子杂交和分离纯化，抗原抗体反应，靶蛋白的分离纯化，药物筛选等，都可使用酶联免疫吸附检测技术(Enzyme—LinkedimmunosorbentAssay,ELISA)。该技术通常使用的实验器材(如酶标板)主要是聚苯乙烯等疏水性材料，这就必然使实验器材(如酶标板)表面具有疏水特性。在现有的检测技术当中，主要是通过与器材表面形成疏水键或离子键的方式，将亲水性物质(如蛋白质、多肽或核酸等)固定在实验器材(如酶标板)表面。由于不同的亲水性物质(如蛋白质、多肽或核酸等)的物理性质是不同的，其表面性质也会有所差异。以蛋白质/多肽为例，由于组成其具体分子的氨基酸种类和数量不尽相同，其亲水性/疏水性亦有较大的区别。基于聚苯乙烯等疏水性材料的器材，传统的固定方法虽然简便，但是往往不能使亲水性的目标物质(如蛋白质、多肽或核酸等)得到充分地固定，尤其是那些呈亲水性较强的蛋白质、短肽或核酸。因此，为保证检测的灵敏度，需要大量蛋白质和短肽来固定，不仅增加生产成本，在操作过程中，还容易将固定的蛋白质和短肽洗脱，致使检测结果重复性较差。另外，通过此传统方法固定，易引起蛋白质(如抗体)构象改变(变性)，失去与配基(如抗原表位)的结合能力，致使固定在器材(如酶标板)表面的有效分子数生物素(Biotin)—亲和素(Avidin)系统是近年来出现的一种生物反应放大系统，已广泛应用于免疫学、分子生物学和临床医学等领域中。链霉亲和素(Streptavidin)结合的四聚体SARS抗原肽被应用于对SARS病毒有特异反应性T细胞水平高低的检测中(CN1613870A)。由于MHC/小肽四聚体能直接刺激特异性的T细胞的核心蛋白复合物，为此利用链酶亲和素同时能结合四个分子的特性，将制备得到的纯的标记有生物素的SARS抗原肽与链酶亲和素结合后，直接定量测定人外周血样品中对SARS病毒有特异反应性T细胞水平的高低。在基因芯片的检测方面，生物素(Biotin)—亲和素(Avidin)反应放大系统同样得以应用(CN101162201A)。芯片点加链酶亲和素标记的纳米级金颗粒，通过链酶亲和素与生物素的特异结合将金颗粒连接到耙标分子上；然后点加银染试剂，利用银染试剂的氧化还原反应形成的银颗粒沉积在纳米金上，形成肉眼可见的杂交信号。这种方法与单歩金标银染法相比，其灵敏度提高10—100倍。因此，生物素(Biotin)—亲和素(Avidin)—直以来应用于反应放大系统，以使得检测的灵敏度得以有效提高。本发明的一个目的在于提供一种检测载体。本发明的另一个目的在于提供一种检测载体包被方法。本发明的又一个目的在于提供一种亲水性分子的包被方法。本发明的再一个目的在于提供一种使用亲和素包被亲水性抗原的方法。本发明的第五个目的在于提供一种经由亲水性分子包被方法包被的产物在亲和组织化学检测中的应用，尤其是在类风湿关节炎免疫抗体体外检测中的应用。本发明所述的高灵敏度检测载体包括疏水性器材、与其直接结合的亲和素，以及结合于亲和素上的亲水性配基；所述疏水性器材与亲和素之间通过疏水相互作用结合；所述配基通过共价连接于其上的生物素非共价地连接于亲和素四个亚基；所述亲水性配基选自于多肽、蛋白质、核酸或有机小分子。进一步地说，所述亲和素(Avidin)是一种分子质量为68,000Da，pl为10.5的一种碱性糖蛋白，又称卵白素，在鸡蛋清中含量比较丰富，因此--般从蛋白清中提取。所述链霉亲和素(Streptavidin)是一种从链霉菌
发明内容(S&eptomycMavWw7)培养物中提取的蛋白质，相对分子质量60,000Da，不具有糖链。其特性与亲和素一样，也具有4个生物素结合位点，与生物素具有高亲和力。进一歩地说，本发明所述的疏水性器材选自于塑料或玻璃。塑料应当理解为全部或部份由碳与氧、氢、氮及其它有机及无机元素化合而成，在制造的最后阶段成为固体，在制造中某些阶段是液体(塑料材料在成为最终产品以前，在某些阶段必需要能够流动。)，因而可以加热或加压力，或二者并用的方式，使其形成各种形状，此庞大而变化多端的材料族类中的任何一种，如树脂、热固性树脂、纤维素衍生物等，在-条长链的分子结构中存在众多的重复原子或分子。塑料包括人工合成或自然界有机材料。玻璃应当被理解为易碎的非晶体物质，这些物质可以是透明的也可以是半透明的，通常由熔融硅和硅碳酸盐融合组成。玻璃还可以认为是--类不具有结晶过程，而是由熔化状态固化而来的材料，大体上由Na20、CaO和6Si02化学氧化物组成，具有光学属性和各种机械属性。具体地说，所述的疏水性器材由聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯或玻璃等制成，具有多孔构造的酶标板。本发明所述的亲水性配基选自于多肽、蛋白质、核酸或有机小分子。多肽和蛋白质即可以为化学合成，也可以通过生物体自身合成。化学合成的多肽和蛋白质可以理解为由多个氨基酸通过一个分子的羧基端与另一分子的氨基端形成酰胺键，并由此一一相连形成的两性(亲水性和疏水性)聚合物分子；还可以理解为在以氨基酸为主体结构并通过化学反应方式结合有聚合物的大分子，如聚乙二醇化(PEGylation)修饰(Adv.Drugdeliv.Rev.28,275—299;Adv.Drugdeliv.Rev.54,453—609;Adv.Drugdeliv.Rev.60,1—88)、酰基化(Acylation)(J.Pha腿.Sci.86,768—773;J.Pharma.Sci.86,1365—1368)和糖基化(Glycosylation)(J.Pharma.Sci.87,326—332;Adv.Drugdeliv.Rev.6,103—131;Adv.Drugdeliv.Rev.13,251—267)等。生物体自身合成的蛋白质/多肽可以理解为由氨基酸组成的；也可以理解为在氨基酸的骨架上具有化学修饰的，如糖基化等生物修饰过程。所述多肽至少有两个氨基酸相连构成。多肽和蛋白质的氨基酸指具有既共价连接氨基又共价连接羧基的不对称中心碳原子的有机分子。核酸包括DNA和各类RNA(tRNA、mRNA、rRNA禾nsiRNA等)，还包括以核苷为主体结构并结合有聚合物的大分子，如聚乙二醇化(PEGylation)修饰、酰基化(Acylation)和糖基化(Glycosylation)等。所述的聚合物为以催化或加成等聚合化反应合成的支链或直链聚合物或天然存在的聚合物，如纤维素、淀粉、葡聚糖、甲壳素和脂肪酸等。有机小分子指具有亲水性的有C、H、O或C、H、O、N、P、S等几种元素组成的分子量小于2000Da的有机小分子，如各类氨基酸、水溶性维生素(Vitamin)和分子量在200—2000Da的聚合物，如聚乙二醇等o本发明所述的检测载体制备方法，依次包括如下具体步骤1、配置包被液；2、将包被液加入疏水性器材表面；3、在0—4(TC条件下保存6小时以上4、洗涤疏水性器材表面2次以上；5、加入含有经生物素标记的亲水性分子的溶液于洗涤后的疏水性器材表面；6、10—30。C条件下保存1小时以上;7、洗涤疏水性器材表面2次以上。进一歩地说，所述的包被液pH为7.0—8.0的缓冲液，其中溶解有浓度为0.1—10ug/mL的亲和素，可以选择0.5、1、2或5吗/mL。所述的缓冲液具体可以为磷酸缓冲液(PhosphateBuffer,PB)、磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBufferSaline,PBS)、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris—HC1、三羟甲基氨基甲垸缓冲液(TBS)和巴比妥缓冲液。所述的亲和素具体为链酶亲和素。'具体地说，所述的缓冲液pH选择7.4。具体地说，所述的缓冲液选择磷酸缓冲盐溶液。进一歩地说，所述的疏水性器材为具有一定体积的容器或直板。更进一歩地说，所述的疏水性器材为酶标板。具体地说，所述的疏水性器材为96或48孔酶标板。进一歩地说，所述的0—40。C温度范围选择0—10。C。更进一步地说，所述的0—1(TC温度范围选择2—8°C，具体可以选择4°C。进-^歩地说，所述的6小时以上的孵育时间，具体为12小时以上，可以选择范围为12—18小时。进一歩地说，所述的洗涤液为pH为7.4的缓冲液。所述的缓冲液具体可以为磷酸缓冲液、磷酸缓冲盐溶液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris—HCl、三羟甲基氨基甲垸缓冲液(TBS)和巴比妥缓冲液。具体地说，所述的缓冲液选择磷酸缓冲盐溶液。进一步地说，所述的亲水性分子为蛋白质、多肽、核酸或有机小分子。更进一步地说，所述的亲水性分子为抗原，其能与抗体结合形成抗原抗体复合物。更进一步地说，所述的亲水性分子为蛋白质或多肽抗原。进一歩地说，所述的10—30。C温度范围选择15—25t:。具体地说，所述的10—3(TC温度范围优选20—25'C。本发明所述的检测载体制备方法，还包括的后续步骤有干燥，真空封存。本发明通过亲和素或链霉亲和素与疏水性器材之间的疏水相互作用而直接结合，再通过共价连接于配基上的生物素以非共价连接于亲和素或链霉亲和素四个亚基即得到检测载体，另一方面也同时实现了亲水性分子，尤其是亲水性抗原的包被。所述亲水性配基选自于多肽、蛋白质、核酸或有机小分子。本发明所述的检测载体制备方法在ELISA检测中的应用。本发明所述的检测载体制备方法在类风湿关节炎免疫抗体体外检测中的应用。本发明所述的链酶亲和素分子中存在大量的疏水基团，可与疏水性器材(如酶标板)表面紧密结合，并克服了在检测各个步骤中洗涤疏水性器材(如酶标板)表面而容易将固定的蛋白质和短肽洗脱的缺陷，提高包被分子的有效性，从而提高了检测结果的重复性。每个链霉亲和素分子含有4个与生物素结合的亚基，并且链霉亲和素与生物素结合虽然是非共价键，但其亲和力接近共价键，很稳定，生物素在1(T"mol/L浓度即可与亲和素结合(Kdl(T15)。本发明所述的亲水性分子的生物素标记方法可以通过先由固相合成或基因工程表达并纯化，所得蛋白质或多肽再与生物素连接并纯化(如申请号为200310108264.0中国发明专利所公开的技术方案)。多肽固相合成技术的具体歩骤参见Eur.J.Immunol.1994,24,3188—3193;J.Org.Chem.1972,37,3404—3409;黄惟德，陈常庆多肽合成，北京科学出版社，1985。还可以选择采用在固相合成过程中先与生物素连接再纯化的方式分别进行，其具体方式参见Deibel,M.R.,Jr.,Lobl,T.J.andYem,A.W.,Atechniqueforrapidpurificationoflowyieldproducts:Biotinylationofchemicallysynthesizedproteinson-resin.Pept.Res.1989,2,189一194。核酸可以通过化学合成或各类聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)方法获得后，再与生物素连接；或在化学合成过程中先与生物素连接再纯化的方式得到。在常规的ELISA方法中，在固定蛋白质或多肽之后，一般需用封闭液(如含有牛血清白蛋白)封闭未包被的酶标板表面。但经链酶亲和素包被后的酶标板用于ELISA检测方法中，应用亲和素(如链霉亲和素)预包被的酶标板，可与生物素标记的多肽分子定向结合，即结合的多肽分子游离于酶标板表面，呈现类似三维样结构，减少空间位阻，有利于多肽分子在保持空间构象情况下与待测样品(如血清)中特异分子(如抗体)结合，增加分子间(如抗原一抗体)的亲和力，从而表现出良好的特异性。使用本发明的技术方案包被的疏水性器材(如酶标板)不会引起血清中蛋白和酶标记二抗的结合，从而减少常规封闭步骤，使得抗原(蛋白质、多肽或核酸)分子形成空间构象，进一歩保证分子构象。经链霉亲和素包被的疏水性器材(如酶标板)有如下特性对生物素或生物素标记分子高亲和力；具有一致的高包被数量；较低的洗脱性(如酶标板每个小孔小于6ng);对一般的表面活性剂(如SDS，TritonX一100，NP—40，Tween—20等)具有耐受性；稳定性高，易于长期保存(2—8。C可保存至少1年)；具有预封闭特性，可立即使用，免去常规的封闭步骤等。生物素标记的核酸(DNA或RNA)、蛋白质或多肽和小的有机分子等的结合实验均可应用此系统，如核酸的分子杂交、分离纯化，抗原抗体反应，靶蛋白的分离纯化，药物筛选等，既可应用到科学研究，又可应用到临床检测系统中。具体实施例方式以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛一奥德里奇(Sigma—Aldrich)。实施例1检测载体的制备浓縮洗涤液的配制先根据下表配制10倍浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液，Tween—20浓度可以为0.1—0.05%(v/v)，本发明应用0.05%(v/v)(简称10xPBST)，<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>样品稀释液用于稀释待检样品，其配比如下:试剂名称用量牛血清白蛋白(BSA)25g1%(w/v)硫柳汞钠盐12.5ml庆大霉素(40mg/ml)6.25ml1倍浓度PBST(lxPBST)2482ml包被液的配制l倍浓度的磷酸盐缓冲液(lxPBS，pH7.4)用于稀释和包被亲和素到酶标板表面；lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween⑧一20)用于稀释生物素标记的亲水性分子(蛋白质、多肽或核酸)。亲水性分子具体包被方法如下用包被液("PBS,pH7.4)稀释链霉亲和素至浓度为2吗/ml，然后加入到酶标板各孔中(140"L/孔)，4。C过夜(12—18小时)，取出酶标板，去除包被液，用洗涤液lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)洗2次，然后加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween⑨—20)稀释生物素标记的多肽，在脱色摇床上混匀，室温孵育l小时，弃去未结合的生物素标记的多肽，350(illxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)洗板2次，干燥。真空箱内保存待用。生产时，将酶标板条装入袋中，真空封口。实施例2检测载体的制备所述洗涤液、稀释液和包被液如实施例l所述。亲水性分子具体包被方法如下用包被液稀释链霉亲和素，然后加入到酶标板各孔中，l(TC过夜，取出酶标板，去除包被液，用洗涤液洗2次，然后加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween⑧一20)稀释生物素标记的多肽，2(TC孵育1小日寸(在脱色摇床—匕混匀)，弃去未结合的生物素标记的多肽，洗板，干燥。真空箱内保存待用。实施例3检测载体的制备所述洗涤液、稀释液和包被液如实施例1所述。亲水性分子具体包被方法如下用包被液稀释链霉亲和素，使其浓度为l吗/ml。然后加入到酶标板各孔中，37'C8小时，取出酶标板，去除包被液，用洗涤液洗2次，然后加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)稀释生物素标记的多肽，3(TC孵育1小时(在脱色摇床上混匀)，弃去未结合的生物素标记的多肽，洗板，干燥。真空箱内保存待用。实施例4检测载体的制备所述洗涤液、稀释液和包被液如实施例1所述。亲水性分子具体包被方法如下用包被液稀释链霉亲和素，使其浓度为0.5pg/ml。然后加入到酶标板各孔中，2(TC15小时，取出酶标板，去除包被液，用洗涤液洗3次，然后加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)稀释生物素标记的多肽，10。C孵育2.5小时(在脱色摇床上混匀)，弃去未结合的生物素标记的多肽，洗板，干燥。真空箱内保存待用。实施例5检测载体的制备所述洗涤液、稀释液和包被液如实施例l所述。亲水性分子具体包被方法如下用包被液稀释链霉亲和素，使其浓度为2叫/ml。然后加入到聚苯乙烯酶标板各孔中，4"C20小时，取出酶标板，去除包被液，用洗涤液洗3次，然后加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)稀释生物素标记的多肽，25。C孵育1小时(在脱色摇床上混匀)，弃去未结合的生物素标记的多肽，洗板，干燥。真空箱内保存待用。实施例6不同制备方法的比较生物素标记抗原的购自(吉尔生化(上海)有限公司)，其氨基酸序列如下His—Gin—Cys—His—Gin—Glu—Ser—Thr—Cit—Gly—Arg—Ser—Arg—Gly—Arg—Cys—Gly—Arg—Ser—Gly—Ser;Cit为瓜氨酸，第三位和十六位Cys之间形成二硫键。抗体检测试剂的制备抗人IgG抗体为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)标记的兔抗人IgG抗体采购于武汉博士德生物工程有限公司(货号BA1070)。其具体配制方式为，取20jiL储存液，加800ml抗体稀释液作l:40000稀释，混匀，分装标准小瓶，每瓶15ml，28。C下保存。抗体稀释液购自Pierce公司(货号37552)。HRP标记的抗人IgG抗体底物A配制称取柠檬酸17.9g和Na2HP04'12204.67g溶解于400ml去离子水中，然后缓慢加入30%H2O2330|iL，搅拌均匀后，加水至500ml，28。C下保存。HRP标记的抗人IgG抗体底物B配制称取四甲基联苯氨(tetmmethy1benzidine,TMB)O.lg于100ml去离子水中，加入二甲基亚砜(DMSO)2.5ml，在搅拌的同时，缓慢加入0.5ml6MHC1，直至完全溶解，最后加水至500ml，28。C下保存。HRP标记的抗人IgG抗体底物反应终止液的配制分别量取55ml98y。H2S04和去离子水445ml，然后将浓硫酸缓慢加入到去离子水中，混匀，28"C下保存。所述洗涤液、稀释液和包被液如实施例l所述。使用亲和素或链霉亲和素的制备方法如下用包被液(lxPBST，pH7.4)稀释链霉亲和素，使其浓度为2吗/ml，然后加入到酶标板(96孔)各孔中(每孔150pL)，4"C过夜，取出酶标板，去除包被液，用洗涤液(lxPBST，pH7.4)洗2次，然后加入lxPBST(pH7.4，0.05%(v/v)Tween—20)稀释浓度为0.25|ig/ml生物素标记的多肽，每孔100pL。室温(20—25。C)孵育1小时(在脱色摇床上混匀)，弃去未结合的生物素标记的多肽，洗板2次，加入类风湿关节炎患者血清，洗板2次，再加入HRP标记抗人IgG抗体，TMB底物显色。不使用亲和素处理的制备方法如下使用同样酶标板，上述同样的操作方法，只是去除链霉亲和素包被，将10(ig/ml生物素标记多肽加入酶标板中(每孔100pL)直接包被，4°C过夜，取出酶标板，洗板2次，封闭，洗板2次，加入类风湿关节炎患者血清，洗板2次，再加入HRP标记抗人IgG抗体，TMB底物显色。酶标仪测定波长设定在450nm，测定0045()值。检测结果发现，未使用亲和素包被的酶标板，在最大包被浓度10叱/ml的包被浓度情况下产生的吸光度值为OD45。=0.781;而先用链酶亲和素包被的酶标板在浓度0.25吗/ml的包被浓度情况下产生的吸光度值为OD450=1.583。权利要求1、一种检测载体，其特征在于包括疏水性器材、与其直接结合的亲和素或链霉亲和素，以及结合于亲和素或链霉亲和素上的亲水性配基；所述疏水性器材与亲和素或链霉亲和素之间通过疏水相互作用结合；所述配基是通过共价连接于其上的生物素以非共价连接于亲和素或链霉亲和素四个亚基；所述亲水性配基选自于多肽、蛋白质、核酸或有机小分子。2、根据权利要求l所述的检测载体，其特征在于所述的疏水性器材由聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯或玻璃制成。3、根据权利要求1或2所述的检测载体，其特征在于所述的疏水性器材为一多孔板。4、根据权利要求3所述的检测载体，其特征在于所述的疏水性器材为96孔或48孔酶标板。5、一种权利要求1所述的检测载体的制备方法，依次包括如下具体歩骤a)配置包被液；b)将包被液加入疏水性器材表面；c)在0—4.C条件下保存6小时以上；d)洗涤疏水性器材表面2次以上；e)加入含有经生物素标记的亲水性分子的溶液于洗涤后的疏水性器材表面；f)10—30'C条件下保存1小时以上；g)洗涤疏水性器材表面2次以上；所述的包被液pH为7.0—8.0的缓冲液，其中溶解有浓度为O.l—10ug/mL的亲和素或链酶亲和素。6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的包被液为pH7.4的磷酸缓冲液或磷酸缓冲盐溶液，所述的链酶亲和素浓度为2ug/mL。7、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的疏水性器材为容器或直板。8、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的疏水性器材为酶标板。9、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的疏水性器材由聚苯乙烯、聚乙烯或聚氯乙烯制成。10、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于在所述的温度范围内选择4。C。11、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于在所述的保存时间为12小时以上。12、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于在所述的10—3(TC温度范围选择20_25°C。13、一种权利要求1、2或4所述的检测载体在亲和组织化学检测中的应用。14、根据权利要求13所述的在亲和组织化学检测中的应用，其特征在于在ELISA检测中的应用。15、一种权利要求5—12之一所述的制备方法在ELISA检测中的应用。全文摘要本发明公开了一种检测载体及其制备方法，先将亲和素/链霉亲和素处理疏水性器材表面，之后将结合有生物素的亲水性分子与亲和素/链霉亲和素相结合，从而完成对亲水性分子的包被。亲和素/链霉亲和素可与疏水性器材表面紧密结合，并克服在检测各个步骤中洗涤疏水性器材表面而容易将固定的蛋白质和短肽洗脱的缺陷，提高包被分子的有效性，从而提高了检测结果的重复性。包被后的分子对一般的表面活性剂具有耐受性；稳定性高，易于长期保存；具有预封闭特性，可立即使用，免去常规的封闭步骤等。文档编号G01N33/544GK101387642SQ200810201149公开日2009年3月18日申请日期2008年10月14日优先权日2008年10月14日发明者朱绍荣,王绍成申请人:上海荣盛生物药业有限公司