专利名称：一种基于导电聚合物的牙周细菌阻抗免疫传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种牙周细菌的定量检测装置，具体涉及ー种灵敏度高、检测范围广、响应时间短、抗干扰性强，且エ艺简单、成本低的，具有导电聚合物修饰电极的牙周细菌阻抗免疫传感器。
背景技术：
牙周炎是世界范围内的多发病、常见�。皇澜缥郎橹形：θ死嘟】档牡谌罄嗦苑谴拘约膊。现匚：Ε砬缓腿斫】担切难芗膊�、糖尿病等全身性疾病的重要危险因素，近来研究更是发现牙周炎可显著增加某些癌症的发病率。目前，我国成人组牙周病的发病率高达80%以上，中年以上为好发人群，人口老龄化的增加更进ー步加重了患者和卫生系统的医疗负担，因此及时监控和防治牙周炎已成为公共卫生系统和人民大众及其关注和急需解决的健康问题。牙周炎病因复杂，文献报道遗传因素、免疫因素等均与牙周炎发病关系密切，但是细菌因素始终是引起牙周炎的始动因素，是造成牙周破坏的必需因素。患牙局部牙周优势菌的数量变化是评价病情的重要指标。另外，目前临床在牙周炎的药物辅助治疗过程中，不同个体的常规用药基本相同，而患者对药物治疗的疗效不同则从一定程度上侧面反映了针对性用药的临床价值，及时了解牙周患部的优势菌定植情况，对临床药物辅助治疗牙周炎也具有重要指导意义。但目前牙周细菌检测并没有成为牙周常规检查的一部分，很大原因是因为目前适于临床椅旁细菌检测的技术和手段发展相对滞后。传统用于牙周细菌定量检测的手段主要是细菌培养和定量PCR技术，存在检测条件苛刻、检测周期长、成本高、临床椅旁检测使用不便等缺陷。尽管我们近期基于细菌细胞的电学性质，结合免疫磁分离技术，建立了基于液体电极微流芯片的牙周细菌电化学测菌法，实现了牙周主要致病菌牙龈卟啉单胞菌的快速无标记电阻抗定量分析，但是检测系统的灵敏度、稳定性、便携性、抗干扰性、可抛性仍需要进ー步改进。随着微纳米加工、新材料和新器件技术的发展进步，基于导电聚合物微纳米结构的高性能生物传感器的研发为实现椅旁牙周多菌种同步快速检测提供了新的机遇和途径。目前国内外尚未见利用牙周细菌细胞的电学性质，基于导电聚合物的用于牙周细菌直接量化的生物传感器报道。
发明内容
本发明的目的是针对目前牙周细菌椅旁检测技术上的局限，提供一种灵敏度高、检测范围广、响应时间短、抗干扰性强，且エ艺简单、成本低的，易于批量制备和向可抛弃型終端产品转化的，具有导电聚合物修饰电极的牙周细菌阻抗免疫传感器。本发明提供的ー种牙周细菌阻抗免疫传感器，包括设于固相基底上的工作微电扱，与所述固相基底共价键合在一起的微流芯片通道，所述微流芯片通道设于所述工作微电极上；所述微流芯片通道的两端分别设有进样口和出样ロ ；所述工作微电极通过导线与电化学工作站相连接；所述工作微电极的表面上沉积有导电聚合物，所述导电聚合物上修饰有牙周细菌特异性抗体。上述的阻抗免疫传感器中，所述固相基底可为氧化硅基片、玻璃或柔性基底。上述的阻抗免疫传感器中，所述工作微电极可为金电极或钼电极。上述的阻抗免疫传感器中，所述工作微电极可为叉指电极，所述叉指电极可包括10对 15对分支电极，所述分支电极之间的间隔可为20 μ πΓ50 μ m ;所述分支电极的宽度可为 50 μ m 100 μ m。上述的阻抗免疫传感器中，所述微流芯片通道的材质可为聚ニ甲基硅氧烷(polydimethylsilicone, PDMS)。 上述的阻抗免疫传感器中，所述特异性抗体为牙周细菌菌体表面蛋白抗体，本发明可通过更换所述导电聚合物层上的生物分子识别元件一特异性抗体，即可用于多种生物分子的检测。本发明提供的工作微电极表面上沉积的导电聚合物层，可通过无模板电化学法在所述工作微电极上得到；导电聚合物层上的牙周细菌特异抗体，可通过化学交联法在所述导电聚合物层上固定。本发明还提供上述的牙周细菌阻抗免疫传感器在牙周细菌量化中的应用。本发明由于采取以上技术方案，具有以下优点1、样本检测在微纳米空间中进行，消耗微量试剂和样品，降低了成本；2、工作微电极表面修饰导电聚合物膜或者纳米线阵列，增加单位面积抗体固定数量和检测比表面积，从而大大提高传感器的灵敏度、抗干扰性以及响应时间；3、エ艺简单，通过更换所述导电聚合物层上的生物分子识别元件ー特异性抗体，即可用于多种生物分子的检测；4、所需微纳米加工技术和生物技术成熟，易于批量制备和向可抛弃型终端产品转化。
图I是根据本发明的免疫传感器结构示意图。图2是根据本发明循环伏安法制备聚吡咯的循环伏安曲线。图3是根据本发明循环伏安法聚合的聚吡咯的扫描电镜照片。图中各标记如下1氧化硅基片、2叉指电极、3微流芯片通道、4进样ロ、5出样ロ、6导线、7电化学工作站。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进ー步说明，但本发明并不局限于以下实施例。本发明提供的牙周细菌阻抗免疫传感器包括设于氧化硅基片I上的叉指电极2和与该氧化硅基片I共价键合在一起的微流芯片通道3，且该微流芯片通道3设于叉指电极2之上，该叉指电极2为由厚度为IOnm的钛金属层和厚度为80nm金层沉积在一体的电极(可使该电极更牢固地固定在氧化硅基片I上)，其包括15对分支电极，分支电极之间的间隔为 50 μ m，其宽度为100 μ m，该叉指电极2可采用标准的光刻技术进行制备首先通过在氧化硅基片I上甩胶、前供、曝光和显影的步骤得到做好电极图形的硅片；接着在做好图形的硅片上先后通过热蒸镀法制备钛和金的薄层；最后用丙酮溶液将光刻胶去除后即可；该微流芯片通道3的材质为聚ニ甲基硅氧烷，其高度为50 μ m ;该微流芯片通道3的两端分别设有进样ロ 4和出样ロ 5 ;叉指电极2通过导线6与电化学工作站7相连接；叉指电极2的表面上沉积有聚吡咯层，该聚吡咯层上修饰有特异性抗体。上述的免疫传感器中，组成叉指电极2的分支电极可为10对 15对，分支电极之间的间距可在20 μ πΓ50 μ m之间的范围内进行调整，其宽度可在50 μ πΓ ΟΟ μ m之间的范围内进行调整。上述免疫传感器中的聚卩比咯层可通过循环伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)进行制备，实验采取三电极体系，工作电极为叉指电极2中的ー侧叉指，以另ー侧叉指作为对电扱，參比电极可为自制的Ag/AgCl准參比电极(制作方法如下取一段粗银丝，经过物理打磨去除表面的氧化层，然后分别放置于丙酮、こ醇和去离子水中超声清洗各5分钟，氮气吹干后备用；用浓盐酸与去离子水按I :1的体积比混合配置电解液，将清洗干净的银丝作为工作电极，钼片或不锈钢片为对电极，在I. 4V的恒定电压下反应10分钟，最后获得表面均 一、褐红色的Ag/AgCl准參比电极)，实验中使用的电解液成分是O. 04M的樟脑磺酸，O. 2M的吡咯，2. OM的pH=6. 86的磷酸盐缓冲溶液；实验中设定循环伏安的扫描范围为-O. I疒I. 2V(vs. Ag/AgCl)，扫描速率为20mA/s，循环次数为5次；从图3所示的循环伏安图中可以得到这个体系的聚合參数如下吡咯单体的氧化峰出现在O. 9V，吡咯的聚合电流密度为ImA/cm2;吡咯单体的氧化进行得很快，基本上第一圈循环就可以在电极表面看到黒色的聚吡咯；由于已经有聚吡咯覆盖了工作电极导致电极表面电导率下降，所以在扫描第二个循环时氧化电位处的电流要远小于第一个循环的电流。上述免疫传感器中的抗体固定采用EDC(I-(3-ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺盐)-NHS (N—羟基琥珀酰亚胺)化学交联法固定抗体。首先抗体固定液(包括2毫克/毫升抗体，60毫摩尔EDC、2毫克/毫升NHS)经进样ロ 4注入微流芯片通道3内，和聚吡咯室温共孵育3个小时，然后用磷酸缓冲液(pH 7.2)冲洗去除多余抗体固定液；然后用牛血清白蛋白溶液(1Μ，ρΗ 7. 2)封闭非特异性位点；最后用磷酸缓冲液(pH 7. 2)冲洗去除多余牛血清白蛋白。下面以牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌检测为例，利用上述阻抗免疫传感器进行细菌检测包括以下步骤①在微流芯片通道3中注入待检测的样本，样本溶液经进样ロ 4注入微流芯片通道3内，室温孵育30分钟，使得样本中的靶细菌充分被叉指电极2表面修饰的特异性抗体捕获；②将去离子水注入微流芯片通道3内，目的为冲洗去除未与抗体结合的多余样本；③通过导线6连接叉指电极2与电化学工作站7，通过给叉指电极2施加ー个特定频率的交流电压并记录系统反馈回的交流电流以及相位差，从而获得系统的阻抗值，读取电化学工作站7中显示的阻抗数据，记录測量出的牙龈卟啉单胞菌溶液的阻抗值；④根据获得的牙龈卟啉单胞菌标准菌株浓度-阻抗标准曲线，推算出实际临床样本中牙龈卟啉单胞菌的浓度。
权利要求
1.一种基于导电聚合物的牙周细菌阻抗免疫传感器，其特征在于所述免疫传感器包括设于固相基底上的工作微电极与所述固相基底共价键合在一起的微流芯片通道，所述微流芯片通道设于所述工作微电极上；所述微流芯片通道的两端分别设有进样口和出样口 ；所述工作微电极通过导线与电化学工作站相连接； 所述工作微电极的表面上沉积有聚吡咯，所述聚吡咯上修饰有特异性抗体。
2.根据权利要求I所述的免疫传感器，其特征在于所述固相基底为氧化硅基片、玻璃或柔性基底。
3.根据权利要求I或2所述的免疫传感器，其特征在于所述工作微电极为金电极或钼电极。
4.根据权利要求1-3中任一所述的免疫传感器，其特征在于所述工作微电极为叉指电极。
5.根据权利要求4所述的免疫传感器，其特征在于所述叉指电极包括10对 15对分支电极，所述分支电极之间的间隔为20 μ πΓ50 μ m ;所述分支电极的宽度为50 μ πΓ ΟΟ μ m。
6.根据权利要求1-5所述的免疫传感器，其特征在于所述微流芯片通道的材质为聚二甲基硅氧烷。
7.根据权利要求1-6中任一所述的免疫传感器，其特征在于所述特异性抗体为牙周细菌菌体表面蛋白抗体。
全文摘要
本发明公开了一种基于导电聚合物修饰电极的牙周细菌阻抗免疫传感器。所述免疫传感器包括设于固相基底上的工作微电极与所述固相基底共价键合在一起的微流芯片通道，所述微流芯片通道设于所述工作微电极上；所述微流芯片通道的两端分别设有进样口和出样口；所述工作微电极通过导线与电化学工作站相连接；所述工作微电极的表面上沉积有聚吡咯，所述聚吡咯上修饰有特异性抗体。本发明提供的牙周细菌阻抗免疫传感器的优点在于1、样本检测在微纳米空间中进行，消耗微量试剂和样品，降低了成本；2、工作微电极表面修饰导电聚合物膜或者纳米线阵列，增加单位面积抗体固定数量和检测比表面积，从而大大提高传感器的灵敏度、抗干扰性以及响应时间。
文档编号G01N33/569GK102680683SQ201210173858
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者全保刚, 史亮, 施生根, 汤楚华, 牛忠英, 裴振华 申请人:中国人民解放军第306医院
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