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专利名称：复方双黄连片的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及中药复方制剂的质量控制方法，具体涉及一种复方双黄连片的质量控制方法。
中药复方双黄连片是本发明人创制的新药，该药剂是由金银花、连翘与黄芩的提取物作为活性成份与药用辅料组成的。该发明创造已由本发明人于2000年10月25日申请了发明名称“复方双黄连制剂及制备方法”的发明专利，申请号为00125764.1。由于中药的成分比较复杂，复方中药制剂的质量控制更是一大难题。本发明人对该中药制剂的质量控制进行了探讨和研究。
本发明的目的在于研究和设计复方双黄连片的质量控制方法。
本发明提供了复方双黄连片的质量控制方法，该方法包括下列特征(1)药材金银花、连翘、黄芩指纹谱测试；(2)双黄连中间体质量标准测试；(3)双黄连中间体指纹谱测试；(4)双黄连制剂质量标准测试；(5)双黄连制剂指纹谱测试。
取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，计算公式如下CX＝C1(C2-C1)*(AX-A1)/(A2-A1)C1、C2分别为标准品的量；A1、A2分别为标准品峰面积；CX、AX为样品的量和峰面积。(2)金银花和连翘提取物中连翘甙含量测定仪器与材料同上述连翘甙含量测定。样品金银花和连翘提取物(国家中药制药技术工程中心提供)色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相乙腈∶水＝28∶72，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温。标准曲线同上。样品测定供试液的制备取金银花和连翘提取物粉末，精密称取292mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中。进样前用0.45um滤膜过滤。
取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，计算公式如下CX＝C1+(C2-C1)*(AX-A1)/(A2-A1)C1、C2分别为标准品的量；A1、A2分别为标准品峰面积；CX、AX为样品的量和峰面积。(3)黄芩提取物中黄芩甙含量测定仪器与材料。同上述黄芩甙含量测定。样品黄芩提取物(国家中药制药技术工程中心提供)色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相甲醇∶水(含2％醋酸)＝65∶35，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温。标准曲线同上样品测定供试液的制备取黄芩提取物，精密称取10mg，置于100ml容量瓶，加甲醇/水超声振荡，定容。进样前用0.45um滤膜过滤。
取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，计算公式如下CX＝C1+(C2-C1)*(AX-A1)/(A2-A1)
C1、C2分别为标准品的量；A1、A2分别为标准品峰面积；CX、AX为样品的量和峰面积。(4)超临界萃取物的定性控制材料本实验所用复方连翘与金银花提取物为超临界二氧化碳共提物。仪器日本岛津GC-9A气相色谱仪Chromatopac C-E1B数据处理机实验方法气相色谱条件选用SE-54石英弹性毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.32mm；气化室250℃，柱温为程序升温50～230℃，4℃/min；载气氮气，柱前压0.7kg/cm2；柱流量2ml/min，进样量0.4μl，检测器FID。超临界提取物(挥发油)GC批指纹谱，见图4。3、中间体指纹谱(1)金银花和连翘提取物指纹谱仪器与材料仪器同上述金银花和连翘提取物测定。标准品绿原酸(Chlorogenic acid)连翘甙(Phillyrin)购自中国药品生物制品检定所样品金银花和连翘提取物(国家中药制药技术工程中心提供)色谱条件同上色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相乙腈∶1％醋酸水溶液(V/V)温度室温(室内空调18～22℃)检测器PDA检测器，210～400nm全波长扫描。供试液的制备取金银花和连翘提取物，研磨成粉末，过40目筛，精密称取107.5mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中。进样前用0.45um滤膜过滤。取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析。结果见图5金银花和连翘提取物HPLC-3D图6金银花和连翘提取物HPLC-2D，峰数有20-23个(Area＞2.0×106)(2)黄芩提取物指纹谱仪器与材料同上述黄芩提取物测试。标准品黄芩甙(baicalin)购自中国药品生物制品检定所色谱条件同上。供试液的制备取黄芩提取物，研磨成粉末，过40目筛，精密称取20mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中。进样前用0.45um滤膜过滤。黄芩提取物指纹谱(HPLC-FPS)结果见图7黄芩提取物HPLC-3D图8黄芩提取物HPLC-2D，峰数有4-5个(Area＞2.0×106)4、双黄连制剂质量标准(1)双黄连制剂中绿原酸含量测定仪器与材料同上述绿原酸含量测定。色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相甲醇∶水(含2％醋酸)＝25∶75，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温。标准曲线同上述。样品测定供试液的制备取双黄连片剂，去衣后研磨成粉末，过40目筛，精密称取0.5g，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中。进样前用0.45um滤膜过滤。
取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，计算公式如下CX＝C1+(C2+C1)*(AX-A1)/(A2-A1)C1、C2分别为标准品的量；A1、A2分别为标准品峰面积；CX、AX为样品的量和峰面积。
图9双黄连片剂测绿原酸。(2)制剂中连翘甙含量测定仪器与材料同上述连翘甙含量测定。样品批号为000912双黄连薄膜包衣片色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相乙腈∶水＝28∶72，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温。标准曲线同上。样品测定供试液的制备取双黄连片剂，去衣后研磨成粉末，过40目筛，精密称取0.5g，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中。进样前用0.45um滤膜过滤。
取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，计算公式如下CX＝C1+(C2-C1)*(AX-A1)/(A2-A1)C1、C2分别为标准品的量；A1、A2分别为标准品峰面积；CX、AX为样品的量和峰面积。


图10双黄连片剂测连翘甙。(3)制剂中黄芩甙含量测定仪器与材料同上述黄芩甙含量测定。样品批号为000912双黄连薄膜包衣片色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相甲醇∶水(含2％醋酸)＝65∶35，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温。标准曲线同上。样品测定供试液的制备取双黄连片剂，去衣后研磨成粉末，过40目筛，精密称取0.1g，，置50ml容量瓶中，加甲醇/水置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，定容。进样前用0.45um滤膜过滤。
取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，计算公式如下CX＝C1+(C2-C1)*(AX-A1)/(A2-A1)C1、C2分别为标准品的量；A1、A2分别为标准品峰面积；CX、AX为样品的量和峰面积。
图11双黄连片剂测黄芩甙。5、双黄连制剂指纹谱仪器与材料仪器同上述双黄连制剂。标准品绿原酸(Chlorogenic acid)连翘甙(Phillyrin)黄芩甙(baicalin)购自中国药品生物制品检定所色谱条件同上述色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相乙腈∶1％醋酸水溶液(V/V)温度室温(室内空调18～22℃)检测器PDA检测器，210～400nm全波长扫描。供试液的制备取双黄连片剂，去衣后研磨粉末，过40目筛，精密称取200mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中。进样前用0.45um滤膜过滤。
双黄连制剂指纹谱(HPLC-FPS)。
结果见图12双黄连制剂HPLC-3D图13双黄连制剂HPLC-2D，峰数有25-30个(Area＞3.0×106)。
双黄连制剂中超临界提取物的定性控制，见图14。实例1、取金银花和连翘提取物测定绿原酸结果为1.63％。实例2、取金银花和连翘提取物测定绿原酸结果为1.62％。实例3、取金银花和连翘提取物测定绿原酸结果为2.15％。实例4、取金银花和连翘提取物测定得结果为0.17％。实例5、取金银花和连翘提取物测定得结果为0.27％。实例6、取金银花和连翘提取物测定得结果为0.38％。实例7、取黄芩提取物测定黄芩甙结果为93.4％。实例8、取黄芩提取物测定黄芩甙结果为92.2％。实例9、取黄芩提取物测定黄芩甙结果为91.3％。实例10、连翘与金银花超临界萃取物测得绝对峰面积766933(为几个成分GC面积之和)。实例11、连翘与金银花超临界萃取物测得绝对峰面积1138138(为几个成分GC面积之和)。实例12、连翘与金银花超临界萃取物测连翘与金银花超临界萃取物测得绝对峰面积906224(为几个成分GC面积之和)。实例13、取双黄连片剂测定绿原酸结果为1.64％。实例14、取双黄连片剂测定绿原酸结果为1.05％。实例15、取双黄连片剂测定绿原酸结果为1.28％。实例16、取双黄连片剂测定连翘甙结果为0.14％。实例17、取双黄连片剂测定连翘甙结果为0.22％。实例18、取双黄连片剂测定连翘甙结果为0.15％。实例19、取双黄连片剂测定黄芩甙结果为10.41％。实例20、取双黄连片剂测定黄芩甙结果为9.04％。实例21、取双黄连片剂测定黄芩甙结果为11.08％。实例22、超临界共提物仪器日本岛津GC-9A气相色谱仪Chromatopac C-ELB数据处理机实验方法气相色谱条件选用SE-54石英弹性毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.32mm；气化室250℃，柱温为程序升温50～230℃，4℃/min；载气氮气，柱前压0.7kg/cm2；柱流量2ml/min，进样量0.4μl，检测器FID。
与标准品对照，在tR＝8.551处得到β-蒎烯峰，在tR＝12.926处得到芳樟醇峰。实例23、方法同上，与标准品对照，在tR＝8.575处得到β-蒎烯峰，在tR＝12.919处得到芳樟醇峰。实例24、方法同上，与标准品对照，在tR＝8.539处得到β-蒎烯峰，在tR＝12.930处得到芳樟醇峰。实例25、双黄连制剂中超临界提取物方法同中间体部分取双黄连片剂，与标准品对照，在tR＝8.476处得到β-蒎烯峰，在tR＝12.925处得到芳樟醇峰。实例26、取双黄连片剂，与标准品对照，在tR＝8.513处得到β-蒎烯峰，在tR＝12.945处得到芳樟醇峰。
实例27、取双黄连片剂，与标准品对照，在tR＝8.524处得到β-蒎烯峰，在tR＝12.828处得到芳樟醇峰。
权利要求
1.一种复方双黄连片的质量控制方法，其特征在于该方法包括(1)药材金银花、连翘、黄芩指纹谱测试；(2)双黄连中间体质量标准测试；(3)双黄连中间体指纹谱测试；(4)双黄连制剂质量标准测试；(5)双黄连制剂指纹谱测试。
2.根据权利要求1所述的一种复方双黄连片的质量控制方法，其特征在于其所述的药材金银花、连翘、黄芩指纹谱测试方法是(1)金银花药材指纹谱色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相乙腈1％醋酸水溶液(V/V)温度室温(室内空调18～22℃)检测器PDA检测器，210～400nm全波长扫描；供试液的制备取药材金银花，研磨成粉末，过40目筛，精密称取187.5mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45um滤膜过滤，取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析；(2)连翘药材指纹谱供试液的制备取药材连翘，研磨成粉末，过40目筛，精密称取375mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45um滤膜过滤取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析；(3)黄芩药材指纹谱供试液的制备取药材黄芩，研磨成粉末，过40目筛，精密称取187mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45um滤膜过滤，取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析。
3.根据权利要求1所述的一种复方双黄连片的质量控制方法，其特征在于其所述的双黄连中间体质量标准的测试方法是(1)金银花和连翘提取物中绿原酸含量测定色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相甲醇∶水(含2％醋酸)＝25∶75，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温，样品测定供试液的制备取金银花和连翘提取物粉末，精密称取170.5mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45um滤膜过滤，取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量；(2)金银花和连翘提取物中连翘甙含量测定色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相乙腈∶水＝28∶72，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温，样品测定供试液的制备取金银花和连翘提取物粉末，精密称取292mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45um滤膜过滤；取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量；(3)黄芩提取物中黄芩甙含量测定色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相甲醇∶水(含2％醋酸)＝65∶35，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温，样品测定供试液的制备取黄芩提取物，精密称取10mg，置于100ml容量瓶，加甲醇/水超声振荡，定容，进样前用0.45um滤膜过滤，取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量；(4)超临界萃取物的含量测定气相色谱条件选用SE-54石英弹性毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.32mm；气化室250℃，柱温为程序升温50～230℃，4℃/min；载气氮气，柱前压0.7kg/cm2；柱流量2ml/min，进样量0.4μl，检测器FID。
4.根据权利要求1所述的一种复方双黄连片的质量控制方法，其特征在于其所述的双黄连片中间体指纹谱测方法是(1)金银花和连翘提取物指纹谱色谱条件同上色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mID流动相乙腈∶1％醋酸水溶液(V/V)温度室温(室内空调18～2℃)检测器PDA检测器，210～400nm全波长扫描，供试液的制备取金银花和连翘提取物，研磨成粉末，过40目筛，精密称取107.5mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45um滤膜过滤，取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，(2)黄芩提取物指纹谱色谱条件同上，供试液的制备取黄芩提取物，研磨成粉末，过40目筛，精密称取20mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45um滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的一种复方双黄连片的质量控制方法，其特征在于其所述的双黄连制剂质量标准的测试方法是(1)双黄连制剂中绿原酸含量测定色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相甲醇∶水(含2％醋酸)＝25∶75，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温，样品测定供试液的制备取双黄连片剂，去衣后研磨成粉末，过40目筛，精密称取0.5g，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45um滤膜过滤，取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，(2)制剂中连翘甙含量测定色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相乙腈∶水＝28∶72，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温，样品测定供试液的制备取双黄连片剂，去衣后研磨成粉末，过40目筛，精密称取0.5g，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45um滤膜过滤，取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量；(3)制剂中黄芩甙含量测定色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相甲醇∶水(含2％醋酸)＝65∶35，流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温，样品测定供试液的制备取双黄连片剂，去衣后研磨成粉末，过40目筛，精密称取0.1g，，置50ml容量瓶中，加甲醇/水置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，定容，进样前用0.45um滤膜过滤，取以上供试液在上述色谱条件下进行HPLC分析，按双点校正法计算样品中所含组分的含量。
6.根据权利要求1所述的一种复方双黄连片的质量控制方法，其特征在于其所述的双黄连制剂指纹谱测试方法是色谱条件同上述色谱柱Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm*250mm(made in Japan).保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID流动相乙腈∶1％醋酸水溶液(V/V)温度室温(室内空调18～22℃)检测器PDA检测器，210～400nm全波长扫描，供试液的制备取双黄连片剂，去衣后研磨成粉末，过40目筛，精密称取200mg，置于离心管中，加甲醇/水4ml置漩涡混合器上混旋1分钟，再超声振荡提取15分钟，离心，取上清液，残渣再加4ml甲醇/水超声15分钟，离心，取上清液，残渣用1.5ml甲醇/水洗，洗液与上清液合并，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45um滤膜过滤。
全文摘要
本发明提供了复方双黄连片的质量控制方法,该方法包括药材金银花、连翘、黄芩指纹谱测试;双黄连中间体质量标准测试;双黄连中间体指纹谱测试;双黄连制剂质量标准测试;双黄连制剂指纹谱测试。
文档编号G01N33/15GK1370992SQ01105429
公开日2002年9月25日 申请日期2001年2月27日 优先权日2001年2月27日
发明者沈平孃, 洪筱坤, 王智华, 王新宏, 王玉兰, 王成荣 申请人:上海复星实业股份有限公司, 国家中药制药工程技术研究中心