专利名称：用作活性表面增强拉曼光谱术(sers)基质的涂覆有金属的纳米晶硅的制作方法
技术领域：
本方法和装置涉及利用拉曼光谱术的分子检测和/或表征的领域。更特别地，本方法和装置涉及涂覆有金属的多孔基质，其用于表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)、超拉曼和/或相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)。
背景技术：
对来自生物和其他样品的单个分子进行灵敏而又准确的检测和/或鉴定已经证明是个困难的任务，但是它们在医疗诊断、病理学、毒理学、环境取样、化学分析、法医学和其他许多领域具有广泛而潜在的应用。已经尝试着使用拉曼光谱术和/或表面等离子体共振，以实现这个目标。当光通过有形介质时，一定数量的光由其原来的方向变换方向，这是称之为拉曼散射的现象。一些散射光在频率上与原始的激发光不同，这是由于光被吸收和电子激发到更高的能态，及随后在不同波长下发生光发射的缘故。拉曼发射光谱的波长是样品中吸光分子的化学组成和结构的表征，而光散射的强度取决于样品中分子的浓度。
在激发光束和样品中的单个分子之间发生拉曼相互作用的概率是非常低的，这导致拉曼分析灵敏性低且应用有限。已经观察到，在粗糙的银表面附近的分子显示出增强为6至7个数量级的拉曼散射。这种表面增强拉曼光谱术(SERS)效应与等离子体共振现象有一定联系，其中，由于金属中的传导电子的集体耦合(collective coupling)，金属纳米颗粒对入射的电磁辐射显示出显著的光学共振。事实上，金、银、铜和某些其他金属的纳米颗粒能充当微型“天线”，来增强电磁辐射的局部效应。在这些颗粒附近的分子在拉曼光谱分析中显示出大得多的灵敏性。
已经尝试着去开发SERS以用于分子检测和分析，这通常是通过在基质(substrate)的表面上涂布金属纳米颗粒或制备出粗糙的金属膜，然后将样品施于金属涂布的基质上来进行的。然而，能够沉积到平表面上的金属颗粒的数量是有限的，因而对于使用此类表面的SERS和相关拉曼技术，将产生相对低的增强因子(enhancement factor)。对具有更高密度的金属颗粒的SERS活性基质以及包含此种基质的装置的制造方法的需要便由此产生。
附图简述 下面的附图构成本说明书的一部分，将它们引入说明书是为了进一步说明要求保护的方法和装置的某些方面。通过参考其中一个或多个附图，并结合在此提供的详细描述，这些方法和装置可以被更好的理解。
图1图示了用于生产多孔硅基质110的示范性装置100(未按比例绘制)和方法。
图2图示了用于生产金属涂覆的多孔硅基质240的示范性方法。
图3图示了示范性的装置300和方法，其用于通过使用金属涂覆的SERS活性基质340来检测和/或鉴定分析物。
图4图示了用于生产金属涂覆的多孔硅基质的示范性方法，包括热分解金属盐溶液。图4A示出了多孔硅基质。图4B图示了硅氧化，例如通过等离子体氧化作用，来形成二氧化硅层。图4C示出了氧化的多孔硅浸在金属盐溶液中，诸如硝酸银溶液中。图4D图示了去除过量的金属盐溶液。图4E示出了对溶液进行干燥，以便在多孔硅基质上形成干的金属盐薄层。图4F图解了对干的金属盐进行热分解，以形成覆盖于多孔硅基质的均匀金属层。
图5图示了示范性金属(银)在多孔硅基质上的均匀沉积，这可通过热分解的方法获得。(A)用传统的扩散限制浸镀(diffusion limited immersion plating)进行处理的纳米多孔硅的银深度剖面(Silver depth profile)。(B)用银均匀涂覆的等离子体氧化、浸蘸及分解(plasma-oxidized，dip and decomposed，PODD)多孔硅基质的银深度剖面。
图6示出了示范性分析物，若丹明6G(R6G)染料分子的表面增强拉曼光谱，其通过利用银均匀涂覆的等离子体氧化、浸蘸及分解(PODD)多孔硅基质而获得。PODD基质通过图4的方法制备而得。在785nm(纳米)处进行激发，114μM的R6G溶液被用于SERS(表面增强拉曼光谱术)。图6示出了用不同孔率(porosities)的PODD银涂覆的基质获得的SERS发射光谱。各种不同的光谱被获得，按平均孔率，从最下方的曲线到最上方的曲线依次为52％、55％、65％、70％和77％。
图7示出了利用金属涂覆的纳米多孔硅基质获得的90μM腺嘌呤溶液的SERS检测，所述的金属涂覆的纳米多孔硅基质按照图4的方法制得。
图8示出了500nM的荧光素共价标记的三磷酸脱氧腺苷溶液(上方的曲线)和未标记的dATP溶液(下方的曲线)的比较SERS光谱。该dATP-荧光素从Roche Applied Science(Indianapolis，IN)获得。在荧光素标记的dATP中，检测到SERS信号强烈地增加。
示范性实施方案的描述 通过利用表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)和/或相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)，本公开的方法和装置可被用于分析物的检测和/或鉴定。比起已有的技术，本公开的方法和装置提供具有增加的金属颗粒密度、更好的金属沉积均匀性和更深的SERS增强域(field)的SERS活性基质，这使得能够更有效地进行分析物的拉曼检测和/或鉴定。
以前的用于各种分析物的SERS检测方法已经使用了胶体金属颗粒，诸如聚集的银纳米颗粒，其一般被涂覆到基质和/或支持物上(如美国专利5,306,403；6,149,868；6,174,677；6,376,177)。然而，尽管这种布置有时候使得SERS检测增加106至108的灵敏性，但是它们无法进行小的分析物诸如核苷酸的单分子检测，如本文所公开的。在胶体颗粒聚集体内，拉曼检测的灵敏性增强并不均匀，在很大程度上取决于“热点”的存在。此种热点的物理结构、出现灵敏性的增强时与纳米颗粒的距离范围，以及允许灵敏性出现增强时聚集体纳米颗�：头治鑫镏涞目占涔叵刀蓟姑挥斜槐碚�。进一步，聚集的纳米颗粒在溶液中可能会不稳定，这会对单分子分析物检测的可重复性产生不利的影响。本方法和装置为SERS检测提供了稳定的微环境，在其中，拉曼活性的金属基质的物理构型和密度可以被准确地控制，这使得分析物可以在溶液进行可重复的、灵敏且准确的检测。
下面的详细描述包含许多具体细节，以便提供对要求保护的方法和装置的更为彻底的理解。然而，对本领域技术人员显而易见的是，没有这些具体细节，本方法和/或装置也可以被实施。在其他例子中，本领域已熟知的器件、方法、程序及各个组分在本文中没有被详细地描述。
定义 如本文中所使用的，“一”或“一个”可以指一个或多于的项目。
如本文中所使用的，术语“分析物(analyte)”指感兴趣的被检测和/或鉴定的任何原子、化学物质、分子、化合物、组合物或聚集体。分析物的非限制性例子包括氨基酸、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂类、激素、代谢物、细胞因子、趋化因子、受体、神经递质、抗原、过敏原、抗体、底物、代谢物、辅因子、抑制剂、药剂、药物、营养物、朊病毒、毒素、毒物、爆炸物、杀虫剂、化学战争试剂、生物�：�、放射性同位素、维生素、杂环芳香族化合物、致癌物质、诱变剂、麻醉剂、苯丙胺、巴比妥酸盐、致幻剂、废品和/或污染物。分析物可以是不加以标记的，或可以用一个或多个拉曼标记物进行标记，如下文所述。
“捕获(capture)”分子在本文中被用来指可以结合一个或多个目标分析物的任何分子。“捕获”分子的非限制性例子包括抗体、抗体片段、遗传工程抗体、单链抗体、受体蛋白、结合蛋白、酶、抑制剂蛋白、凝集素、细胞黏附蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、核酸和适体。
如本文中所使用的，术语“纳米晶硅(nanocrystalline silicon)”指包含纳米尺寸的硅晶体的硅，通常尺寸在1至100纳米(nm)范围内。“多孔硅(poroussilicon)”指已被蚀刻或进行其他处理，从而形成多孔结构的硅。
如本文中所使用的，术语“有效连接(operably coupled)”指装置和系统的两个或多个单元之间具有功能上的相互作用。例如，如果计算机能获取、处理、保存和/或传输由检测器所检测到的拉曼信号，则该拉曼检测器是可以“有效连接”到该计算机上。
多孔基质 本文中公开的某些方法涉及具有一种或多种金属诸如拉曼活性金属的均匀层的涂覆多孔基质。尽管本文中公开的多孔基质是多孔硅基质，然而要求保护的主题并不限制于那些实施例。任何可以耐受热应用的多孔基质都可以被用于在此公开的方法、系统和/或装置中。加热至约300℃、400℃、500℃、600℃、700℃、800℃、900℃或1000℃的应用是可以被考虑的。多孔基质可以是硬性的，或可以是柔性的。可以使用的各种多孔基质是已知的，包括但不局限于多孔硅、多孔多晶硅、多孔金属栅格和多孔铝。制备多孔基质的示范性方法将在下面进一步的描述中被公开。
多孔多晶硅基质可以用已知的技术制备而得(如美国专利6,249,080和6,478,974)。例如，通过使用低压化学气相沉积(LPCVD)，多孔多晶硅层可以形成于半导体基质上。LPCVD条件可以包括，例如，约20帕斯卡的压力、约640℃的温度和约600sccm(标准立方厘米)的硅烷气流(美国专利6,249,080)。例如，通过使用利用HF(氢氟酸)进行的电化学阳极氧化法或利用硝酸和氢氟酸进行的化学蚀刻法，多晶硅层可以被蚀刻，以使其具有多孔性(美国专利6,478,974)。通常，通过这类技术形成的多孔多晶硅层的厚度限制在约1μm(微米)或更小。相反，多孔硅可以在大块硅晶片的整个厚度内被蚀刻，其厚度通常为约500μm。
多孔铝基质也可以利用已知的技术来制备(如Cai et al.，Nanotechnology13627，2002；Varghese et al.，J Mater.Res.171162-1171，2002)。例如，使用电化学辅助自组装工艺(electrochemical-assisted self-assembly process)，纳米多孔氧化铝薄膜可以在硅或二氧化硅上制造(Cai et al.，2002)。可对多孔铝膜进行热退火，以改善其均匀性(Cai et al.，2002)。可替代地，固体铝的薄层可以在草酸和/或硫酸稀溶液中进行电化学阳极氧化，以产生纳米多孔铝膜(Varghese et al.，2002)。本文中公开的例子不是限制性的，可以使用任何类型的耐热多孔基质。使用本文中公开的方法，此类多孔基质可以用一种或多种金属诸如银均匀地浸渍。
纳米晶多孔硅(Nanocrystalline Porous Silicon)纳米晶硅(Nanocrystalline Silicon) 本文中公开的某些示范性装置，可以包含一层或多层纳米晶硅。生产纳米晶硅的各种方法是本领域已知的(如Petrova-Koch et al.，″Rapid-thermal-oxidized porous silicon-the superior photoluminescent Si，″Appl.Phys.Lett.61943，1992；Edelberg，et al.，″Visible luminescence from nanocrystallinesilicon films produced by plasma enhanced chemical vapor deposition，″Appl.Phys.Lett.，681415-1417，1996；Schoenfeld，et al.，″Formation of Si quantum dots innanocrystalline silicon，″Proc.7th Int.Conf.on Modulated Semiconductor Structures，Madrid，pp.605-608，1995；Zhao，et al.，″Nanocrystalline Sia material constructed bySi quantum dots，″1st Int.Conf.on Low Dimensional Structures and Devices，Singapore，pp.467-471，1995；Lutzen et at.，Structural characteristics of ultrathinnanocrystalline silicon films formed by annealing amorphous silicon，J.Vac.Sci.Technology B 162802-05，1998；美国专利5,770,022；5,994,164；6,268,041；6,294,442；6,300,193)。本文中公开的方法和装置不受生产纳米晶硅的方法所限制，并应该想到的是，任何已知的方法都可以被使用。
生产纳米晶硅的非限制性示范方法包括硅(Si)植入富含硅的氧化物并退火；用金属成核催化剂进行固相结晶；化学气相沉积；PECVD(等离子体增强化学气相沉积)；气体蒸发；气相热解；气相光解(gas phase photopyrolysis)；电化学蚀刻法；硅烷和聚硅烷的等离子体分解；高压液相氧化-还原反应；非晶硅层的快速退火；用LPCVD(低压化学气相沉积)沉积非晶硅层，然后进行RTA(快速热退火)循环；使用硅阳极的电弧等离子体沉积和硅的激光烧蚀(美国专利5,770,022；5,994,164；6,268,041；6,294,442；6,300,193)。取决于工艺，尺寸为1至100nm或更大的Si晶体，可以作为薄层而形成于芯片上、作为分离的层和/或作为聚集的晶体。在某些方法和装置中，可以使用薄层，该薄层包含附着到基质层的纳米晶硅。
可以考虑的是，在要求保护的方法和装置中，可以使用纳米晶硅。然而，本方法和装置并不限制原始材料的组成，在替代方法和装置中，可以考虑的是，其他材料也可以被利用，唯一的要求是该材料必须能够形成多孔基质，而该多孔基质可以用拉曼灵敏性金属进行涂覆。
硅晶体的尺寸和/或形状和/或多孔硅中的孔尺寸可以选定在预定的范围之内，例如，以便优化涂覆有金属的多孔硅的等离子体共振频率(参见美国专利6,344,272)。通过控制涂覆于多孔硅的金属层的厚度，等离子体共振频率可以进行调整(美国专利6,344,272)。用于控制纳米尺度的硅晶体的尺寸的技术是已知的(如美国专利5,994,164和6,294,442)。
多孔硅 某些要求保护的方法和装置涉及使用具有拉曼活性的金属涂覆的基质。该基质可以包括纳米晶多孔硅。如上所述，该基质不限于纯硅，而是可以包含氮化硅、锗和/或已知用于芯片制造的其它材料。其他少量的材料也可以存在，诸如金属成核催化剂和/或掺杂物。唯一的要求是，该基质材料必须能够形成多孔基质，而该多孔基质可以用拉曼灵敏性金属涂覆。多孔硅具有高达783m2/cm3的大表面积，这为表面增强拉曼光谱术技术提供了非常大的表面。
在20世纪50年代晚期，通过在稀盐酸溶液中对硅进行电抛光，发现了多孔硅。如本领域所知道的，通过在电化学池中，用稀氢氟酸(HF)蚀刻硅基质，可以产生多孔硅。在某些情况下，硅最初可以在低电流密度(current densities)下，在HF中被蚀刻。最初的孔形成之后，硅从电化学池中移出，在非常稀的HF中被蚀刻，以使在电化学池中形成的孔变宽。取决于硅是否被掺杂、掺杂物的类型和掺杂度，硅基质的组成也会影响孔尺寸。掺杂对于硅孔尺寸的影响是本领域已知的。为了检测和/或鉴定大的生物分子，可以选择约2nm至100或200nm的孔尺寸。也可以对孔在多孔硅中的定向(orientation)进行选择。例如，蚀刻的1，0，0晶体结构将具有与该晶体相垂直定向的孔，而1，1，1或1，1，0晶体结构将具有与晶体轴线对角定向的孔。晶体结构对孔定向的影响是本领域已知的。晶体组成和多孔性也可以被调节，以改变多孔硅的光学特性，以便增强拉曼信号并减少背景干扰。多孔硅的光学特性是本领域已知的(如Cullis et al.，J.Appl.Phys.82909-965，1997；Collins et al.，Physics Today 5024-31，1997)。
图1示出了用于生产多孔硅基质的方法和装置100的非限制性例子。硅晶片110被置于电化学池120中，电化学池120包含惰性材料，诸如Teflon。晶片110被连接到恒流源130的正极，从而形成电化学池120的阳极110。恒流源130的负极被连接到阴极140，诸如铂阴极140。电化学池120可以充入HF的乙醇稀电介质溶液150。可替代地，HF 150可以溶解于本领域已知的其他醇和/或表面活性剂中，诸如戊烷或己烷。计算机可有效连接到恒流源130，以调节电流、电压和/或电化学蚀刻的时间。暴露于电化学池120内的HF电介质溶液150中的硅晶片110被蚀刻，从而形成多孔硅基质110。如本领域所知道的，通过调节阳极氧化的时间和/或电流密度以及电介质溶液中的HF 150的浓度，多孔硅层的厚度和硅的多孔程度可以被控制(如美国专利6,358,815)。
通过用任何已知的抗蚀剂化合物诸如聚甲基-甲基丙烯酸酯进行涂覆，硅晶片110的一部分可以免遭HF 150蚀刻的破坏。平版印刷方法，诸如照相平版印刷术可以用于将硅晶片110的经选择的部分暴露于HF 150蚀刻，这是本领域已知的。选择性蚀刻可以用来控制将被应用于拉曼光谱术的多孔Si室的尺寸和形状。对于某些应用，可以使用直径约1μm(微米)的多孔硅腔。在其他应用中，可以使用宽度约1μm的多孔硅沟或通道。多孔硅腔的尺寸不是限制性的，可以这样理解，可以使用任何尺寸或形状的多孔硅腔。例如，可以使用1μm的腔室尺寸，配以尺寸为1μm的激发激光器。
对于生产多孔硅基质，上面公开的示范性方法不是限制性的，可以这样理解，本领域已知的任何方法都可以被使用。用于制造多孔硅基质的方法的非限制性例子包括硅晶片的阳极蚀刻法；电镀；以及沉积含硅/氧的材料，然后进行受控制的退火；(例如Canham，″Silicon quantum wire array fabrication byelectrochemical and chemical dissolution ofwafers，″Appl.Phys.Lett.571046，1990；美国专利5,561,304；6,153,489；6,171,945；6,322,895；6,358,613；6,358,815；6,359,276)。多孔硅层可以被附着到一个或多个支持层，诸如块硅(bulk silicon)、石英、玻璃和/或塑料。可以使用蚀刻停止层(etch stop layer)，诸如氮化硅，来控制蚀刻的深度。可以使用已知的芯片制造方法，将多孔硅层整合入半导体芯片中。涂覆有金属的多孔硅腔可以被设计成为集成芯片的一部分，连接于各种通道、微通道、纳米通道、微流态通道、反应室等。可替代地，涂覆有金属的多孔硅腔可以从硅晶片上切割下来，并整合入芯片和/或其他器件中。
可以理解，可以对多孔硅基质进行其他修饰，这或者在涂覆金属之前进行，或者在涂覆金属之后进行。例如，在蚀刻之后，使用本领域已知的方法，将多孔硅基质氧化成为氧化硅和/或二氧化硅。氧化作用可以被用来，例如，增加多孔硅基质的机械强度和稳定性。可替代地，涂覆有金属的硅基质可以进一步进行蚀刻，以去除硅材料，形成金属外壳，该金属外壳可以是中空的，或可以充入其它材料，诸如附加的拉曼活性金属。
多孔硅的金属涂覆 利用本领域已知的任何方法，多孔硅基质可以被涂覆以拉曼活性金属，如金、银、铂、铜或铝。非限制性的示范性方法包括电镀；阴极电迁移；金属蒸发或喷镀；使用晶种来催化电镀(即，使用铜/镍晶种来镀金)；离子植入；扩散；或用于将薄金属层涂到硅基质上的本领域已知的任何方法(见，例如Lopez andFauchet，″Erbium emission form porous silicon one-dimensional photonic band gapstructures，″Appl.Phys.Lett.773704-6，2000；如美国专利5,561,304；6,171,945；6,359,276)。涂覆金属的其他非限制性例子包括非电性涂镀(如Gole et al.，″Pattemed metallization of porous silicon from electroless solution for directelectrical contact，″J.Electrochem.Soc.1473785，2000)。金属层的组成和/或厚度可以被控制，以优化涂覆有金属的多孔硅的等离子体共振频率。
用于分析物检测的拉曼活性基质可以包括涂覆有金属的纳米晶多孔硅基质，固定化的金属胶体，诸如银或金纳米颗粒，被涂覆在不同类型的基质上，和/或固定化的金属胶体涂覆于金属涂覆的纳米晶多孔硅基质上。后者的组合物将具有非常高密度的拉曼活性金属，配以相对小的通道，以便溶液中的分析物进入基质中。尽管这对于大的分析物分子，诸如蛋白质和核酸不太有利，但它可以提供给小的分析物，诸如核苷酸或氨基酸更好的灵敏性和检测能力。金属胶体可以是纳米颗粒的形式，如下面所述。
已经知道，砷-阳极氧化的多孔硅可充当金属离子的温和还原剂，从而引起金属在多孔区域上表面上的自发浸渍涂覆，并封闭孔开口。因此，使用金属浸渍的标准方法，很难获得均一的金属纵深剖面，同时维持多孔表面的开放状态。在未封闭孔和金属穿透深度之间有冲突，其可以进行如下解释。要获得更好的金属纵深剖面，高浓度的金属离子是必须的。然而，因为由自发浸渍涂镀反应产生的厚金属膜沉积的缘故，暴露于高浓度的金属盐溶液将使孔关闭。为了维持孔的开放状态，溶液中金属离子的浓度必须较低。然而，这使得渗透深度不足，而且减少了金属沉积的数量。通过本文中公开的方法，该问题得以被解决，其允许获得更均匀的金属沉积，同时孔不被封闭。
利用金属盐的热分解进行金属涂覆 如图4所述，通过包括热分解金属盐层440的方法，多孔硅基质410可以用金属450，诸如拉曼灵敏性金属450均匀地涂覆。金属450可以是银、金或其他拉曼活性金属。多孔硅基质410(图4A)可以，例如按上面公开的那样被获得。为了防止早熟的金属450沉积和孔封闭现象，硅的表面层可以被氧化为二氧化硅420(图4B)，例如通过化学氧化或等离子体氧化来完成。通过稳定多孔硅表面420，该氧化作用防止了自发浸镀。如果不进行氧化，带正电的银阳离子可以与未氧化的硅410一起参与氧化还原反应，从而导致自发的银金属450沉积。
进行氧化作用之后，多孔硅基质410可以用金属盐溶液430，诸如1M的硝酸银(AgNO3)溶液润湿(图4C)。在非限制性例子中，氧化的多孔硅基质410被浸入硝酸银溶液430中，时间为20分钟，直到孔完全用硝酸银溶液430润湿。通过例如氮枪干燥法(nitrogen gun drying)，将过量的金属盐溶液去除(图4D)。通过例如加热到100℃20分钟，滞留在孔中的溶液430可以被干燥(图4E)。这时，溶剂已经蒸发掉，干的硝酸银盐440的薄层被沉积在多孔硅410的表面上。通过例如在环境压力炉中，加热到500℃30分钟，干的盐440可以被热分解(图4F)。在高于约573°K(约300℃)的温度下，式1的反应自发进行。根据式1，硝酸盐离子转换为二氧化氮气体，从而形成涂覆于多孔硅基质410的金属银450的均匀沉积层(图4F)。尽管二氧化氮已经被用作光蚀刻剂，但在本公开方法的条件下，它不蚀刻二氧化硅层420。
(1) 通过例如改变金属盐溶液430的浓度，沉积的金属层450的厚度可以被控制。取决于要沉积的金属层450的厚度，盐溶液430的浓度可以在较宽的范围内变化，即为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5至5.0M(molar)。尽管示范性方法是利用银溶液430，但本方法不局限于沉积银450，而是可以包括任何已知的金属450，包括，但不限于拉曼活性金属，诸如金、铜、铂、铝等。本方法也不限制使用的盐的类型。用于形成金属盐的阴离子种类可以是这样的，其在热分解工艺期间被转换成气体物质，并被驱除掉，诸如硝酸根或硫酸根离子。然而，在其他替代方案中，可以毫无限制地使用任何的阴离子物质。
利用微流态浸渍进行金属涂覆 在替代方法中，通过利用微流态浸渍(microfluidic impregnation)，多孔膜，诸如多孔硅膜，可以用金属涂覆。在示范性方法中，多孔硅膜可以如上面公开的那样被获得。多孔硅层可以被电抛光并被悬浮于溶液中。电抛光的膜可以被插入通过十字通路(cross-paths)连接的一个或多个溶剂容器和废物容器之间的微流态通道中。此微流态通道可以通过本领域已知的任何方法产生，诸如用PDMS(聚二甲基硅氧烷)进行微成型、标准的平版印刷技术或照相平版印刷术，以及对各种芯片材料的蚀刻技术(如Duffy et al.，Anal.Chem.704974-84，1998)。多孔硅膜可以被整合入任何类型的微流态系统中。整合有多孔硅膜的微流态系统可以用于广泛的各种应用中，其涉及聚合物分子的分析和/或分离，所述聚合物包括但不限于蛋白质和核酸。用于微米和/或纳米尺度制造的方法是本领域已知的，如下面所更详细描述的。
金属盐溶液诸如硝酸银溶液，可以被引导通过溶剂容器，并允许其流经多孔硅膜，到达废物容器。如式2所示，会发生自发反应。
如式2公开的，在氧化还原反应中，含水金属溶液自发地与多孔硅表面反应，从而在多孔硅上产生沉积的金属涂层。通过调整溶液中金属盐的浓度、流经微流态通道的速度、温度，和/或溶液流经膜时的时长，金属涂层的厚度可以被控制。控制这样的镀金属反应的技术是本领域已知的。
本方法并不局限于银溶液，也可以用其他金属盐溶液实施，包括但不限于拉曼活性金属，诸如金、铂、铝、铜等。在其他替代选择中，通过使用包含不同金属镀液的多个溶剂容器，将两种或多种不同的金属镀到多孔硅膜上。一个或多个容器可以包含洗涤溶液，以去除过量的金属镀液。用多种金属进行的涂覆，可以被用来控制金属涂覆的多孔硅膜的电、光和/或拉曼表面特性，诸如，拉曼信号的表面增强程度、与发生共振的表面的距离、拉曼共振的波长范围等。
公开的方法导致产生被整合到微流态通道的涂覆有金属的多孔硅膜。这样的一种集成芯片可以直接被整合入拉曼检测系统中。被怀疑含有目标分子的一种或多种样品可以被装载入相应的溶剂容器中。样品可以通过通道被引导通过微流态通道，进入涂覆有金属的膜。一旦进入膜中，目标分子可以被激发光源诸如激光所激发。发射的拉曼信号可以被拉曼检测器检测，如下面更加详细描述的。一旦被分析后，样品可以被移入废物容器中，膜被洗涤，并进行下一个样品的分析。拉曼检测系统可以整合本领域已知的各种组件，诸如拉曼检测器和激发光源，或可以包括设计的定制组件，这些组件将完全集成到系统中，以优化分析物的拉曼检测。
纳米颗粒 拉曼活性金属颗粒，诸如金或银纳米颗粒，可以被加入到涂覆有金属的多孔硅基质中，以进一步增强拉曼信号。直径在1nm和2μm之间的纳米颗�？梢员皇褂�。可替代地，可以考虑直径在2nm至1μm、5nm至500nm、10nm至200nm、20nm至100nm、30nm至80nm、40nm至70nm或50mn至60nm之间的纳米颗粒。也可以考虑平均直径10至50nm、50至100nm或约100nm的纳米颗粒。纳米颗粒的尺寸取决于涂覆有金属的多孔硅中的孔直径，可以对该尺寸进行选择以便纳米颗粒正好容纳在孔里面。尽管任何形状或不规则形状的纳米颗粒都可以被使用，纳米颗粒在形状上可以是近似球形的。制备纳米颗粒的方法是已知的(如美国专利6,054,495；6,127,12；6,149,868；Lee and Meisel，J.Phys.Chem.863391-3395，1982)。纳米颗粒也可以以纳米棱柱的方式产生(Jin et al.，″Photoinduced conversion of silver nanospheres to nanoprisms，″Science2941901，2001)。纳米颗�？梢源由桃登阑竦�(例如Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)。
纳米颗�？梢允悄擅卓帕５乃婊奂�(胶体纳米颗粒)。可以替代地，纳米颗粒可以被交联，以产生特定的纳米颗粒聚集体，诸如二聚体、三聚体、四聚体或其他聚集体。可以使用由一群不同的或同质的纳米颗粒聚集体构成的聚集体异质混合物。通过利用已知的技术，诸如在蔗糖梯度溶液中的超离心技术，含有选定数量的纳米颗粒(二聚体、三聚体等)的聚集体可以被富集或纯化。
交联纳米颗粒的方法是本领域已知的(参见，例如Feldheim，″Assembly ofmetal nanoparticle arrays using molecular bridges，″The Electrochemical SocietyInterface，Fall，2001，pp.22-25)。金纳米颗粒与具有末端硫醇或巯基基团的连接化合物的反应是已知的(Feldheim，2001)。单个的连接化合物可以在其两端用硫醇基团进行衍生。一旦与金纳米颗粒反应之后，该连接物将形成纳米颗粒二聚体，其通过连接物的长度而被间隔。可替代地，具有三、四或更多硫醇基团的连接物可以被用于同时附着到多个纳米颗粒上(Feldheim，2001)。相对于连接化合物，使用过量纳米颗粒可防止形成多交联和纳米颗粒沉淀。银纳米颗粒的聚集体可以通过本领域已知的标准合成方法来形成。
金或银纳米颗�？梢杂醚苌柰椋钊绨被柰�、3-环氧丙基氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)涂覆。硅烷末端的活性基团可以被用于形成纳米颗粒的交联聚集体。可以想到的是，使用的连接化合物几乎可以是任何长度的，范围在约0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90至100nm或更大长度。也可以使用不同长度的连接物。
在被附着到连接物化合物之前，纳米颗粒可以被修饰，以包含各种活性基团。修饰的纳米颗粒可以从商业渠道获得，诸如Nanogold纳米颗粒，其来自Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)。Nanogold纳米颗�？梢酝üジ龌蚨喔雎砝歹Ｑ前�、胺或其他基团附着到每一个纳米颗粒上而获得。Nanogold纳米颗粒也有带正电或带负电形式的，以方便在电场中操纵纳米颗粒。这样的修饰的纳米颗�？梢员桓阶诺礁髦忠阎牧踊衔锷希蕴峁┠擅卓帕５亩厶濉⑷厶寤蚱渌奂�。
所使用的连接化合物的类型是不受限制的，只要它产生不会在溶液中沉淀的纳米颗粒的小聚集体。例如，连接物基团可以包括苯乙炔聚合物(Feldheim，2001)。可替代地，连接物基团可以包括聚四氟乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯、聚丙稀、聚丙烯酰胺、聚乙烯或其他已知的聚合物。所使用的连接化合物不限于聚合物，也可以包括其他类型的分子，诸如硅烷、烷烃、衍生硅烷或衍生烷烃。特别地，化学结构相对简单的连接化合物，诸如烷烃或硅烷，可以被使用，以避免干扰分析物发出的拉曼信号。
微电子机械系统(MEMS) 拉曼活性金属涂覆的多孔硅基质可以被整合到更大的装置和/或系统中。例如，该基质可以被整合到微电子机械系统(MEMS)中。MEMS是包括机械元件、传感器、执行器和电子器件的一体化系统。所有这些组件可以通过已知的微加工技术在普通的芯片上制造，所述芯片包括硅基或等同的基质(例如，Voldman et al.，Ann.Rev.Biomed.Eng.1401-425，1999)。MEMS的传感器组件可以被用来测量机械、热、生物、化学、光学和/或磁现象。电子器件可以处理来自传感器的信息，并控制执行器组件，诸如泵、阀、加热器、冷却器、过滤器等，从而控制MEMS的功能。
MEMS的电子组件可以使用集成电路(IC)工艺(如CMOS、Bipolar或BICMOS工艺)制造。它们可以使用在计算机芯片制造中已知的光刻蚀和蚀刻方法来成型。微机械组件可以用相容的”微机械加工”工艺制造，该工艺选择性地蚀刻掉部分的硅晶片或加入新的结构层，从而形成机械和/或机电组件。
制造MEMS的基本技术包括在基质上沉积薄膜材料，通过照相平版印刷成像或其他已知的刻蚀方法在膜顶部施加具有一定图案的掩蔽，并选择性地蚀刻所述膜。薄膜的厚度可以在几纳米至100微米的范围内。使用的沉积技术可以包括化学方法，诸如化学气相沉积(CVD)、电沉积、外延生长和热氧化，和物理方法，诸如物理气相沉积(PVD)和铸造。制造纳米机电系统的方法可以被用于本发明的某些实施方案中(参见，例如Craighead，Science 2901532-36，2000)。
涂覆有金属的多孔硅基质可以被连接到各种充满流体的腔室，诸如微流态通道、纳米通道和/或微通道。装置中的这些组件和其他组件可以形成为一个单一的单元，例如，芯片的形式，正如在半导体芯片和/或微毛细管或微流态芯片中所知的。可替代地，涂覆有金属的多孔硅基质可以从硅晶片移走，并附着到设备的其他组件。已知用于此类芯片的任何材料都可以被应用于在此公开的装置，包括硅、二氧化硅、氮化硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、塑料、玻璃、石英等。
芯片的分批制造技术是计算机芯片制造和/或微毛细管芯片制造领域已知的。此类芯片可以用本领域任何已知的方法制造，诸如照相平版印刷和蚀刻、激光烧蚀、喷射模塑、铸造、分子束取向生长、蘸笔纳米刻蚀、化学气相沉积(CVD)加工、电子束或聚焦离子束技术或印刷技术。非限定性的例子包括用可流动的、光学上清晰的材料诸如塑料或玻璃进行常规的模塑；二氧化硅的光刻蚀和干法蚀刻；应用聚甲基丙烯酸甲酯抗蚀剂进行电子束刻蚀，使氮化硅基质140上的铝掩膜形成图案，随后进行活性离子蚀刻。用于制造纳米机电系统的方法可以被用于本发明的某些实施方案(参见，例如Craighead，Science 2901532-36，2000)。各种形式的微制造芯片可以从商业渠道获得，例如Caliper Technologies Inc.(Mountain View，CA)和ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
装置的部分或全部可以被选择为对用于拉曼光谱术的处于激发和发射频率的电磁辐射是透明的，诸如玻璃、硅、石英或光学上清晰的其它任何材料。对于可以暴露于各种生物分子诸如蛋白质、肽、核酸、核苷酸和类似物的充满流体的室，暴露于这些分子的表面可以通过涂覆被加以修饰，以便例如将疏水性表面转化为亲水性表面，和/或减少分子吸附至表面。普通的芯片材料诸如玻璃、硅、石英和/或PDMS的表面修饰是本领域已知的(如美国专利6,263,286)。此类修饰可以包括但不局限于，用商业上可获得的毛细涂料(Supelco，Bellafonte，PA)、具有各种功能基团诸如聚环氧乙烷或丙烯酰胺的硅烷，或本领域已知的任何其他涂料进行涂覆。
拉曼光谱术 利用表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)和/或相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)检测，所公开的方法、系统和装置可以被用于分析物的检测和/或鉴定。相比起已有的技术，在此公开的方法、系统和装置提供了具有增加的且更均匀的金属密度以及更深的SERS增强范围的SERS活性基质，这使得能更有效地进行分析物的拉曼检测和/或鉴定。
以前的用于各种分析物的SERS检测方法已经使用了胶体金属颗粒，诸如聚集的银纳米颗粒，其一般被涂覆到基质和/或支持物上(如美国专利5,306,403；6,149,868；6,174,677；6,376,177)。然而，尽管这种布置有时候使得SERS检测增加106至108的灵敏性，但是它们无法进行小的分析物诸如核苷酸的单分子检测，如在此所公开的。在胶体颗粒聚集体内，拉曼检测的灵敏性增强明显地并不均匀，而是在很大程度上取决于“热点”的存在。此种热点的物理结构、出现灵敏性的增强时与纳米颗粒的距离范围，以及允许灵敏性出现增强时聚集体纳米颗�：头治鑫镏涞目占涔叵刀蓟姑挥斜槐碚�。进一步，聚集的纳米颗粒在溶液中可能会不稳定，这会对单分子分析物检测的可重复性产生不利的影响。本方法和装置为SERS检测提供了稳定的微环境，在其中，拉曼活性的金属基质的物理构型和密度可以被准确地控制，这使得分析物可以在溶液进行可重复的、灵敏且准确的检测。
拉曼检测仪器 通过拉曼光谱术的任何已知方法，分析物可以被检测和/或鉴定。拉曼活性基质可以有效偶联到一个或多个拉曼检测装置上。利用拉曼光谱术检测分析物的各种方法是本领域已知的(如美国专利6,002,471；6,040,191；6,149,868；6,174,677；6,313,914)。表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)、超拉曼光谱术和相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)的各种变型已经被公开。在SERS和SERRS中，对于被吸附在粗糙金属表面，诸如银、金、铂、铜或铝表面上的分子，拉曼检测的灵敏性被增加106或更多倍(factor)。
拉曼检测装置的非限制性例子公开于美国专利6,002,471。激发束由倍频(frequency doubled)Nd:YAG激光器在532nm波长处产生，或者由倍频Ti蓝宝石激光器在365nm波长处产生。脉冲激光束或连续激光束都可以被使用。激发束穿过共聚焦光学器件和显微镜物镜，被聚焦于拉曼活性基质上，该拉曼活性基质含有一种或多种分析物。来自分析物的拉曼发射光被显微镜物镜和共聚焦光学器件收集，并偶联至用于光谱离解(spectral dissociation)的单色器上。共聚焦光学器件包括分色滤波器、阻挡滤波器、共焦针孔、透镜和反光镜的组合，它们用于降低背景信号。标准的全视场光学器件可以同共聚焦光学器件一样被使用。拉曼发射信号可以用拉曼检测器来检测，所述检测器可以包括与用于计算和信号数字化的计算机相接的雪崩二极管。
在美国专利5,306,403中，公开了拉曼检测装置的可供选择的实例，其包括Spex Model 1403双-光栅分光光度计，配有砷化镓光电倍增管(RCA ModelC31034或Burle Industries Model C3103402)，其以单光子计数模式进行操作。激发源包括514.5nm光谱线的氩离子激光，来自SpectraPhysics，Model 166；和647.1nm光谱线的氪离子激光(Innova 70，Coherent)。
可供选择的激发源包括337nm处的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm处的氦-镉激光器(Liconox)(美国专利6,174,677)、发光二极管、Nd:YLF激光器，和/或各种离子激光器和/或染料激光器。激发束可以用带通滤光片(Corion)进行光谱纯化，并且可以用6X物镜(Newport，Model L6X)聚焦于拉曼活性基质上。通过使用全息分束器(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)，物镜可以被用来激发分析物和收集拉曼信号，从而产生激发束和发射的拉曼信号的直角几何关系。全息陷波滤波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)可以被用于减少瑞利散射辐射。可供选择的拉曼检测器包括但不局限于ISA HR-320摄谱仪，其配备有红色增强的强化电荷耦合器件(red-enhanced intensified charge-coupleddevice，RE-ICCD)检测系统(Princeton Instruments)。其他类型的检测仪也可以被使用，诸如傅立叶转换摄谱仪(基于Michaelson干涉仪)、电荷注入器件(chargedinjection devices)、光电二极管阵列、InGaAs检测仪、电子倍增CCD、强化型CCD和/或光电晶体管阵列。
任何合适形式或构造的拉曼光谱术或本领域已知的相关技术都可以被用于检测分析物，包括，但不限于普通拉曼散射、共振拉曼散射、表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)、受激拉曼散射、反拉曼光谱术、受激获得性拉曼光谱术(stimulated gain Ramanspectroscopy)、超拉曼散射、分子光学激光检测器(molecular optical laserexaminer，MOLE)或拉曼微探针或拉曼显微技术或共聚焦拉曼显微光谱术、三维或扫描拉曼、拉曼饱和光谱术、时间分辨共振拉曼、拉曼去偶合光谱术或紫外-拉曼显微技术。
拉曼标记 某些方法可以涉及将标记附着到一种或多种分析物上，以方便用拉曼检测装置检测它们。可以用于拉曼光谱术的标记的非限定性例子包括TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、地高辛、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱、菁、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、量子点、碳纳米管和富勒烯。这些和其他的拉曼标记可以从商业渠道获得(如MolecularProbes，Eugene，OR；Sigma Aldrich Chemical Co.，St.Louis，MO)，和/或用本领域已知的方法合成。
多环芳香族化合物可以用作拉曼标记，这在本领域是已知的。其他可以用于本发明的特定实施方案的标记包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫基团。在拉曼光谱术中使用标记是本领域已知的(如美国专利5,306,403和6,174,677)。技术人员将认识到，所使用的拉曼标记应该能产生可识别的拉曼光谱，并可以特异性地结合到或连接到不同类型的分析物。
标记可以直接地被附着到分析物，或可以通过各种连接化合物附着到分析物。用于本公开方法的交联试剂和连接化合物是本领域已知的。含有活性基团的拉曼标记可以通过商业渠道获得(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)，其中的活性基团被设计用来通过共价的方式与其他分子，诸如分析物反应。用于制备标记的分析物的方法是已知的(如美国专利4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
实施例实施例1拉曼活性基质的构建纳米晶硅的形成 用于形成纳米晶多孔硅基质110的示范性方法和装置100图示于图1。用于制造纳米晶多孔硅的方法是本领域已知的(如美国专利6,017,773)。纳米晶多孔硅层可以用电化学的方法形成，如Petrova-Koch等(Appl.Phys.Let.61943，1992)所公开。取决于具体的应用，在蚀刻之前，硅可以被轻或重p型或n型掺杂，以调节多孔硅基质110的特性。单晶硅锭可以用为人们所熟知的Czochralski方法制造(如http//www.msil.ab.psiweb.com/ehglish/msilhist4-e.html)。单晶硅晶片110可以在稀HF/乙醇150中，用阳极蚀刻法处理，以形成纳米晶多孔硅基质110。可替代地，可以使用在HF、硝酸和水的溶液150中进行的化学蚀刻法，而无需进行阳极蚀刻。
在蚀刻之前，晶片可以用聚甲基-甲基丙烯酸酯抗蚀剂或任何其它已知的抗蚀剂化合物涂覆。通过利用标准的照相平版印刷技术，纳米晶多孔硅基质110的图案可以被形成。纳米晶多孔基质110可是圆形的、沟形的(trench shaped)、槽形(channel shaped)或任何其他选择的形状。多个多孔基质110可以在单硅晶片110上形成，以便可以形成用于拉曼分析的多取样通道和/或腔室。每一取样通道和/或腔室可以被有效连接到一个或多个拉曼检测仪。
进行抗蚀剂涂覆和平版印刷之后，晶片110被暴露于处于乙醇和/或蒸馏水中的约15wt％至50wt％的HF 150溶液中，该溶液包含在电化学池120中，该电化学池120由Teflon构成，如图1所公开的。整个经抗蚀剂涂覆的晶片110可以被浸入HF 150溶液。可替代地，例如使用合成橡胶垫圈，晶片110可以被固定于电化学池120中，仅一部分的晶片110表面暴露于HF 150溶液(美国专利6,322,895)。在任一情况下，晶片110以电的方式连接到恒流源130的正极，以形成电化学池120的阳极110。铂电极可以为该池120提供阴极140。在暗处，使用5至250毫安/cm2的阳极氧化电流密度，晶片110可以被蚀刻5秒至30分钟，这取决于选择的多孔程度。在本发明的特定实施方案中，约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％的多孔度可以被选择。如本领域所知道的，形成多孔硅110所需要的阳极氧化电流密度可以部分地取决于所使用的硅基质110的类型，诸如基质110是否被轻或重p型或n型掺杂。
使用已知的芯片制造技术，纳米颗粒多孔硅基质110可以被整合入MEMS器件，MEMS器件包括各种检测仪、传感器、电极、其他电子组件、机械执行器等。这样的制造工艺可以在多孔硅基质110形成和/或用拉曼灵敏性金属进行涂覆之前和/或之后进行。
金属涂覆 如图2所示，使用已知的技术，多孔硅210可以通过阴极电迁移的方法，用金属240涂覆(Lopez and Fauchet，2000)。尽管其他金属240，诸如金或铂也可以被使用，为达到本实施例的目的，银被用于金属涂覆240。清洗多孔硅表面210，并通过Lopez和Fauchet(Appl.Phys.Lett.753989，1999)的电迁移方法，掺杂银240。多孔硅基质210被暴露于包含银阳离子230的金属离子溶液220。本领域技术人员将认识到，可以使用用于在多孔硅基质210上形成薄金属涂层240的任何已知技术。
实施例2利用热分解对多孔硅进行金属涂覆 图4图示了将金属450均匀地浸渍到纳米多孔硅内的示范性方法。多孔硅的表面被氧化成二氧化硅(图4B)。金属盐溶液被扩散到多孔基体内(图4C)，并被干燥(图4E)。干燥的金属盐在孔里面被热分解，从而形成均匀的金属层(图4F)。多孔硅表面的氧化作用使得多孔硅可以在金属盐溶液中完全被润湿，同时防止自发的浸渍涂覆，自发的浸滞涂覆将使孔封闭。干的金属盐在炉中被热分解，纯的金属被沉积在纳米孔的内壁上。可以获得纳米多孔硅的均匀的、薄薄的金属涂层，而不会堵塞孔，堵塞孔的现象在将金属渗透入纳米多孔硅的标准方法中经常被发现。现有的电镀方法也是扩散上受限的，从而形成不均匀的金属沉积，不均匀的金属沉积会降低分析物检测的可重复性，结果取决于分析物在涂覆有金属的基质中的位置。
使金属涂覆整个孔结构需要最佳的浸渍时间和高的金属离子浓度。在暴露于金属盐溶液之前，对多孔硅的表面进行氧化可以满足这些需要，氧化可以是化学氧化或可以是等离子体氧化(图4B)。氧化作用通过稳定孔的表面来防止自发的浸镀。氧化的多孔硅因此可以被浸入高浓度的金属盐溶液，而不会引起孔封闭现象(图4C)。例如通过吹氮气体，过量的金属盐溶液可以被去除(图4D)。将溶剂蒸发掉，以增加金属盐在多孔表面上的吸附(图4E)。金属被热分解(图4F)，以便拉曼活性金属在多孔硅基质的表面形成均匀的沉积。
在非限制性的实施例中，多孔硅基质通过下述方法而被形成在15％HF溶液中进行电化学蚀刻，将掺杂硼的晶体硅暴露于50mA/cm2的电流中。在Technics氧等离子体室中，采用50sccm(标准立方厘米)的氧流速和300W(瓦特)射频功率，对多孔硅基质进行等离子体氧化20分钟，从而在孔表面形成约50(埃)的二氧化硅层。可替代地，可以在piranha溶液中进行化学氧化作用(如http//www-device.eecs.Berkeley.edu/～daewon/labweek7.pdf)。二氧化硅层能钝化硅悬键(dangling bond)，从而防止快速的浸渍涂覆。
在室温下，氧化的多孔硅浸于1M的AgNO3溶液20分钟，以便用硝酸银溶液完全润湿孔。过量的硝酸银溶液通过氮枪干燥法去除，以防止由过量的银沉积造成的孔闭合。通过在100℃干燥20分钟，溶剂从剩余的硝酸银溶液中去除。在这阶段，所有的溶剂被蒸发掉，干的硝酸银盐被吸附在孔的表面上，在多孔硅的表面形成可观察到的褐色。
在环境压力炉中，在500℃，进行热分解30分钟，从而导致干的硝酸银盐热分解成为银金属。如图5所示，本文中公开的方法使得在多孔硅基质的表面形成银金属的高度均匀的沉积。图5示出了在纳米多孔硅上取得的银深度剖面，这是用Rutherford反向散射光谱分析测定而获得。将在1mM的AgNO3溶液中，用传统的扩散限制性浸镀处理2.5分钟而得到的纳米多孔硅的银深度剖面(图5A)与用本实施例的方法获得的银深度剖面(图5B)进行比较。如所看到的，相比起标准方法，本方法获得高度均匀的银沉积，并具有更大的渗透深度(图5A和图5B)。本方法产生深度达约10μm的、均匀的银沉积(图5B)，而标准方法产生深度小于约3μm的、极不均匀的银沉积(图5A)。通过使用扫描电子显微分析，对Rutherford反向散射数据进行修正，以测得多孔硅层的实际厚度。
将使用本方法所获得的银和硅的分布进行比较(图5B)，可以观察到，银沉积是均匀的，直至硅密度达到最大值的位置。也就是说，图5B的数据显示，用本方法所获得的金属沉积一直均匀延伸到多孔硅基质中孔的底部。很明显地，使用标准方法(图5A)，在到达孔底部很早之前，金属沉积便结束了。
实施例3分析物的拉曼检测 按如上所公开的方法所形成的拉曼活性金属涂覆的基质240、340可以被整合到用于分析物检测、鉴定和/或定量的装置300中，如图3所例示。基质240、340可以被整合到，例如流通池330中，其被连接于入口320和出口350通道。入口通道320可以被连接到一个或多个其他器件310，诸如样品注射器310和/或反应室310。分析物可以进入流通池330，并通过拉曼活性基质340，在那里，它们可以被拉曼检测装置360检测。检测装置360可以包括拉曼检测仪380和光源370，诸如激光器370。激光器370可以发射激发束390，激活分析物，并导致拉曼信号的发射。拉曼信号可以被检测仪380检测。在本发明的某些实施方案中，检测仪380可以被有效连接到计算机395，计算机395能处理、分析、保存和/或传输数据，该数据是关于存在于样品中的分析物的数据。
在本发明分的示范性实施方案中，激发束390由钛蓝宝石激光器370(Tsunami，Spectra-Physics)在近红外线波长处(750-950nm)，或由砷化铝镓二极管激光器370(PI-ECL系列，Process Instruments)在785nm或830nm处产生。可以使用脉冲激光束390或连续光束390。激发束390被分色镜(Kaiser Optical的全息陷波滤波器，或者，Chroma或Omega Optical的干涉滤波器)反射，与收集的光束形成共线几何关系。反射的光束390穿过显微镜物镜(Nikon LU系列)，聚焦到拉曼活性基质240、340上，该基质上带有目标分析物。来自分析物的拉曼散射光用同样的显微镜物镜收集，穿过分色镜传至拉曼检测仪380。拉曼检测仪380包括聚焦透镜、摄谱仪和阵列检测器。聚焦透镜将拉曼散射光聚焦通过摄谱仪的入口狭缝。该摄谱仪(RoperScientific)包含光栅，其按照波长将光分散。分散的光被成像在阵列检测仪(RoperScientific的Back-illuminated Deep-depletionCCD照相机)上。该阵列检测仪被连接至控制器电路，其又被连接到用于数据转移和检测仪380功能控制的计算机上160、395。
在本发明的各种实施方案中，检测装置360能够以高度的灵敏性，检测、鉴定和/或定量许多分析物，乃至单个分子的检测和/或鉴定。在本发明的某些实施方案中，分析物可以包括单个核苷酸，核苷酸可以进行拉曼标记或者不进行标记。在其他实施方案中，一个或多个寡核苷酸探针可以用或不用可识别的拉曼标记进行标记，并可以杂交到样品中的目标核酸上。通过与互补的寡核苷酸探针杂交，并使用图3的装置300进行拉曼检测，目标核酸的存在与否可以被指示出来。可替代地，使用公开的方法和装置300，感兴趣的氨基酸、肽和/或蛋白质可以被检测和/或鉴定。本领域技术人员将认识到，方法和装置300并不限制可以被检测、鉴定和/或定量的分析物的类型，相反，可以被拉曼检测进行检测的任何分析物，无论是标记的还是未标记的，都可以在要求保护的主题的范围被分析。
在本发明的某些实施方案中，一个或多个“捕获”分子可以以共价键的方式或者非共价键的方式附着到拉曼活性基质240、340上，以增加分析物的拉曼检测的灵敏性和/或特异性。例如，利用已知的技术，对选定的目标核酸具有特异性的寡核苷酸探针可以被附着到基质240、340的金属表面上(例如，寡核苷酸探针可以被共价修饰，以包含巯基部分，其可以结合到金属涂覆的基质240、340上)。可替代地，对目标蛋白质、肽或其他化合物具有特异性的抗体，可以被附着到基质240上。目标分析物的存在与否，可以通过下述方法来检测在允许与互补的核酸序列发生杂交的条件下，将附着于基质240、340的寡核苷酸暴露于样品，随后进行洗涤，然后检测结合的分析物。在本发明的替代实施方案中，在暴露于拉曼活性基质240、340之前，样品中的一种或多种分析物可以用可识别的拉曼标记进行标记，以便于结合的分析物的检测。利用抗体-抗原对、配体-受体对或任何其它已知的、显示出相互之间选择性和/或特异性结合的分析物配对，类似的方法都可以被使用。通过用各种试剂进行处理，去除结合的分析物和/或捕获分子，该基质240、340可以被回收并重复利用，所述处理方法诸如用酸、水、有机溶剂或去污剂进行洗涤、化学处理，和/或用分解酶诸如核酸外切酶和/或蛋白酶处理。
实施例4利用SERS进行若丹明6G(R6G)的检测 图6图示了将公开的方法、系统和装置用于示范性分析物，诸如若丹明6G(R6G)染料分子的检测和鉴定。R6G是已被充分表征的染料分子，其可以从标准的商业渠道获得，诸如Molecular Probes(Eugene，OR)。制备114μM的R6G溶液，使用等离子体氧化、浸蘸及分解(PODD)银涂覆的多孔硅基质，通过表面增强拉曼光谱术(SERS)进行分析，所述的等离子体氧化、浸蘸及分解(PODD)银涂覆的多孔硅基质按实施例1和2的方法制备而得。具有不同程度的平均多孔性的多孔硅基质，通过改变蚀刻条件而制备得到。R6G溶液被扩散入PODD银涂覆的基质中，使用785nm的激发波长，通过SERS进行分析，依据实施例3的方法。加入化学增强剂(氯化锂或溴化钠，浓度约1μM)，以增强拉曼信号。
在具有不同孔率的PODD银涂覆的多孔基质中获得的SERS发射光谱被显示于图6中。图6显示了114μM R6G的SERS发射光谱，按照对应的平均孔率，从最下方的曲线至最高的曲线，依次为52％、55％、65％、70％和77％。如图6所示，随着平均孔率在该范围的增加，SERS发射峰的强度增加，在77％的平均孔率时，观察到最高的强度。将孔率增加到77％以上，将使多孔硅层进入不稳定的材料范畴，这会导致多孔层从块硅(bulk silicon)基质上分离下来。在77％的孔率时，扫描电子显微术显示出宽度约32nm的孔直径(未显示)。
在77％的平均孔率时，观察到拉曼发射光谱的强度增加7个数量级(107)。这可以与在粗糙的银平板(未显示)上观察到的约6个数量级的增强程度相媲美。尽管增加的SERS发射峰强度是作为平均孔率的函数，但发射峰的波长并不改变(图6)，这使得R6G的鉴定不依赖于所使用的平均孔率。根据估计的1.25×10-16升的检测容量，检测到的若丹明6G的对应的分子数目为约9个分子。
用腺嘌呤溶液可以进行其他的研究，腺嘌呤是在生物学上更加相关的目标分子。从用银涂覆的多孔硅基质上的90μM的腺嘌呤溶液，检测到了独特的光谱特征(图7)。
实施例5核苷酸的拉曼检测方法和装置 在非限制性的实施例中，拉曼检测装置的激发束由钛蓝宝石激光器(Mira，Coherent)在近红外波长处(750-950nm)，或由砷化铝镓二极管激光器(PI-ECL系列，Process Instruments)在785nm或830nm处产生。可以使用脉冲激光束或连续光束。激发束透射过分色镜(Kaiser Optical的全息陷波滤波器，或者，Chroma或Omega Optical的干涉滤波器)，与收集的光束形成共线几何关系。发射束穿过显微镜物镜(Nikon LU系列)，聚焦到拉曼活性基质上，该基质上带有目标分析物(核苷酸或嘌呤或嘧啶碱基)。
来自分析物的拉曼散射光用同样的显微镜物镜收集，并通过分色镜传至拉曼检测仪。拉曼检测仪包括聚焦透镜、摄谱仪和阵列检测器。聚焦透镜将拉曼散射光聚焦通过摄谱仪的入口狭缝。摄谱仪(RoperScientific)包含光栅，其按照波长将光分散。分散的光被成像在阵列检测仪(RoperScientific的Back-illuminated Deep-depletion CCD照相机)上。该阵列检测仪被连接至控制器电路，其又被连接到用于数据转移和检测器功能控制的计算机上。
对于表面增强的拉曼光谱术(SERS)，拉曼活性基质由金属纳米颗粒或涂覆有金属的纳米结构组成。尺寸在5至200nm范围内的银纳米颗粒用Lee和Meisel(J.Phys.Chem.，863391，1982)的方法制备。可替代地，样品被置于显微镜物镜下的铝基质上。下面讨论的数据收集于铝基质上的固定样品。检测到的分子数目由被照射的样品的吸光总体积(optical collection volume)来确定。
使用微流态通道，单个核苷酸也可以被SERS检测到。在本发明的各种实施方案中，核苷酸可以通过微流态通道(宽在约5和200μm之间)，被转移到拉曼活性基质上。微流态通道可以通过模塑聚二甲基硅氧烷(PDMS)制得，其使用Anderson等(″Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidicsystems in PDMS by rapid prototyping，″Anal.Chem.723158-3164，2000)公开的技术。
在存在银纳米颗粒的条件下进行SERS时，核苷酸、嘌呤或嘧啶分析物可以与LiCl(最终浓度90μM)和纳米颗粒(银原子最终浓度0.25M)混合。使用室温的分析物溶液(room temperature analyte solutions)，收集SERS数据。
结果 使用上面公开的系统，核苷单磷酸、嘌呤和嘧啶通过SERS被分析。表1显示了各种感兴趣的分析物的示范性检测范围。
表1.核苷单磷酸、嘌呤和嘧啶的SERS检测
针对腺嘌呤核苷酸，优化条件。已确定LiCl(最终浓度90μM)可以提供腺嘌呤核苷酸的最佳SERS检测。通过使用其他的碱金属卤化物盐，诸如NaCl、KCl、RbCl或CsCl，可以使其他核苷酸的检测得以方便地进行。要求保护的方法不受所使用的电介质溶液的限制，可以这样理解，可以使用其他类型的电介质溶液，诸如MgCl2、CaCl2、NaF、KBr、LiI等。本领域技术人员将认识到，不显示出强拉曼信号的电介质溶液，将对核苷酸的SERS检测产生最小的干扰。结果显示，上面公开的拉曼检测系统和方法能够检测和鉴定核苷酸和嘌呤碱基的单个分子。这是第一次报道在单个核苷酸水平进行未标记核苷酸的拉曼检测。
图8显示了500nM的dATP溶液(下方的曲线)和荧光素-标记的dATP(上方的曲线)的SERS光谱。dATP-荧光素购自Roche Applied Science(Indianapolis，IN)。该图显示了因用荧光素标记而导致的SERS信号的强烈增强。
在所公开的内容的教导下，无需过度的实验，便可以制造和应用本文中所有公开和要求保护的方法和装置。很明显地，对本领域的技术人员来说，可以对本文中描述的方法和装置进行变化，而不会脱离所要求保护的主题的概念、精神和范围。更特别地，某些化学上和生理学上相关的试剂可明显地替代本文中描述的试剂，同时能获得同样的或类似的结果。所有对本领域技术人员显而易见的替代和修饰都被认为在所要求保护的主题的精神、范围和概念内。
权利要求
1.一种方法，包括a)提供被金属涂覆的多孔基质；b)将所述基质暴露于包含一种或多种分析物的样品；c)使用激光激发和光谱术，来检测和/或鉴定一种或多种分析物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述基质是多孔的半导体基质。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述基质选自纳米晶硅、单晶硅、多晶硅、非晶硅和激光退火的硅。
4.如权利要求1所述的方法，其中，金属纳米颗粒被加到所述的被金属涂覆的多孔基质。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述光谱术是拉曼光谱术。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述拉曼光谱术是表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)、超拉曼和/或相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述分析物选自氨基酸、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、嘌呤、嘧啶、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂类、激素、代谢物、细胞因子、趋化因子、受体、神经递质、抗原、过敏原、抗体、底物、辅因子、抑制剂、药剂、药物、营养物、朊病毒、毒素、毒物、炸药、杀虫剂、化学战争试剂、生物危害剂、细菌、病毒、放射性同位素、维生素、杂环芳香族化合物、致癌物质、诱变剂、麻醉剂、苯丙胺、巴比妥酸盐、致幻剂、废品和污染物。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述分析物是核苷、核苷酸、嘌呤、嘧啶、寡核苷酸、核酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白质。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述的一种或多种分析物用一种或多种拉曼标记物进行标记。
10.如权利要求9所述的方法，其中各种分析物用可区别的拉曼标记物进行标记。
11.如权利要求1所述的方法，其中，一种或多种捕获分子被附着到所述的被金属涂覆的多孔硅基质上。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述捕获分子选自寡核苷酸、核酸、抗体、抗体片段、抗原、抗原决定部位、凝集素、蛋白质、多肽、肽、受体蛋白质、配体、激素、维生素、代谢物、底物、抑制剂、辅因子、药物、适体、细胞因子和神经递质。
13.如权利要求8所述的方法，进一步包括在单分子的水平检测一个或多个核苷酸、嘌呤或嘧啶。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述核苷酸、嘌呤或嘧啶选自腺嘌呤、单磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、单磷酸脱氧腺苷、二磷酸脱氧腺苷和三磷酸脱氧腺苷。
15.一种装置，包括a)被金属涂覆的纳米晶多孔硅基质；b)激光器；和c)拉曼检测仪。
16.如权利要求15所述的装置，其中，所述的多孔硅被用作牺牲层。
17.如权利要求16所述的装置，其中，所述牺牲层被金属替代。
18.如权利要求17所述的装置，进一步包括金属纳米颗粒。
19.如权利要求15所述的装置，进一步包括可有效连接至拉曼检测仪的流通池。
20.如权利要求19所述的装置，其中流体通过在所述的流通池内的金属涂覆的纳米晶多孔硅基质。
21.如权利要求15所述的装置，其中所述的被金属涂覆的多孔硅基质包括均一的金属层。
22.如权利要求21所述的装置，其中，所述金属层的深度为至少3微米。
23.一种晶片，其包括被金属涂覆的纳米晶多孔硅层。
24.如权利要求23所述的晶片，其中，金属涂层包括银、金、铂、铜和/或铝。
25.如权利要求23所述的晶片，其中，所述的被金属涂覆的多孔硅层包括等离子体氧化的、浸蘸并分解(PODD)的多孔硅基质。
26.一种方法，包括a)提供被金属涂覆的多孔基质；b)将所述基质暴露于包含一种或多种分析物的样品；c)使用激光激发和拉曼光谱术，来检测和/或鉴定一种或多种分析物。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述的被金属涂覆的多孔硅基质包括等离子体氧化的、浸蘸并分解(PODD)的多孔硅基质。
28.如权利要求26所述的方法，其中，所述的一种或多种分析物选自核苷、核苷酸、嘌呤、嘧啶、寡核苷酸、核酸、氨基酸、肽、多肽和蛋白质。
29.如权利要求28所述的方法，进一步包括在单个分子的水平检测至少一个嘌呤、嘧啶或核苷酸。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述单个分子选自腺嘌呤、单磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、单磷酸脱氧腺苷、二磷酸脱氧腺苷和三磷酸脱氧腺苷。
全文摘要
所公开的方法和装置涉及利用金属涂覆的纳米晶多孔硅基质的拉曼光谱术。多孔硅基质可以通过在稀氢氟酸中进行阳离子蚀刻而形成。通过利用阴极电迁移或任何已知的技术，拉曼活性金属的薄层可以被涂覆到多孔硅上，所述活性金属诸如金或银。在某些方面，涂覆有金属的多孔硅基质包括等离子体氧化、浸蘸及分解的多孔硅基质。涂覆有金属的基质为SERS、SERBS、超拉曼和/或CARS拉曼光谱术提供了延展的、金属丰富的环境。在某些方面，金属纳米颗粒也可以被加到涂覆有金属的基质上，以进一步增强拉曼信号。使用本公开的方法和装置，拉曼光谱术可以被用于检测、鉴定和/或定量各种分析物。在一些被公开的方法中，拉曼光谱术可以被用于在单个分子的水平上，检测核苷酸、嘌呤或嘧啶。
文档编号G01N21/65GK1745291SQ200380109578
公开日2006年3月8日 申请日期2003年10月7日 优先权日2003年2月18日
发明者S·陈, A·伯林, S·权, N·桑达拉赞, M·山川 申请人:英特尔公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
