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专利名称：使用了荧光粒子的检测对象物质的检测方法
技术领域：
本发明涉及使用了荧光粒子的检测对象物质的检测方法。
背景技术：
一直以来，作为对蛋白质、酶、无机化合物等进行定量的高灵敏度且容易的测定方法，广泛使用荧光检测法。该荧光检测法是对被认为含有能被特定波长的光激发而发出荧光的检测对象物质(待测物质)的试样照射上述特定波长的激发光、并通过检测此时的荧光来确认待测物质的存在的方法。另外，在待测物质不是荧光体时，还广泛采取下述方法使利用荧光色素进行标记并与待测物质特异性结合的物质与试样接触，之后与上述同样地检测荧光，由此确认该结合、即待测物质的存在。在这种荧光检测法中，为了提高检测的灵敏度，已知有利用由等离子体共振产生的电场增强的效应的方法。该方法中，为了产生等离子体共振，准备在透明支撑体上的规定区域上设有金属层的传感芯片，对支撑体与金属膜的界面从与支撑体的金属层形成面相反面的一侧以全反射角以上的规定角度入射激发光。通过该激发光的照射，在金属层上产生表面等离子体。通过该表面等离子体的产生所带来的电场增强作用使荧光增强，从而信噪t匕(信号/噪音比，S/N比)提高。利用表面等离子体激发的荧光检测法(以下记为“SPF法”)与利用落射激发的荧光检测法(以下记为“落射荧光法”)相比，信号增强度能获得约10倍，可以以高灵敏度进行测定。例如在专利文献I所记载的求得待测物质的量的光信号检测方法中，准备具有传感器部的传感芯片，并使试样与传感芯片的传感器部接触，其中所述传感器部具备设于电介质板一个面的规定区域上的金属层。通过该接触，被赋予了与试样所含待测物质的量相对应量的光响应性标记物质的结合物质结合在传感器部上。接着，对规定区域照射激发光，检测金属层上产生的电场增强场内所产生的光响应性标记物质发出的光，从而求得待测物质的量。另外，该方法中，作为光响应性标记物质，还可以使用含有多个光响应物质而成的物质，以使得利用透过由光响应物质产生的光的光透过材料来防止在光响应物质接近金属层时所产生的金属消光。另外，专利文献2所记载的分析方法中，通过利用了针对待测物质的多种抗体的免疫分析，可以拓宽能够定量的待测物质的浓度范围。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2010-190880号公报专利文献2 日本特开平10-90268号公报

发明内容
发明要解决的课题在现有的利用了 SPF法的免疫诊断系统中，为了减轻制品所含的试剂量等的不均，采用的是根据用与测定对象物发生反应的试验区的信号值除于与试剂量成比例的对照区的信号值获得的校正系数来校正测定结果的不均的手法。因此存在下述问题如果由温度等的变化所导致的信号变化是在试验区的信号值和对照区的信号值独立地发生变化时，即便使用该校正系数也无法正确地进行校正。一般来说是通过改变固定在基板上的抗体的量或者固定在标记上的抗体的量来调整由温度等的变化所导致的信号变化率。具体地说，通过减少固定在基板上的抗体量进行调整，可以增大温度依赖性。但是，也有即便改变固定在基板上的抗体量或固定在标记上的抗体量也无法调整由温度等的变化所导致的信号变化率的情况。本发明要解决的课题就在于要消除上述现有技术的问题。即，本发明要解决的课题在于提供在利用了调整由温度等的变化所导致的信号变化率的校正系统的荧光分析中、对照区的信号值与试验区的信号值的温度依赖性差异小的待测物质的检测方法。用于解决课题的手段为了解决上述课题，本发明人等进行了深入研究，结果发现通过使用下述荧光粒子进行荧光分析，可以减小对照区的信号值与试验区的信号值的温度依赖性差异，所述荧光粒子结合有能够与待测物质结合的第I结合物质；和能够与对第I结合物质具有结合性的第2结合物质结合但不与待 测物质结合的第3结合物质。本发明基于上述发现而完成。S卩，根据本发明，提供一种待测物质的测定方法，其包含下述工序(I)使待测物质和荧光粒子与存在于基板上的试验区及对照区接触、并使荧光粒子与待测物质发生反应的工序；(2)对试验区及对照区的荧光粒子的荧光进行测定的工序；(3)使用对照区的荧光信号值对试验区的荧光信号值进行校正的工序，荧光粒子为结合有下述(i)和(ii)的结合物质标记荧光粒子(i)能够与待测物质结合的I种以上的第I结合物质；(ii)能够与第2结合物质结合但不与待测物质结合的第3结合物质，在对照区上固定有相对于第I结合物质可结合的第2结合物质。优选的是在工序(2)中，通过测定试验区以及对照区的各自上的结合物质标记荧光粒子的荧光，求得各个区域的荧光信号值，使用对照区的荧光信号值来校正试验区的突光信号值。优选的是在试验区上固定有待测物质或者具有针对结合于荧光粒子的第I结合物质的抗原决定部位的待测物质的类似化合物。优选的是在工序(I)中，使接触于基板的待测物质与结合于基板的试验区的待测物质或者具有抗原决定部位的待测物质的类似化合物相对于结合物质标记荧光粒子发
生竞争。优选的是上述第I结合物质是能够与待测物质结合的抗体，固定在对照区的第2结合物质是可与作为第I结合物质的抗体及不与待测物质结合的第3结合物质分别结合的抗体。优选上述第3结合物质是能够与第2结合物质结合但不与待测物质结合的抗体。优选荧光粒子为荧光胶乳粒子。优选工序(2)中通过表面等离子体荧光测定或落射荧光测定来对荧光进行测定。另外，根据本发明，提供一种待测物质测定芯片，其在基板上具有试验区和对照区，并用于待测物质测定，该待测物质测定包含使各个区域与含有待测物质和荧光粒子的待测试样相接触，并使荧光粒子与待测物质发生反应，测定各个区域的荧光粒子的荧光，使用对照区的荧光信号值对试验区的荧光信号值进行校正，荧光粒子为结合有下述(i)和(ii)的结合物质标记荧光粒子(i)能够与待测物质结合的I种以上的第I结合物质；(ii)能够与第2结合物质结合但不与待测物质结合的第3结合物质，在对照区上固定有相对于第I结合物质可结合的第2结合物质。另外，根据本发明，提供一种待测物质测定试剂盒，其由待测物质测定芯片和待测试样中使用的荧光粒子构成，所述待测物质测定芯片在基板上具有试验区和对照区，并用于待测物质测定，该待测物质测定包含使各个区域与含有待测物质和荧光粒子的待测试样相接触，并使荧光粒子与待测物质发生反应，测定各个区域的荧光粒子的荧光，使用对照区的荧光信号值对试验区的荧光信号值进行校正，荧光粒子为结合有下述(i)和(ii)的结合物质标记荧光粒子(i)能够与待测物质结合的I种以上的第I结合物质；(ii)能够与第2结合物质结合但不与待测物质结合的第3结合物质，在对照区上固定有相对于第I结合物质可结合的第2结合物质。发明效果根据本发明，在利用了调整由温度等的变化所导致的信号变化率的校正系统的荧光分析中，能够提供使用了可减小对照区的信号值与试验区的信号值的温度依赖性差异的荧光的待测物质检测方法。


图1表示在使用了固定有I种作为第I结合物质的抗体的荧光粒子的情况下、在使固定有能够与上述作为第I结合物质的抗体结合的第2结合物质的对照区的抗体浓度及测定时的温度发生变化时的、作为第2结合物质的固定于基板上的抗体的浓度与信号变化率之间的关系。图2表示在使用了固定有2种抗体(针对待测物质的抗体、即作为第I结合物质的抗体；和针对待测物质以外的物质的抗体、即作为第3结合物质的抗体)的荧光粒子的情况下、在使固定有能够与上述作为第I结合物质的抗体结合的第2结合物质的对照区的抗体浓度及测定时的温度发生变化时的、作为第2结合物质的固定于基板上的抗体的浓度与信号变化率之间的关系。
具体实施例方式以下进一步详细地说明本发明。本发明的待测物质的测定方法包含下述工序(I)使待测物质和荧光粒子与存在于基板上的试验区及对照区接触、并使荧光粒子与待测物质发生反应的工序；(2)对试验区及对照区的荧光粒子的荧光进行测定的工序；(3)使用对照区的荧光信号值对试验区的荧光信号值进行校正的工序，
荧光粒子为结合有下述(i)和(ii)的结合物质标记荧光粒子( i )能够与待测物质结合的I种以上的第I结合物质；(ii)能够与第2结合物质结合但不与待测物质结合的第3结合物质，在对照区上固定有相对于第I结合物质可结合的第2结合物质。工序(2)中，可以通过对试验区及对照区的各自上的结合物质标记荧光粒子的荧光进行测定，求得各个区域的荧光信号值，使用对照区的荧光信号值对试验区的荧光信号值进行校正。作为上述对荧光信号值进行校正的方法的一个例子，可举出用试验区的荧光信号值除以对照区的荧光信号值，但并非限定于此，例如还可以由关系式算出对应于对照区的荧光信号值的变换系数来对试验区的荧光信号值进行校正，还可通过由试验区的荧光信号值减去对照区的荧光信号值来进行校正。(荧光粒子)作为本发明中使用的荧光粒子，可以使用免疫反应中常用的被荧光进行了着色的粒子，例如可使用荧光聚苯乙烯珠粒等荧光高分子粒子、荧光玻璃珠粒等荧光玻璃粒子。作为荧光高分子粒子的材质的具体例子，有使用了苯乙烯、甲基丙烯酸、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、丁二烯、氯乙烯、醋酸乙烯酯-丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯酸丁酯等单体的高分子或者使用了 2个以上单体的共聚物等合成高分子，优选将它们均匀悬浮而成的胶乳。另外，还可举出其他的有机高分子粉末或无机物质粉末、微生物、血细胞或细胞膜片、脂质体等。使用胶乳粒子时，作为胶乳的材质的具体例子，可举出聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯_(甲基)丙烯酸缩水甘油酯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚醋酸乙烯酯-丙烯酸酯等。作为胶乳，优选至少含有苯乙烯作为单体的共聚物，特别优选苯乙烯与丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物。胶乳的制作方法并无特别限定，可通过任意的聚合方法进行制作。但在抗体标记时若存在表面活性剂则抗体固定变难，因而在制作胶乳时，优选无乳化剂的乳液聚合、即不使用表面活性剂等乳化剂的乳液
口 o当通过聚合获得的胶乳本身为荧光性时，可直接作为荧光胶乳粒子使用。当通过聚合获得的胶乳为非荧光性时，通过在胶乳中添加荧光物质(荧光色素等)，可以制作荧光胶乳粒子。即，荧光胶乳粒子可通过在含有水及水溶性有机溶剂的胶乳粒子的溶液中添加荧光色素并进行搅拌等来制造。荧光粒子的平均粒径根据粒子的材质或对待测物质进行定量的浓度范围、测定机器等而有所不同，但优选为0.001 IOiim (更优选为0.001 I Pm)的范围。含有荧光色素的脂质体或微囊剂等也可作为荧光粒子使用。荧光发色只要是吸收紫外光等而激发并在返回基底状态时被发射，则无特别限定，例如可以使用黄绿(激发波长为505nm/发射波长为 515nm,以下相同)、蓝(350 356nm/415 440nm)、红(535 580nm/575 605nm)、澄(540nm/560nm)、红-澄(565nm/580nm)、深红(625nm/645nm)、暗红(660nm/680nm)等突光发色。发出这些突光的突光粒子例如可从Invitrogen公司获得,在该公司中以FluoSpheres(注册商标)的商品名出售。(平均粒径的测定方法)
本发明中使用的荧光粒子的平均粒径可利用市售的粒度分布计等进行测量。作为粒度分布的测定方法，已知有光学显微镜法、共聚焦激光显微镜法、电子显微镜法、原子力显微镜法、静态光散射法、激光衍射法、动态光散射法、离心沉降法、电脉冲测量法、色谱分析法、超声波衰减法等，对应于各个原理的装置都有市售。从粒径范围及测定的容易性出发，本发明中优选使用动态光散射法。作为使用了动态光散射的市售的测定装置，可举出Nanotrac UPA (日机装株式会社)、动态光散射式粒径分布测定装置LB-550 (株式会社堀场制作所)、浓厚系粒径分析仪FPAR-1000 (大塚电子株式会社)等，本发明中求得的值是25°C的测定温度下测得的中位径(d = 50)的值。(待测物质) 作为本发明的分析方法中的检测对象的待测物质的种类并无特别限定,例如可举出皮质醇、IGF-1、IGFBP-3、LH、TSH、ADH、GH、尿中 GH、ACTH、催乳激素、FSH、TBG、TSAb、T4、抗TPO抗体、微粒体抗体、抗甲状腺球蛋白抗体、了511、甲状腺球蛋白、了3、打'4、打'3、1，25-(010 2维生素D、NTx、Intact PINP、骨钙素、降钙素、BAP、脱氧吡啶啉、PTH、PTHrP、5_HIAA、HVA、左旋多巴、MHPG, VMA、儿茶酚胺、血清素、变肾上腺素、11-去氧皮质醇、17-1 3、17-011孕烯醇酮、醛甾酮、雄甾酮、雄烯二酮、11-0HCS、皮质甾酮、可的松、DOC,DHEA-S、孕烯醇酮、5 a 二氢睾丸酮、HCG- ^亚单位、E2、E3、雌激素、E1、HCG、睾丸酮、孕甾烷二醇、孕甾烷三醇、黄体酮、CPR、VIP、胰岛素、促胃液素、胰高血糖素、抗GAD抗体、抗IA-2抗体、抗胰岛素抗体、心肌肌钙蛋白T、心室肌球蛋白轻链1、H-FABP、HANP、BNP、NT-proBNP、肌红蛋白等。作为待测物质的特别优选的一个例子为皮质醇。(结合物质) 本发明中，使用通过使能够与待测物质结合的I种以上的第I结合物质与荧光粒子结合而获得的结合物质标记荧光粒子。能够与待测物质结合的第I结合物质例如可以是针对待测物质(抗原)的抗体、针对待测物质(抗体)的抗原、针对待测物质(蛋白质、低分子化合物、抗生物素蛋白、生物素等)的适配体等对待测物质具有亲和性的化合物，并无特别限定。另外，本发明中使用的结合物质标记荧光粒子上还可进一步结合本说明书中以下说明的能够与第2结合物质(即固定在对照区上的“能够与可与待测物质结合的第I结合物质结合的第2结合物质”)结合但不与待测物质结合的第3结合物质。(第I结合物质)本发明的方法中使用的第I结合物质的优选例子为抗原、抗体或它们的复合体，但并非限定于这些。例如，当第I结合物质为抗体时，作为对待测物质具有特异性的抗体，例如可以使用由利用该待测物质进行了免疫的动物的血清制备的抗血清、由抗血清纯化得到的免疫球蛋白级分、通过使用利用该待测物质进行了免疫的动物的脾脏细胞的细胞融合获得的单克隆抗体或者它们的片段[例如F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv]等。这些抗体的制备可通过常规方法进行。而且，还可以如该抗体为嵌合体抗体等时那样加以修饰，另外还可使用市售的抗体、由动物血清或培养上清利用公知的方法制得的抗体。抗体可以与其动物种类或亚纲等无关地使用。例如，本发明中可使用的抗体为小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、兔子、绵羊、牛、鸡等可引起免疫反应的生物来源的抗体，具体地为小鼠IgG、小鼠IgM、大鼠IgG、大鼠IgM、仓鼠IgG、IgM兔子IgG、兔子IgM、山羊IgG、山羊IgM、绵羊IgG、绵羊IgM、牛IgG、牛IgM、鸡IgY等，可以适用于多克隆或单克隆这两者。片段化抗体是具有至少I个抗原结合部位的由完全型抗体导出的分子，具体地为Fab、F(ab’)2等。这些片段化抗体可以是通过酶或化学处理或者利用基因工程的手法获得的分子。使抗体或抗原等第I结合物质固定在粒子上的方法例如记载于日本特开2000-206115号公报或Molecular Probes公司FluoSpheres (注册商标)聚苯乙稀微球Polystyrene MicrosphereF8813所附带的实验报告等中，制备免疫凝集反应用试剂的公知方法都可以使用。另外，作为使作为第I结合物质的抗体固定在粒子上的原理，物理吸附及利用共价键的化学结合的任一种原理都可以采用。作为在使抗体固定在粒子上后将未被抗体覆盖的粒子表面覆盖的封闭剂，可以使用公知的物质，例如可以使用BSA (牛血清白蛋白)或脱脂奶、酪蛋白、大豆来源成分、鱼来源成分、聚乙二醇等、或者包含这些物质或与这些物质性质相同的物质的市售的免疫反应用封闭剂等。这些封闭剂还可以根据需要利用热或酸、碱等实施部分变性等前处理。(第2结合物质)本发明中，在对照区上固定能够与可与待测物质结合的第I结合物质结合的第2结合物质。即，作为固定在对照区上的第2结合物质，可以使用能够与结合在荧光粒子上的I种以上的第I结合物质结合的结合物质。能够与第I结合物质结合的第2结合物质例如可优选使用针对结合物质(抗体)的抗体、相对于结合物质(抗体)结合的蛋白质(ProteinA、Protein G)等对第I结合物质具有亲和性的化合物。另外，结合于荧光粒子上的I种以上的第I结合物质内的一部分可优选使用与第2结合物质为配位基-非配位基的关系的化合物。将抗体等第2结合物质固定在基板上的方法例如记载于Nunc公司提供的Tech NotesVol. 2-12等中，制备通常ELISA试剂的公知方法都可以使用。另外，基板上还可实施通过配置自组装单分子膜(SAM)等进行的表面修饰，作为将作为第2结合物质的抗体固定在基板上的原理，物理吸附及利用共价键的化学结合的任一种原理都可以采用。作为在使抗体固定在基板上后将未被抗体覆盖的基板表面覆盖的封闭剂，可以使用公知的物质，例如可以使用BSA (牛血清白蛋白)或脱脂奶、酪蛋白、大豆来源成分、鱼来源成分、聚乙二醇等、或者包含这些物质或与这些物质性质相同的物质的市售的免疫反应用封闭剂等。这些封闭剂还可以根据需要利用热或酸、碱等实施部分变性等前处理。(第3结合物质)作为能够与第2结合物质结合但不与待测物质结合的第3结合物质，除了可以使用结合于待测物质以外的物质的抗体之外，还可使用它们的片段[例如F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv或Fe]等第2结合物质可以捕获的化合物。(抗体在荧光粒子上的固定)以下例示出将抗体固定在粒子上的具体方法。在粒子按照固体成分浓度达到0.1 10质量％的方式进行分散而得到的溶液中添加调整至0. 01 20mg/mL浓度的抗体溶液并进行混合。在温度为4 50°C的条件下用5分钟 48小时的时间持续搅拌。接着，通过离心分离等方法将粒子与溶液分离，将溶液中所含的未与粒子结合的抗体充分地除去。之后，将使用缓冲液对粒子进行洗涤的操作重复(TlO次。优选在将粒子和抗体混合、实施使抗体结合于粒子的操作后，使用不参与抗原抗体反应的成分、优选蛋白质、更优选为BSA(牛血清白蛋白)、Block Ace、脱脂奶及酪蛋白等封闭剂将粒子表面的抗体未结合的部分进行保护。本发明中，也可以将能够与待测物质结合的I种以上的第I结合物质和能够与第2结合物质结合但不与待测物质结合的第3结合物质预先进行混合后再通过上述方法使其与粒子结合；还可以使能够与待测物质结合的I种以上的第I结合物质和能够与第2结合物质结合但不与待测物质结合的第3结合物质依次与粒子结合，但优选预先混合后再与粒
丁彡口口。在将抗原或抗体等固定在粒子上时，可根据需要添加稳定化剂。稳定化剂是指蔗糖或多糖类等合成或天然高分子等，只要是稳定抗原或抗体的物质则无特别限定，还可使用 Immunoassay Stabilizer (ABI 公司)等的市售品。(分析的方式)本发明的分析方法包含下述工序(1)使待测物质和荧光粒子与存在于基板上的试验区及对照区接触、并使荧光粒子与待测物质发生反应的工序；(2)对试验区及对照区的荧光粒子的荧光进行测定的工序；(3)使用对照区的荧光信号值对试验区的荧光信号值进行校正的工序。对于本发明的待测物质的检测方法，以包括检测待测物质是否存在或测定待测物质的量(即定量)等在内的最为广义的概念来进行解释，广泛地包括在使用了基板的测定方法中通常已知的免疫学测定方法。(接触工序)作为夹心法及竞争法中的使结合物质标记荧光粒子和待测物质与基板接触的方法，例如可通过Sigma-Aldrich公司提供的实验基础信息p. 258所记载的通常的ELISA分析方法(即将分散或溶解有荧光粒子和待测物质的液体添加在基板上使其接触的方法)来进行。另外，还可通过将要接触的场所设置在微流路内，并使分散或溶解有荧光粒子和待测物质的液体流过来使其接触。以下对作为本发明分析方法的具体实施方式
的夹心法及竞争法进行说明，但本发明并非限定于这些。(夹心法)夹心法并无特别限定，例如可通过以下步骤测定待测物质。首先，预先准备好对待测物质具有特异性的第I结合物质、能够与第3结合物质结合的第2结合物质、以及虽然不与待测物质结合但与第2结合物质结合的第3结合物质。接着，使第I结合物质及第3结合物质结合于荧光粒子，制作结合物质标记荧光粒子。另外，将第2结合物质固定在基板上，制成对照区。将本发明用于夹心法时，另外准备与待测物质结合但不与第I结合物质及第3结合物质结合的第4结合物质，固定在基板上而制成试验区。接着，使可能含有待测物质的待测试样(或其抽提液)和结合物质标记荧光粒子与基板上的试验区及对照区接触。当待测试样中存在待测物质时，在试验区上，在待测物质与结合于结合物质标记荧光粒子的第I结合物质之间、以及待测物质与试验区上的第4结合物质之间发生反应(使用了抗原及抗体时为抗原抗体反应)，对应于待测物质的量的荧光粒子被固定在试验区上。另一方面，在对照区上，结合于结合物质标记荧光粒子的第I结合物质或第3结合物质与固定在对照区上的第2结合物质之间发生反应，从而荧光粒子被固定在对照区上。夹心法中，固定在试验区上的第4结合物质与待测物质的反应、以及待测物质与结合于结合物质标记荧光粒子的第I结合物质的反应结束、并且固定在对照区上的第2结合物质与结合物质标记荧光粒子上的第I及第3结合物质的反应结束后，将2个基板上的区域中未结合的结合物质标记荧光粒子除去、洗涤。接着，检测来自结合于试验区的结合物质标记荧光粒子的信号强度，使用来自结合于对照区的结合物质标记荧光粒子的信号强度的测定值来进行校正，从而可以测定正确的待测物质的浓度。需要说明的是，荧光强度与待测物质的浓度具有正相关关系。作为第4结合物质，只要是能够与待测物质结合但不与第I结合物质及第3结合物质结合的物质则可以没有特别限定地使用。优选地可以使用不与第I结合物质及第3结合物质结合但能够与待测物质结合的抗体或者它们的片段[例如F(ab’)2、Fab、Fab\ Fv或Fe]等化合物。(竞争法)竞争法中并无特别限定，例如可以通过以下步骤对待测物质进行测定。竞争法作为检测无法用夹心法分析的低分子化合物的抗原的手法，在本领域中是众所周知的。首先，预先制备对待测物质具有特异性的第I结合物质、能够与第I结合物质结合的第2结合物质、以及不与待测物质结合但能够与第2结合物质结合的第3结合物质。接着，使第I结合物质和第3结合物质结合于突光粒子,制成结合物质标记突光粒子。接着，将能够与第3结合物质结合的第2结合物质固定在固相、例如基板上，制成对照区。另外，将对第I结合物质具有结合性的待测物质本身、或者具有与待测物质相类似部位且具有与待测物质同样的针对第I结合物质的抗原决定部位的化合物固定在相同基板上的同一面上的不同位置，制成试验区。接着，使可能含有待测物质的待测试样(或其抽提液)和结合有第I结合物质及第3结合物质的结合物质标记荧光粒子与基板接触。当待测试样中不存在待测物质时，由结合于结合物质标记荧光粒子的第I结合物质与固定在试验区上的对第I结合物质具有结合性的待测物质其本身或者具有与待测物质同样的针对第I结合物质抗体的抗原决定部位的类似化合物而在基板上发生反应。另一方面，当存在待测物质时，由于待测物质会与第I结合物质结合，因而与对第I结合物质具有结合性的待测物质其本身或者具有与待测物质相类似的部位且具有与待测物质相同的针对第I结合物质抗体的抗原决定部位的化合物在试验区上的反应被阻碍，从而结合物质标记荧光粒子不会被固定在试验区上。另一方面，在对照区上，在结合物质标记荧光粒子上的第3结合物质与固定在对照区上的第2结合物质之间会发生反应，结合物质标记荧光粒子被固定在对照区上。在竞争法中，预先准备多个待测物质浓度不同的待测物质量已知的试样，在使该试样及结合物质标记荧光粒子在试验区上及对照区上接触的同时，在不同的多个时刻测定来自试验区及对照区的荧光信号。由该多个测定结果求得在各待测物质浓度下荧光量的时间变化(斜率)。以该时间变化为Y轴、以待测物质浓度为X轴作图，使用最小二乘法等适当的拟合方法，获得待测物质浓度对荧光量时间变化的标准曲线。根据如此获得的标准曲线，由使用了目标待测试样的荧光量时间变化结果，可以定量待测试样所含的待测物质的量。(具有抗原决定部位的待测物质的类似化合物)本发明中，作为竞争法中可使用的具有抗原决定部位的待测物质的类似化合物，可以使用具有针对本发明的第I结合物质的抗原决定部位的待测物质的类似化合物，例如可优选使用待测物质(皮质醇等)的半抗原。(基板)
作为进行后述的SPF法时的基板，优选使用表面上具有金属膜的基板。作为构成金属膜的金属，可以使用可产生表面等离子体共振的物质。优选地可举出金、银、铜、铝、钼等自由电子金属，特别优选金。这些金属可単独使用或组合使用。另外，考虑到在上述基板上的附着性，还可在基板与金属所形成的层之间设置由铬等形成的夹层。金属膜的膜厚是任意的，但例如优选为0.1nm以上且500nm以下、特别优选为Inm以上且200nm以下。超过500nm时，无法充分地检测介质的表面等离子体现象。另外，在设置由铬等形成的夹层时，该夹层的厚度优选为0.1nm以上且IOnm以下。金属膜的形成通过常规方法进行即可，例如可通过溅射法、蒸镀法、离子镀法、电镀法、非电解镀法等进行。金属膜优选配置在基体上。这里，“配置在基体上”是指除了按照金属膜直接接触于基体上的方式进行配置的情况之外，还包括金属膜不与基体直接接触、而是隔着其他层进行配置的情況。作为本发明中能够使用的基体，例如考虑到表面等离子体共振生物传感器用时，可以使用作为ー种通常的光学玻璃的BK7 (硼硅酸玻璃)等光学玻璃、或者合成树月旨、具体地为聚甲基丙烯酸甲酷、聚对苯ニ甲酸こニ醇酯、聚碳酸酷、环烯烃聚合物等对激光透明的材料所形成的基体。这种基板优选为对偏振光不显示各向异性且加工性优异的材料。
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作为用于利用SPF法进行荧光检测的基板的ー个例子，可以举出以聚甲基丙烯酸甲酷(PMMA)为基体且蒸镀有金膜的基板等。(荧光的检测方法)作为本发明的荧光检测方法，例如优选使用能够检测荧光强度的设备、具体地使用酶标仪或用于进行利用表面等离子体激发的荧光检测法(SPF法)的生物传感器等来检测荧光强度。荧光强度的检测通常在抗原抗体反应后的一定时间、例如数分钟 数小时后结束。通过将上述免疫复合体的形成程度以荧光強度的形式进行检测，可以由荧光強度与待测物质的浓度的关系对待测物质的浓度进行定量。另外，荧光的測定方式可以是酶标仪测定，也可以是流式測定。另外，SPF法可以以比利用落射激发的荧光检测法(以下称作“落射荧光法”)更高的灵敏度进行測定。作为上述表面等离子体荧光(SPF)生物传感器，例如可以使用日本特开2008-249361号公报所记载的传感器，其具备由透过规定波长的激发光的材料所形成的光波导路；形成在该光波导路的ー个表面上的金属膜；产生光束的光源；使上述光束通过光波导路并使其相对于该光波导路与金属膜的界面以产生表面等离子体的入射角入射的光学体系；以及对由于通过该表面等离子体而增强的消散波的激发所产生的荧光进行检测的荧光检测手段。(待测物质的量的測定方法)作为本发明的利用SPF法的待测物质的定量方法的ー个例子，可以利用以下的方法对待测物质进行定量。具体地说，准备含有各浓度已知的待测物质的试样，在使检测荧光的部位流下的同时，在不同的多个时刻測定来自荧光检测部位的荧光信号。由该多个測定结果求得在各待测物质浓度下荧光量的时间变化(斜率)。以该时间变化为Y轴、以待测物质浓度为X轴作图，使用最小二乗法等适当的拟合方法，获得待测物质浓度对荧光量时间变化的标准曲线。作为光信号系统，根据对应于各个待测物质的标准曲线，可以确定目标待测试样的待测物质的量。本发明的使用了荧光粒子的利用表面等离子体激发的荧光检测(SPF)体系是对来自依赖于固定在基板上的金属薄膜上的待测物质量的荧光物质的荧光进行检测的分析方法，将根据溶液中的反应的进行产生的光学透明度的变化例如以浊度的方式进行检测，是与所谓的胶乳凝集法不同的方法。胶乳凝集法中，胶乳试剂中的抗体致敏胶乳与检体中的抗原通过抗体反应而结合、凝集。该凝集块随着时间而増大，由对该凝集块照射近红外光所得的每单位时间的吸光度变化来对抗原浓度进行定量的方式是胶乳凝集法。根据本发明，可以提供与胶乳凝集法相比非常简便的待测物质检测方法。本发明的使用了荧光粒子的检测对象物质的检测方法可以使用试剂盒或芯片进行实施，该试剂盒或芯片组装有在基板上具有试验区及对照区这2个测定区域、且在对照区上固定有能够与结合于荧光粒子的第I结合物质结合的第2结合物质的基板。基板上的试验区及对照区优选由产生表面等离子体共振的物质构成。该待测物质检测用试剂盒或芯片包含使这些区域与含有待测物质及荧光粒子的待测试样接触，并使待测物质与荧光粒子、或者试验区与荧光粒子、进而对照区与荧光粒子发生反应，測定试验区及对照区的荧光強度，使用对照区的荧光信号值校正试验区的荧光信号值。该待测物质检测用试剂盒或芯片中，荧光粒子可以是结合有(i)能够与待测物质结合的I种以上的第I结合物质和(ii)与固定在对照区上的第2结合物质结合但不与待测物质结合的第3结合物质的结合物质标记荧光粒子，且对照区固定有第2结合物质。构成使用了荧光粒子的待测物质检测用试剂盒或芯片的各原材料的例子、优选范围可以使用在使用了荧光粒子的待测物质的检测方法等中记载的例子或范围。通过以下的实施例更具体地说明本发明，但本发明并不受实施例的限定。实施例<比较例1>(进行了碳 化ニ亚胺处理的荧光胶乳粒子的制作)在固体成分浓度为2质量％的荧光胶乳粒子水溶液(InVitoogen公司制品、平均粒径为200nm) 250 u L中添加50mM的MES缓冲液(pH为6. 0)溶液250 u L，使固体成分达到I质量％后，添加lOmg/mL的EDC (1-こ基-3- (3-ニ甲基氨基丙基)碳化ニ亚胺盐酸盐、型号01-62-0011、和光纯药)水溶液8 ii L，在室温下搅拌(1200rpm、25°C、15分钟)，获得碳化ニ亚胺处理荧光胶乳粒子。(抗皮质醇抗体结合突光胶乳粒子的制作)在进行了碳化ニ亚胺处理的荧光胶乳粒子500i! L中添加作为第I结合物质的抗皮质醇抗体(以下记为抗COR抗体、Hytest制、品名Ant1-Cortisol MAb XM210、6. 3mg/mL)9. L，在室温下搅拌(1200rpm、25°C、2小时)。添加2mol/L的Glycine (和光纯药)水溶液25 u L，搅拌30分钟后，通过离心分离(15000rpm、4°C、15分钟)使荧光胶乳粒子沉降。除去上清，添加PBS溶液(磷酸缓冲液、和光纯药、pH为7. 4) 500 u L，利用超声波洗涤机使荧光胶乳粒子再分散。进而进行离心分离(1500011)111、4で、15分钟)，除去上清后，添加含1质量％BSA(牛血清白蛋白、和光纯药)的PBS(pH为7. 4)溶液500 y L，使荧光胶乳粒子再分散，从而获得抗COR抗体结合荧光胶乳粒子的I质量％溶液(反应试剂)。(基板的制作)
在以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA、三菱Rayon公司制、ACRYPET VH-OOI)为基体的基板的单面上，按照试验区、对照区都达到宽度为4_、厚度为70nm的方式蒸镀试验区中、相邻对照区中使用的金。将该基板裁剪成宽为5mm，从而制作了基板。在该基板的试验区的金蒸镀膜上，滴加含皮质醇半抗原(Fitzgerald公司制、80-1C10)的液体(浓度50ii g/mL(50mM MES缓冲液(pH6)中)，150mM NaCl )，25°C下孵育I小时使其物理吸附来进行固定。另一方面，在对照区的金蒸镀膜上滴加含有作为第2结合物质的抗小鼠抗体(Ant1-mouse IgGF(ab，)2、制品名AffiniPure F(ab，) 2Fragment Rabbit Ant1-mouse IgG (H+L)、JacksonImmuno Research公司制)的液体(浓度0. 19、0. 75和6. 0 u g/mL的PBS溶液)，25°C下孵育I小时使其物理吸附来进行固定。(基板的洗涤、封闭)在将如此制备的3种基板安装于传感芯片的流路之前，使用预先制备的洗涤用溶液(含0. 05质量％Tween20 (聚氧こ烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酷、和光纯药公司制)的PBS溶液(pH为7. 4))300 ii L重复洗涤3次。洗涤结束后，为了进行金蒸镀膜上的抗小鼠抗体、皮质醇半抗原的未吸附部分的封闭，添加含I质量％酪蛋白(Thermo Scientific公司制)的PBS溶液(pH为7. 4) 300 iiL，室温下静置I小吋。用上述洗涤用溶液进行洗涤后，添加作为稳定剂的Immunoassay Stabilizer (ABI公司制)300 V- L,在室温下放置30分钟后除去溶液，使用干燥机将水分完全除去。(传感芯片的制作)将制作的3种基板按照日本公开专利公报日本特开2010-190880号的第2实施方式的构成密封在流路内，从而制作了流路型传感芯片。(測定)将待测物质的皮质醇浓度为3 U g/dL的血清和抗COR抗体标记荧光胶乳粒子预先混合。在26°C、30°C、34°C的各温度条件下，滴加在所制作的流路型传感芯片上，一边进行泵抽吸ー边以lOyL/min的速度使其流下。流下时，測定试验区及对照区的荧光强度，求得在各温度条件下荧光强度信号的単位时间内的强度变化率的系数。对于该系数，在求得根据温度变化变动的比例时，确认了在试验区由温度导致的系数的变化率为7。/。/1V。另一方面，对于对照区，求得滴加抗小鼠抗体的各浓度为0. 19,0. 75及6. Oii g/mL的液体所制作的基板的由温度导致的系数的变化率。结果示于图1。在对照区的任一抗小鼠抗体的浓度下，荧光量的信号強度的变化率都是每1°C均低于4%，与试验区的温度特性偏离很大。<实施例1 >(使用了标记有2种抗体的荧光胶乳粒子的温度特性的探讨)在比较例制作的进行了碳化ニ亚胺处理的荧光胶乳粒子500 y L中添加作为第I结合物质的抗COR抗体(6. 3mg/mL) 9. 5 u L、和作为第3结合物质的抗TSH抗体(5. 48mg/mL、制品名Mab to TSH、厂家0EM CONCEPTS. ) 54. 7 y L，在 25°C下搅拌 2 小时(1200rpm)。添加2mol/L的Glycine水溶液25 u L,搅拌30分钟后,进行离心分离(15000rpm、4°C、15分钟)，使荧光胶乳粒子沉降。除去上清，添加PBS溶液(pH为7. 4) 500 u L，利用超声波洗涤机使荧光胶乳粒子再分散。进而进行离心分离(15000rpm、4°C、15分钟)，除去上清后，添加含I质量％BSA的PBS (pH为7. 4)溶液500 u L，使荧光胶乳粒子再分散，从而获得抗COR抗体结合荧光胶乳粒子的I质量％溶液。
基板的制作、基板的封闭、传感芯片的制作及測定与比较例I同样地进行，皮质醇检测用的基板使用与比较例相同的基板。与比较例同样地进行測定。在确认试验区的由温度导致的荧光信号強度的系数的变化率时，确认了 与比较例同样，相对于I°C温度变化、检体浓度变化7%。另外，与比较例同样地使用如图2所示那样改变了对照区的抗小鼠抗体的量的基板来确认由温度导致的荧光信号強度的系数的变化率时，确认了依赖于检体浓度的信号变化率在基板抗体浓度为
0.19 u g/mL时，每1°C为7. 5%的变化率。在其他浓度下，为4%以下的变化率。由该测定结果确认了 通过最佳地设定抗小鼠抗体的量，可以利用对照区的信号值校正试验区的信号信息，从而可以提供温度依赖性非常小的分析方法。
权利要求
1.一种待测物质的测定方法，其包含下述工序 (1)使待测物质和荧光粒子与存在于基板上的试验区及对照区接触、并使荧光粒子与所述待测物质发生反应的工序； (2)对所述试验区及所述对照区的所述荧光粒子的荧光进行测定的工序； (3)使用所述对照区的荧光信号值对所述试验区的荧光信号值进行校正的工序， 其中，所述荧光粒子为结合有下述(i)和(ii)的结合物质标记荧光粒子 (i)能够与所述测物质结合的I种以上的第I结合物质； ( )能够与第2结合物质结合但不与所述待测物质结合的第3结合物质， 在所述对照区上固定有相对于所述第I结合物质可结合的所述第2结合物质。
2.根据权利要求1所述的待测物质的测定方法，其中，在所述试验区上固定有所述待测物质、或者具有针对所述第I结合物质的抗原决定部位的所述待测物质的类似化合物。
3.根据权利要求2所述的待测物质的测定方法，其中，在所述工序(I)中，使接触于基板的所述待测物质与固定在基板的所述试验区上的所述待测物质或者该待测物质的类似化合物相对于所述结合物质标记荧光粒子进行竞争。
4.根据权利要求广3中任一项所述的待测物质的测定方法，其中， 所述第I结合物质为能够与所述待测物质结合的抗体， 固定在所述对照区的所述第2结合物质是能够与作为所述第I结合物质的抗体和不与所述待测物质结合的所述第3结合物质分别结合的抗体。
5.根据权利要求Γ3中任一项所述的待测物质的测定方法，其中，所述第3结合物质是能够与所述第2结合物质结合但不与所述待测物质结合的抗体。
6.根据权利要求4所述的待测物质的测定方法，其中，所述第3结合物质是能够与所述第2结合物质结合但不与所述待测物质结合的抗体。
7.根据权利要求广3中任一项所述的待测物质的测定方法，其中，所述荧光粒子为荧光胶乳粒子。
8.根据权利要求广3中任一项所述的待测物质的测定方法，其中，在工序(2)中，通过利用表面等离子体激发的荧光检测法或者利用落射激发的荧光检测法来对荧光进行测定。
9.一种待测物质测定芯片，其在基板上具有试验区和对照区，并用于待测物质测定，该待测物质测定包含使各个区域与含有待测物质和荧光粒子的待测试样接触，并使荧光粒子与待测物质发生反应，测定各个区域的所述荧光粒子的荧光，使用所述对照区的荧光信号值对所述试验区的荧光信号值进行校正， 其中，所述荧光粒子为结合有下述(i)和(ii)的结合物质标记荧光粒子 (i)能够与所述测物质结合的I种以上的第I结合物质； (ii)能够与第2结合物质结合但不与所述待测物质结合的第3结合物质， 在对照区上固定有相对于所述第I结合物质可结合的所述第2结合物质。
10.一种待测物质测定试剂盒，其由待测物质测定芯片和待测试样中使用的荧光粒子构成，所述待测物质测定芯片在基板上具有试验区和对照区，并用于待测物质测定，该待测物质测定包含使各个区域与含有待测物质和所述荧光粒子的所述待测试样接触，并使所述荧光粒子与所述待测物质发生反应，测定各个区域的所述荧光粒子的荧光，使用所述对照区的荧光信号值对所述试验区的荧光信号值进行校正，其中，所述荧光粒子为结合有下述(i)和(ii)的结合物质标记荧光粒子 (i)能够与所述测物质结合的I种以上的第I结合物质；( )能够与第2结合物质结合但不与所述待测物质结合的第3结合物质，在所述对照区上固定有相对于所述第I结合物质可结合的所述第2结合物质。
全文摘要
本发明提供一种待测物质的测定方法，其在利用了调整由温度导致的信号变化率的校正系统的免疫荧光分析中对照区的信号值与试验区的信号值的温度依赖性差异�。�其包含(1)使待测物质和荧光粒子与存在于基板上的试验区及对照区接触并使荧光粒子与待测物质反应的工序；(2)除去未反应的荧光粒子的工序；(3)测定试验区及对照区的荧光粒子的荧光的工序；(4)使用对照区的荧光信号值校正试验区的荧光信号值的工序，其中荧光粒子为结合有(i)能够与待测物质结合的1种以上的第1结合物质和(ii)能够与第2结合物质结合但不与待测物质结合的第3结合物质的结合物质标记荧光粒子，在对照区上固定有相对于第1结合物质可结合的第2结合物质。
文档编号G01N21/64GK103033492SQ20121036399
公开日2013年4月10日 申请日期2012年9月26日 优先权日2011年9月28日
发明者渡边裕也, 笠置典之 申请人:富士胶片株式会社