专利名称：一种色谱-质谱代谢组学数据分析的新方法
技术领域：
本发明涉及一种色谱-质谱代谢组学数据分析方法，属于分析化学技术领域。
背景技术：
代谢组学是系统生物学领域的新兴技术，色谱-质谱联用(如气质联用GC-MSjf质联用LC-MS等)是代谢组学研究中的主流分析技术。色谱-质谱联用仪器往往产生大量数据，如何对这些数据进行有效分析，从而获得有关研究对象的代谢轮廓特征，是目前该领域研究中的关键技术和瓶颈问题。目前，研究色谱-质谱代谢组学数据的常用策略是以保留时间Rt-质荷比m/z处的质谱碎片峰强度为变量，先对质谱碎片峰进行检测、对齐，然后将处理后的信息进行统计学分析。但是，这种数据分析策略存在下列问题(I)采用该策略，每个样品可产生多达上 千个变量(质谱碎片峰的强度)，而代谢组学研究中样品数一般为几十个，由此将导致变量数与样品数比例失衡，为后续分析带来问题；(2)该策略关注质谱峰信息，而质谱峰除包括碎片离子峰外，还包括加合峰、同位素峰等，因此上述大量变量中存在约90 %的冗余信息；而且，变量一般为在某质荷比及保留时间处记录的强度信息，以上均使得后期对差异性代谢物的定性鉴别变得复杂；(3)由于代谢组学研究中内源性代谢物的种类众多，含量不等，有时可能出现色谱峰重叠、变形等现象，从而为数据处理过程带来误差，并影响后续统计分析结果的可靠性。为克服核磁共振代谢组学分析中差异性代谢物定性鉴别困难的问题，瑞士学者提出一种新型的代谢组学数据分析方法——代谢物投影技术(MetaboliteProjection Analysis, MPA) (F. Dieterle, A. Ross, G. Schlottebeck, H. Senn. Anal.Chem. 78(2006)3551-3561)。他们首先收集多种代谢物的核磁共振波谱，然后将这些代谢物的波谱投影至由样品建立的统计分析模型，从而可对差异性代谢物直接进行定性鉴别。但是，MPA方法是针对核磁共振数据而建立的，其必要条件是得到代谢物的核磁共振波谱信息；而生物样本一般包含成百上千种代谢物，因此要收集如此多代谢产物的光谱信息是很难做到的。作为代谢组学研究中的主流分析技术，色谱-质谱数据中本身就包含了各个代谢物的质谱信息。因此，本发明对MPA方法进行了改进和扩充，建立了一种研究色谱-质谱代谢组学数据的新策略，并可有效地解决现有色谱-质谱代谢组学数据分析策略中存在的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立了一种色谱-质谱代谢组学数据分析的新方法。该方法克服了背景技术的缺点，无需像背景技术那样预先收集代谢物的波谱信息，即可简便地进行数据分析，并对特异性代谢物进行筛选和鉴定。本发明提供了一种色谱-质谱代谢组学数据分析的方法，包含以下步骤(I)代谢物峰的识别
首先从研究体系(包括正常组、模型组、给药组)的各个样品中取出相同体积(如20微升)，混合后建立质控(QC)样品；取QC样品的总离子流色谱(TIC)数据，选取其中信噪比大于3的色谱峰(记为peak_i)，采用化学计量学方法对peak_i进行纯度检测对于纯色谱峰，记录每个色谱峰的左(记为Lpeak i)、右边界(记为Rpeak i)及峰值处(记为Apeak
i)的保留时间；对于经纯度检验判定为重叠的色谱峰，采用化学计量学方法进行解析，获得重叠色谱峰中包含的纯色谱与纯质谱信息；(2)代谢物纯质谱库的建立基于QC样品的色谱-质谱数据，对于每个色谱峰peak_i，将其在Lpeak i和Rpeak i保留时间范围内的所有质谱数据进行加 和、平均，以获得可表征色谱峰peak_i对应代谢物的质谱信息；对于重叠色谱峰，采用化学计量学方法解析得到的纯质谱可直接作为表征重叠色谱峰所包含代谢物的质谱信息；将上述二部分质谱信息合并，即可得到QC样品中所包含的代谢物的纯质谱库(记为XmJ 3^里包含了研究体系中所有样品的代谢物的纯质谱信息；(3)统计分析模型的建立对于研究体系中的每个样品，将其在每个质荷比(m/z)处记录得到的色谱数据进行加和，以得到其总质谱；将所有样品的总质谱对齐，然后合并得到研究体系中各个样品的总质谱数据Xmxn，其中m为样品数，η为质谱通道数；对Xmxn进行主成分分析(PCA)或偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，建立统计分析模型，得到Xmxn的得分⑴和载荷⑵矩阵；对得分T矩阵的前二列绘图，即可观察得出研究体系中样品的分类情况；(4)代谢物投影分析按照下列公式，将XMet投影至上述统计分析模型中的载荷矩阵P，即可得到Xsfet的得分矩阵Tsfet TMet = XMetP将TMet矩阵的前二列绘图，则图上每个点表征一个代谢物，Tsfet图中远离原点的代谢物即为差异性的代谢物，且其与T矩阵前二列绘图中各组样品的方向一致；根据Tsfet图上差异性代谢物的编号，可检索Xsfet得出相应的质谱信息，最后通过检索质谱数据库即可对差异性代谢物进行定性鉴别。优选地，上述方法中用于纯度检测的化学计量学方法可独立选自直观推导式演进特征投影法、渐进因子分析、主成分分析、导数法或正交投影法。更优选地，纯度检测的化学计量学方法为直观推导式演进特征投影法。优选地，上述方法中所述的重叠色谱峰的化学计量学解析方法可独立选自直观推导式演进特征投影法、断层扫描分析法、窗口因子分析法、正交投影法或多元曲线分辨法。更优选地，重叠色谱峰的化学计量学解析方法为直观推导式演进特征投影法。本发明提供的方法具有以下积极效果I、建立了一种可对色谱-质谱代谢组学数据进行分析的新方法；2、采用本发明提出的代谢组学数据分析方法，可方便地筛选差异性代谢物并可直接进行定性鉴别；3、本发明提出的方法不仅可以有效识别现有方法发现的差异性代谢物，而且还可以发现现有方法无法发现的一些差异性代谢物。
图I为在心肌缺血大鼠血浆的代谢组学研究中，由各个样品的总质谱数据建立的PLS-DA模型中的得分图。 -心肌缺血组；■-阳性药组。图2为采用本方法得出的得分矩阵Tsfet图，每个点代表一个代谢物，下图为上图红框中部分的放大图。
具体实施例方式下面根据附图和实施例详细说明本发明的技术方案，并阐明本发明的积极效果，但是不构成对本发明的限制。实施例心肌缺血(Myocardial ischemia, Ml)大鼠血衆的代谢组学研究。动物实验SD雄性大鼠随机分为3组，每组6只A.假手术组；B. MI组；C.阳性药组。灌胃给药，A、B组给予溶媒，C组给予硝酸异山梨酯(5mg/kg/d)，连续5天。最后一天给药后建立心肌缺血模型SD大鼠麻醉后，在第三、四肋间隙，沿胸骨左缘Icm处，剪开胸壁肌肉暴露胸腔，剪开心包膜，暴露心脏，在肺动脉圆锥与左心耳下缘之间，用5-0缝合线结扎冠状动脉左前降支(假手术组省略此步骤)，立即将心脏放回，排挤出胸腔空气，用止血钳闭合胸腔，缝合伤口。术后5小时，腹腔麻醉动物后股动脉取血lmL，分离血浆备用。血浆衍生化步骤由于血浆内代谢物基本无挥发性，因此必须进行衍生化处理，方法为取大鼠血浆100 μ L，加入900 μ L甲醇，涡旋混合、超声提取后，高速离心取上清于玻璃离心管中，以氮气吹干。加入75 μ L甲氧胺吡啶溶液(15mg/mL)，涡旋混合，70°C反应lh，再加入180 μ L衍生化试剂(MSTFA TMCS = 99 I)，70°C反应lh，然后转移至离心管中，离心分离后取上清进行GC-MS分析。实验仪器采用赛默飞世尔公司生产的气相色谱-质谱联用仪(Trace UltraGC-DSQ II系统)，色谱柱TR-5MS毛细管柱(30mX O. 25mmX O. 25 μ m)，载气氦气，燃气
氢气，助燃气空气。气相色谱条件进样口温度270°C，初始温度70°C并保持lOmin，然后以10°C /min的速率升至280°C，然后保持IOmin ;质谱条件EI离子源温度为260°C，全扫描模式(50 600m/z，每秒扫描5次)，质谱定性鉴别采用NIST质谱库。将仪器提供的色谱_质谱数据转换为Excel格式以进行下面数据分析(I)代谢物峰的识别 基于本研究体系的QC样品的TIC数据，共检测得到信噪比大于3的色谱峰93个，其中5个为采用HELP方法对重叠色谱峰进行解析而得出的代谢物；对于纯色谱峰保存其Lpeak i> Rpeakj及Apeak i的保留时间，对于重叠色谱峰保存经HELP解析得出的纯质谱信息；(2)代谢物纯质谱库的建立基于QC样品的色谱-质谱数据，对于每个纯色谱峰peak_i，将其在Lpeak i和Rpeaki保留时间范围内的所有质谱数据进行加和、平均，以获得可表征色谱峰peak_i对应代谢物的质谱信息，再将该信息与HELP方法解析出的纯质谱合并，即可得到QC样品中包含的代谢物的质谱库(XmJ ;(3)统计分析模型的建立对于MI组及阳性药组的每个样品，将其在每个质荷比(m/z)处记录得到的色谱数据进行加和，以得到其总质谱。将每个样品的总质谱对齐，从而得到研究体系中各个样品的总质谱数据Xmxn，其中Π1为样品数，η为质谱通道数；对Xmxn建立PLS-DA统计分析模型，获得Xmxn的得分(T)和载荷(P)矩阵；对得分T矩阵的前二列绘图(见图I)，可见MI组及阳性药组可明显区分；(4)代谢物投影分析按照公式TMet = XMetP，将XMet投影至上述PLS-DA模型，即可得到代谢物投影得分矩阵Tsfet ;将Tsfet矩阵的前二列绘图(见图2)，图上每个点表征一个代谢物，远离原点的代谢物对样品的分类贡献较大，且其与图I中样品的方向一致；将远离原点的代谢物的质谱输入NIST库进行检索，可直接得出差异性代谢物的定性鉴别信息。表I为采用本发明提出的色谱-质谱代谢组学数据分析新方法以及目前常用的代谢组学数据分析软件一XCMS，对本研究体系进行分析后得出的差异性代谢物的比较。表I本发明提出的方法与XCMS揭示的差异性代谢物的比较*
权利要求
1.一种色谱-质谱代谢组学数据分析的方法，包含以下步骤 (1)代谢物峰的识别 首先从研究体系(包括正常组、模型组、给药组)的各个样品中取出相同体积，混合后建立质控(QC)样品；�。パ返淖芾胱恿魃�(TIC)数据，选取其中信噪比大于3的色谱峰(记为peak_i)，采用化学计量学方法对peak_i进行纯度检测对于纯色谱峰，记录每个色谱峰的左(记为Lpeak i)、右边界(记为Rpeak i)及峰值处(记为Apeak i)的保留时间；对于经纯度检验判定为重叠的色谱峰，采用化学计量学方法进行解析，获得重叠色谱峰中包含的纯色谱与纯质谱信息； (2)代谢物纯质谱库的建立 基于QC样品的色谱-质谱数据，对于每个色谱峰peak_i，将其在Lpeak」和Rpak」保留时间范围内的所有质谱数据进行加和、平均，以获得可表征色谱峰peak_i对应代谢物的质谱信息；对于重叠色谱峰，采用化学计量学方法解析得到的纯质谱可直接作为表征重叠色谱峰所包含代谢物的质谱信息；将上述二部分质谱信息合并，即可得到QC样品中所包含的代谢物的纯质谱库(记为XMrt) ;XMrt里包含了研究体系中所有样品的代谢物的纯质谱信息； (3)统计分析模型的建立 对于研究体系中的每个样品，将其在每个质荷比(m/z)处记录得到的色谱数据进行加和，以得到其总质谱；将所有样品的总质谱对齐，然后合并得到研究体系中各个样品的总质谱数据Xmxn，其中m为样品数，η为质谱通道数StXmxn进行主成分分析(PCA)或偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，建立统计分析模型，得到Xmxn的得分⑴和载荷⑵矩阵； (4)代谢物投影分析 按照下列公式，将Xsfet投影至上述统计分析模型中的载荷矩阵P，即可得到Xsfet的得分矩阵Tsfet ^Met ^MetP 将Tsfet矩阵的前二列绘图，则图上每个点表征一个代谢物，Tsfet图中远离原点的代谢物即为差异性的代谢物；根据Tsfet图上差异性代谢物的编号，可检索Xsfet得出相应的质谱信息，最后通过检索质谱数据库即可对差异性代谢物进行定性鉴别。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的用于纯度检测的化学计量学方法可独立选自直观推导式演进特征投影法、渐进因子分析、主成分分析、导数法或正交投影法。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的重叠色谱峰的化学计量学解析方法可独立选自直观推导式演进特征投影法、断层扫描分析法、窗口因子分析法、正交投影法或多元曲线分辨法。
全文摘要
本发明为一种色谱-质谱代谢组学数据分析的新方法，属于分析化学技术领域。该方法基于色谱-质谱数据特征，通过建立代谢物的质谱库XMet，然后将XMet投影至由研究体系中各个样品建立的统计分析模型，从而可得到代谢物投影得分矩阵TMet，将TMet的前二列绘图即可得出差异性的代谢物，并通过检索XMet及质谱数据库即可对差异性代谢物进行定性鉴别。该方法在原有方法的基础上，建立了一种可对色谱-质谱代谢数据进行分析的新方法，从而可方便地筛选差异性代谢物并可直接进行定性鉴别，从而有效地解决现有色谱-质谱代谢组学数据分析策略中存在的问题。
文档编号G01N30/02GK102788849SQ20121017910
公开日2012年11月21日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者亓云鹏, 吴玉田, 宋云龙, 柴逸峰, 范国荣 申请人:中国人民解放军第二军医大学
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