专利名称：红细胞免疫体外中药药敏实验方法
技术领域：
本发明涉及红细胞免疫功能检测技术，具体涉及一种利用红细胞免疫功能 检测方法进行药敏实验的方法，本发明首次利用红细胞免疫功能进行体外中药 药敏实验。
技术背景自1658年红细胞被发现后， 一直认为其是氧气和二氧化碳的运输者。随着 科技的进步，人们逐渐认识到了红细胞的更多功能。1981年，美国生殖免疫学 家Siegel在前人研究的基础上，首先提出了 "红细胞免疫系统"的新概念，更 新了人们对红细胞功能的认识。随着天然免疫研究的升温，1990年，Paccaud 对红细胞膜补体受体进行了比较研究，发现了其簇状分布的结合位点。2004年 郭峰提出"红细胞天然免疫主干道理论"，认为抗原进入血液中，首先被补体系 统识别，抗原旁路激活补体黏附补体成份，然后绝大部分附有补体成份的抗原 被红细胞天然免疫黏附，最终由红细胞递交给白细胞，引发白细胞产生一系列 免疫反应。当今，红细胞免疫已成为多学科研究的桥梁与工具。红细胞数目众多，其免疫功能是其他免疫细胞所无法替代的。红细胞免疫 的基础是红细胞表面具有C3b受体(C3bR)，红细胞膜上的C3bR具有免疫黏附、携带及清除循环液相中抗原异物的功能，尤其清除循环免疫复合物(CIC)是红细 胞最主要的免疫功能。通过C3bR与C3b调理过的CIC结合，将其运送到肝脾等网 状内皮系统加以清除，防止CIC在体内沉积，从而避免血管或组织的损伤。而这 种免疫能力主要取决于红细胞膜上的C3bR数量，因此，红细胞C3bR是衡量红细 胞免疫功能状态的主要指标，在运送和清除免疫复合物(ic)方面起着重要作 用。现已建立的各种红细胞免疫功能检测方法多以红细胞表面的C3bR为基础设 计，主要有红细胞C3bR花环及IC花环试验、红细胞SPA酵母混合花环试验、单克隆抗体Coombs试验、抗C3bR单克隆抗体法、ELISA、放射配体结合法、红细胞促 吞噬作用测定法等。其中红细胞C3bR花环率和IC花环率可作为红细胞免疫黏附 功能的指标，如二项指标都低下，判为原发性细胞免疫功能低下，为红细胞C3bR 受到破坏和影响所致；如果红细胞C3bR花环率低，而IC花环率高，为继发性红 细胞免疫功能低下，是由于CIC增加，红细胞黏附IC过多引起。中国人民解放军第二军医大学第一附属医院郭峰等人根据Siegel的红细胞 免疫黏附试验原理，建立了简易的红细胞C3bR花环试验与红细胞IC花环试验 (郭峰改良法)。该试验方法釆用致敏和未致敏的酵母菌试剂作为红细胞免疫功 能检测试剂，C3b致敏酵母菌试剂用于红细胞C3bR花环试验，未致敏酵母菌试 剂用于红细胞IC花环试验。郭峰改良法检测红细胞免疫黏附功能简单易行，检 测结果可靠，成为了目前开展红细胞免疫黏附功能检测的主要方法。红细胞免疫是当今医学研究的一个新领域，各国学者都在致力于探索并努 力将研究成果应用于临床诊断，而对于红细胞免疫功能检测方法的运用则是其 中的一个重要课题，将有助于人类确诊和检测生理性、病理性疾病的起因、演 化，并获取治疗效果的监测数据。将红细胞免疫功能检测方法应用于体外中药药敏实验，并对其免疫学原理 进行研究，目前尚未见有报道。 发明内容本发明的目的是为中医临床用药及治疗机理研究提供一种安全、简便、客 观有效的体外药敏实验方法，以避免中药应用的主观性和随意性。本发明的红细胞免疫体外中药药敏实验方法是采用红细胞免疫酵母菌花环 试验为基�。幸┮┪镒魑稍ひ蛩兀直鸲约尤胫幸┑囊┪锔稍ぷ�、无干 预的空白对照组、生理盐水干预的实验对照组的红细胞免疫指标RBC-C3bRR进 行检测，据检测结果确定该中药的敏感程度。如果该中药对红细胞RBC-C3bRR 发生正向调节，表现为RBC-C3bRR升高，则判属为敏感有效药物；如果发生负向调节或不发生调节作用，为不敏感或无效药物。本发明的实验方法对中医辨 证施治可起到体外以药测证的作用，将中医辨证施治客观指标化。本发明的红细胞免疫体外中药药敏实验的具体方法为 无干预的空白对照组1) 、取动物肝素抗凝血，离心分离，提取血浆备用，将红细胞配制成 1. 25xl07/mL的细胞悬液；2) 、将酵母菌配制成1. OxlOVmL的酵母菌溶液；3) 、取等体积的细胞悬液、血浆和酵母菌溶液一起混匀，37。C水洛30min 后，0.25%戊二醛溶液固定，涂片，干燥，甲醛固定，姬姆萨氏染色液染色，显 微镜下计数100个红细胞，以黏附有二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花 环，计算出红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。加入中药的药物干预组1) 、取动物肝素抗凝血，离心分离，提取血浆备用，将红细胞配制成 1. 25xl07mL的细胞悬液；2) 、将酵母菌配制成l. OxlOVmL的酵母菌溶液；3) 、取等体积的细胞悬液、血浆、酵母菌溶液和对血红细胞形态不发生影 响的最佳敏感浓度的中药注射液一起混匀，37。C水洛30min后，0. 25%戊二醛溶 液固定，涂片，干燥，甲醛固定，姬姆萨氏染色液染色，显微镜下计数100个 红细胞，以黏附有二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环，计算出红细胞 C3bR花环率RBC-C3bRR。生理盐水干预的实验对照组方法同加入中药的药物干预组，只是将中药注射液替换为等体积的生理盐 水即可。根据免疫学原理，中药制剂属多糖制剂，具有抗原性又称兔疫原性，可直 接作用于血细胞与血浆，引发免疫过程，激活补体，成为携带有红细胞补体大片段(C3b)的致敏外源性抗原(Ag-C3b分子)。红细胞膜上具有C3bR (免疫黏 附受体或I型补体受体CR1),能够与Ag-C3b分子中的C3b相结合，对红细胞膜 直接发生调节作用。如果发生正向调节，则增强了红细胞膜的免疫功能(C3bR-免疫黏附受体的黏附作用增强)，红细胞对血液循环中的CIC黏附作用增强，表 现为随后对酵母菌进行黏附形成花环的花环率增高，为敏感有效药物(酵母菌 经煮沸后暴露的表面多糖能激活补体，吸附C3b成为致敏的酵母菌。在二者比 例合适的条件下，红细胞可通过膜表面的C3bR黏附C3b致敏的酵母菌形成花 环)。而如果发生负向调节或不发生调节作用，则表现为对酵母菌进行黏附形成 花环的花环率降低或不变，为不敏感或无效药物。本发明的红细胞免疫体外中药药敏实验方法的运用，避免了中药应用的主 观性和随意性，将促进中药临床研究的现代化。 本发明实验方法的优势还在于1、 自身血浆较异体血浆更容易获得，绝无异体血液成份干扰。且血浆即取 即用，补体无失活。无需致敏酵母菌试剂的制备，检测结果更加准确可靠，容 易判断，易于普及推广。2、 本发明使用的细胞悬液是提取血浆后的全血细胞配制成的红细胞计数为 1."xlOVmL的全血细胞悬液，更加真实地反应了体内环境的情况，使检测结 果更加真实可靠。
具体实施方式
实施例11、细胞悬液的配制取观察对象空腹静脉血l 2mL，肝素抗凝，与生理盐水平衡后，2500r/min 离心分离5min,提取血浆加入一支试管中，并作标记备用。将约4mL生理盐水注入另一支试管，于分离后的全血细胞'中间层提取10uL 全血细胞，加入生理盐水试管中，吹打均勾，镜下计数红细胞，配制成红细胞计数为1. 25xl07/mL的全血细胞悬液，并作标记备用。
2、 酵母菌溶液的配制
1. OxlOVmL的酵母菌溶液由上海第二军医大学长海医院血液免疫研究室提供。
将冷冻的酵母菌溶液剪开，常温解冻，吹打至均匀即可使用。
3、 无干预的空白对照组
取上述细胞悬液、酵母菌溶液、血浆各50uL加入1支试管中，3rC水洛Mmin 后，添加O. 25。/。戊二醛溶液50uL、生理盐水50uL作涂片、吹干或凉干后以甲醛 固定，姬姆萨氏染色液染色，显微镜下计数100个红细胞，以黏附二个或以上 酵母菌的红细胞为l个阳性花环，计算出无干预的空白对照组的红细胞C3bR花 环率RBC-C3bRR (CR1 )。
4、 加入中药的药物干预组
取上述细胞悬液、酵母菌溶液、血浆各50uL加入l支试管中，再加入50uL 对血红细胞形态不发生影响的最佳敏感浓度的中药注射液一起混匀，37'C水浴 30min后，添加0. 25%戊二醛溶液50uL、生理盐水50uL作涂片、吹干或凉干后 以甲醛固定，姬姆萨氏染色液染色，显微镜下计数100个红细胞，以黏附二个 或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环，计算出加入中药的药物干预组的红细 胞C3bR花环率RBC-C3bRR。
5、 生理盐水干预的实验对照组
步骤同加入中药的药物干预组，只是将50uL中药注射液替换为50uL生理 盐水。计算出生理盐水干预的实验对照组的红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。
6、 结果判断
以无干预的空白对照组红细胞C3bR花环率为基数进行比较，如果加入中药 的药物干预组红细胞C3bR花环率明显升高，则表示该药物为有效敏感药物，如 果加入中药的药物干预组红细胞C3bR花环率不发生变化或降低，则表示该药物为不敏感或无效药物。 实施例2
对于脑梗死病例，西医一般是按照其梗死部位、面积和责任血管进行分型 的。而中医却采用辨证分型， 一般分为气虛血瘀证、痰浊血瘀证、气阴两虛证
等。辨证分型不同，其治则与用药则不同。 一般地
气虛血瘀证，治宜益气活血，药用黄芪注射液+丹参注射液； 痰浊血瘀证，治宜化痰逐瘀，醒脑开窍，药用复方麝香注射液； 气阴两虛证，治宜益气养阴，活血化瘀，药用生脉注射液。 然而中医辨证的主观因素较多，往往很难准确地辩证施治。 根椐免疫学原理，以中药多糖对红细胞免疫酵母菌花环率影响的变化作为
中医辨证的客观指标，则可以起到"以药测证"的作用。 无干预的空白对照组
取肝素抗凝血2mL， 2500r/m离心5min,提取血浆备用；将红细胞配制成 1.25xl0VmL的细胞悬液。
取细胞悬液(1. 25 x 107mL )、酵母菌溶液(1. 0 x 10VmL )、血浆各50uL加 入1支试管中，37'C水洛30min后，添加0. 25°/。戊二醛溶液50uL、生理盐水50uL 作涂片，吹干或凉干后甲酸固定、染色，显微镜下计数100个红细胞，以黏附 二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环，计算出无干预的空白对照组的红 细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。
黄芪注射液+丹参注射液的药物干预组
取肝素抗凝血2mL， 2500r/m离心5min，提取血浆备用；将红细胞配制成 1.25xl07mL的细胞悬液。
取细胞悬液(1. 25 x lOVmL )、酵母菌溶液(1. 0 x 10VmL )、血浆各50uL加 入1支试管中，再加入由黄芪注射液、丹参注射液与等量生理盐水配制成的对 血红细胞形态不发生影响的最佳敏感浓度的中药注射液50uL, 37。C水浴30min后，添加0.25y。戊二醛溶液50uL、生理盐水50uL作涂片，吹干或凉干后甲醛固 定、染色，显微镜下计数100个红细胞，以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1 个阳性花环，计算出黄芪注射液+丹参注射液药物干预组的红细胞C3bR花环率 RBC-C3bRR。
复方麝香注射液药物干预组
取肝素抗凝血2mL, 2500r/m离心5min，提取血浆备用；将红细胞配制成 1. 25 x 107mL的细胞悬液。
取细胞悬液(1. 25 x 107/mL )、酵母菌溶液(1. 0 x 10VmL )、血浆各50uL加
入1支试管中，再加入由复方麝香注射液与等量生理盐水配制成的对血红细胞 形态不发生影响的最佳敏感浓度的中药注射液50uL， 37'C水浴30min后，添加 0.25%戊二醛溶液50uL、生理盐水50uL作涂片，吹干或凉干后以甲醛固定、染 色，显微镜下计数100个红细胞，以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳 性花环，计算出复方麝香注射液药物干预组的红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。 生脉注射液药物干预组
取肝素抗凝血2mL, 2500r/m离心5min，提取血浆备用；将红细胞配制成 1.25xl0VmL的细胞悬液。
取细胞悬液(1.25xl0VmL)、酵母菌溶液(1. OxlOVmL)、血浆各50uL加 入1支试管中，再加入由生脉注射液与等量生理盐水配制成的对血红细胞形态 不发生影响的最佳敏感浓度的中药注射液50uL， 37。C水洛30min后，添加0. 25% 戊二醛溶液50uL、生理盐水50uL作涂片，吹干或凉干后，甲醛固定、染色，在 显微镜下计数100个红细胞，以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花 环，计算出生脉注射液药物干预组的红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。
生理盐水干预的实验对照组
在药物干预组实验的基础上，将中药注射液替换为50uL生理盐水即可。计 算出生理盐水干预的实验对照组的红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。以无干预的空白对照组的红细胞C3bR花环率为基数，对各药物干预组的红 细胞C3bR花环率进行比较，花环率升高最明显的药物为有效敏感药物。同时还 可以以药测证，由此确立出此脑梗死患者属于中医何种证型。
实施例3
对于喘证患者，西医一般分为肺源性与心源性。而中医却是辨证分型，分 为肺气虛证、痰热阻肺证、水凌心肺证等。辨证分型不同，其治则与用药则不 同。
肺气虛证，治宜益气平喘，药用黄芪注射液；
痰热阻肺证，治宜清肺化痰，药用痰热清注射液；
水凌心肺证，治宜温阳利水，药用参附注射液。
然而中医辨证的主观因素较多，往往很难准确地辩证施治。
根椐免疫学原理，以中药多糖对红细胞免疫酵母菌花环率影响的变化作为 中医辨证的客观指标，则可以起到"以药测证"的作用。
可以将喘证的证型与治疗药物对应列出，并进行红细胞免疫花环试验，以 药测证，从而确立有效的治疗药物。
无干预的空白对照组
取肝素抗凝血2mL， 2500r/m离心5min，提取血浆备用；将红细胞配制成 1.25xl0VmL的细胞悬液。
取细胞悬液(1. 25 x 107mL )、酵母菌溶液(L 0 x l08/mL )、血浆各50uL加 入1支试管中，37。C水浴30min后，添加0. 25%戊二醛溶液50uL、生理盐水50uL 作涂片，吹干或凉干后甲醛固定、染色，显微镜下计数100个红细胞，以黏附 二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环，计算出无干预的空白对照组的红 细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。
黄芪注射液的药物干预组
取肝素抗凝血2mL, 2500r/m离心5tnin，提取血浆备用；将红细胞配制成1. 25 x 107mL的细胞悬液。
取细胞悬液U.25xl0VmL)、酵母菌溶液(1. OxioVmL)、血浆各50uL加
入1支试管中，再加入由黄芪注射液与等量生理盐水配制成的对血红细胞形态 不发生影响的最佳敏感浓度的中药注射液50uL, 37'C水浴30min后，添加Q. 25%
戊二醛溶液50uL、生理盐水50uL作涂片，吹干或凉干后甲醛固定、染色，显微
镜下计数100个红细胞，黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环，计 算出黄芪注射液药物干预组的红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。
痰热清注射液药物干预组
取肝素抗凝血2mL， 2500r/m离心5min，提取血浆备用；将红细胞配制成 1. 25 x 10VmL的细胞悬液。
取细胞悬液(1. 25 x 10VmL )、酵母菌溶液(1. 0 x io8/mL )、血浆各50uL加
入1支试管中，再加入由痰热清注射液与等量生理盐水配制成的对血红细胞形 态不发生影响的最佳敏感浓度的中药注射液50uL， 37匸水浴30min后，添加
0. 25%戊二醛溶液50uL、生理盐水50uL作涂片，吹干或凉干后以甲醛固定、染 色，显微镜下计数100个红细胞，以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳 性花环，计算出痰热清注射液药物干预组的红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。
参附注射液药物干预组
取肝素抗凝血2mL, 2500r/m离心5min,提取血浆备用；将红细胞配制成
1. 25 x 10VmL的细胞悬液。
取细胞悬液(1. 25 x l07/mL )、酵母菌溶液(1. 0 x ioVmL )、血浆各50uL加
入1支试管中，再加入由参附注射液与等量生理盐水配制成的对血红细胞形态 不发生影响的最佳敏感浓度的中药注射液50uL, 37'C水洛30min后，添加0. 25% 戊二醛溶液50uL、生理盐水50uL作涂片，吹干或凉干后，甲醛固定、染色，在 显微镜下计数100个红细胞，以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花 环，计算出参附注射液药物干预组的红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。生理盐水干预的实验对照组
在药物干预组实验的基础上，将中药注射液替换为50uL生理盐水即可。计 算出生理盐水干预的实验对照组的红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。
以无干预的空白对照组的红细胞C3bR花环率为基数，对各药物干预组的红 细胞C3bR花环率进行比较，花环率升高最明显的药物为有效敏感药物。同时还 可以以药测证，由此确立出此喘证患者属于中医何种证型。
权利要求
1、红细胞免疫体外中药药敏实验方法，是采用红细胞免疫酵母菌花环试验为基�。幸┮┪镒魑稍ひ蛩兀直鸲约尤胫幸┑囊┪锔稍ぷ�、无干预的空白对照组、生理盐水干预的实验对照组的红细胞免疫指标RBC-C3bRR进行检测，据检测结果确定该中药的敏感程度。
2、 根据权利要求l所述的红细胞免疫体外中药药敏实验方法，其特征是该 方法具体为1) 、无干预的空白对照组取动物肝素抗凝血，离心分离，提取血浆备用，将红细胞配制成1. 25xl07/mL 的细胞悬液；将酵母菌配制成1. 0xl0VmL的酵母菌溶液；取等体积的细胞悬液、血浆和酵母菌溶液一起混匀，37。C水洛30min后， 0.25%戊二醛溶液固定，涂片，干燥，甲醛固定，姬姆萨氏染色液染色，显微镜 下计数100个红细胞，以黏附有二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环， 计算出红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR;2) 、加入中药的药物干预组取等体积的细胞悬液、血浆、酵母菌溶液和对血红细胞形态不发生影响的 最佳敏感浓度的中药注射液一起混匀，37"C水洛30min后，0. 25°/ 戊二醛溶液固 定，涂片，干燥，甲醛固定，姬姆萨氏染色液染色，显微镜下计数100个红细 胞，以黏附有二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环，计算出红细胞C3bR 花环率RBC-C3bRR;3) 、生理盐水干预的实验对照组方法同加入中药的药物干预组，只是将中药注射液替换为等体积的生理盐水。
3、 根据权利要求l所述的红细胞免疫体外中药药敏实验方法，其特征是如 果该中药对红细胞RBC-C3bRR发生正向调节，表现为RBC-C3bRR升高，则为敏感有效药物；如果发生负向调节或不发生调节作用，则为不敏感或无效药物。
全文摘要
红细胞免疫体外中药药敏实验方法，采用红细胞免疫酵母菌花环试验为基�。幸┮┪镒魑稍ひ蛩兀直鸲约尤胫幸┑囊┪锔稍ぷ椤⑽薷稍さ目瞻锥哉兆�、生理盐水干预的实验对照组的红细胞免疫指标RBC-C3bRR进行检测，据检测结果确定该中药的敏感程度。如果该中药对RBC-C3bRR发生正向调节，则为敏感有效药物；发生负向调节或不发生调节作用为不敏感或无效药物。本发明的实验方法对中医辨证施治可起到体外以药测证的作用，将中医辨证施治客观指标化，避免了中药应用的主观性和随意性。
文档编号G01N33/554GK101294960SQ20081005524
公开日2008年10月29日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者常国良 申请人:常国良
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
