专利名称：日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子、细胞生物学研究领域，具体涉及日本血吸虫含鞘脂激活蛋白B结构域蛋白(SjSap)的重组抗原蛋白及其制备方法。此外，本发明还涉及该日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白在检测日本血吸虫病人血清抗体中的应用。
背景技术：
血吸虫病(Schistosomiasis)是由血吸虫(Schistosoma)感染所引起的一种寄生虫�。惴悍植加诜侵�、中东、南美和东南亚的76个国家和地区。全球至少有2.4亿人受感染，7亿人受威胁，严重影响着人类的健康并阻碍流行区社会经济的发展。血吸虫病至今仍然是世界范围内的主要公共卫生问题之一；疫情严重的地区主要分布在非洲撒哈拉以南的国家,血吸虫感染的人数占全球总数的85%以上。全球每年死于血吸虫病的人数达28万。血吸虫也称为裂体吸虫或住血吸虫，隶属于吸虫纲、复殖目、裂体科、裂体属。寄生于人体的血吸虫主要有6种，分别为曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫(S.japonicum)、埃及血吸虫(S.haematobium)、马来血吸虫(S.malayensis)、间插血吸虫(S.1ntercalatum)和湄公血吸虫(S.mekongi)。在世界范围内流行于感染人群的血吸虫有3种即曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫。在我国仅有日本血吸虫病的流行,它是我国5种主要的寄生虫病之一。由于日本血吸虫感染所导致的病情最为严重，也是防治难度最大的。主要原因在于日本血吸虫动物宿主多；成虫存活时间长；感染后宿主的伴随免疫以及治愈后的免疫力差；中间宿主钉螺分布广泛且难以消灭等等。在血吸虫感染宿主的过程中，尾蝴、童虫、成虫和虫卵均可对宿主造成损害。其主要原因是血吸虫不同的发育时期可以释放不同的抗原诱导宿主的免疫应答，这些特异性免疫应答的结果是一系列免疫病理变化的出现，日本血吸虫对终末宿主的主要�：κ浅媛讶庋恐追从透蜗宋�。目前，普遍认为血吸虫病是一种免疫性的疾�。桓莶〕毯土俅仓⒆矗娌】煞治毙�、慢性和`晚期三种。诊断是确定血吸虫感染率以及感染度的有效手段。诊断不仅为流行区的划分提供判断标准，还为血吸虫病防治活动的各个环节提供必不可少的信息和科学依据，在防治工作中处于重要位置。无论从个体水平确定药物化疗的对象、考核化疗的效果，还是在群体水平监测血吸虫病疫情的变化、考核血吸虫病控制效果和评估流行趋势等等，均需要以诊断结果作为评判依据之一。传统的病原学方法(粪便检查)是诊断血吸虫病最为经典和可靠的途径，是判断血吸虫感染与否的“金标准”。但是病原学方法工作强度大、诊断周期长，而且流行区人群的依从性逐年下降，收集病人粪便的难度不断增加。此外随着血吸虫病大规模防治规划的实施，流行区病人的感染度和感染率明显下降，病原学方法在血吸虫病低度流行区的敏感性有限，粪检查出病原的难度增大。因此，单纯依靠病原学的诊断方法已经不能适应大规模血吸虫病防治工作的需要。免疫学的诊断方法具有操作简便、敏感性较高、特异性较好和流行区群众的依从性较高等优点，已逐渐为广大血防工作人员以及流行区群众所接受，并且在流行区化疗对象的大规模筛查、血清流行病学调查以及防治效果的评价等方面起到了极为重要的作用。目前，血吸虫病免疫诊断最常用的抗原是成虫和虫卵抗原，但抗原成分复杂，制备步骤繁琐，来源有限且不易质控，难以适应大规模现场疾病普查的需求。依靠基因工程方法生产的重组抗原分子可为现场推广应用提供大量的抗原材料，且成分明确、特异性好。鞘脂激活蛋白(Saposin)是由其前体蛋白(Prosaposin)产生的热稳定性蛋白家族，包括鞘脂激活蛋白A、B、C、D。其功能是作为鞘脂糖水解途径中所涉及到的溶酶体酶的激活剂，参与带有短的寡糖链的脂类的代谢。四种鞘脂激活蛋白的结构相似，均有形成二硫键以稳定结构的6个半胱氨酸、一个糖基化位点以及同一位点的保守脯氨酸残基。鞘脂激活蛋白B(Saposin B)是最早被发现和研究的鞘脂激活蛋白，该蛋白可以活化芳香基硫酸酯酶A、α-半乳糖苷酶、酸性β_半乳糖苷酶等多种酶类，参与部分糖脂和甘油脂的代谢等，因此被认为是一种非特异性的激活蛋白。鞘脂激活蛋白样蛋白(Saposin-like protein, SAPLIP)是一大类具有saposin结构域的蛋白家族，广泛存在于原生动物到哺乳动物的体内，并发挥各种生物学作用。Espino等采用肝片吸虫的重组SAPLIP蛋白(rFhSAP-2)免疫兔子，初次免疫后2周即可产生高水平的rFhSAP-2特异性抗体，两次免疫后攻击感染获得了 81.2%的减虫率，在粪便和肝脏中分别获得了 83.8%和73.0%的减卵率，表明该蛋白是一种很好的疫苗候选分子。Lee等使用重组的华支睾吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白(clonorin)分别对华支睾吸虫病人(20份)、后睾吸虫病人(9份)、并殖吸虫病人(20份)、日本血吸虫病人(20份)、裂头蝴病人(20份)、猪囊尾蝴病人(20份)和正常人(40份)进行ELISA试验，结果显示该重组蛋白用于免疫诊断具有34%的敏感性和99%的特异性；clonorin特异性的IgG抗体水平在囊蝴感染后8周显著升高，并维持较长时间。 Don等表达了曼氏血吸虫的鞘脂激活蛋白样蛋白Sm-SLP-1 (包含I个SAPLIP结构域)和Sm-SLP-2 (包含2个SAPLIP结构域)，免疫定位试验显示该蛋白主要表达于消化道内皮，推测可能与血红蛋白的消化相关。重组的Sm-SLP-1蛋白不仅可以被感染的小鼠血清识别，还可以被病人血清识别，提示该蛋白可能具有潜在的诊断价值。张纯等克隆并表达了日本血吸虫12kDa的鞘脂激活蛋白样蛋白(Sj-SLP)，纯化的重组蛋白(rSj-SLP)能被感染兔血清识别，而不被正常兔血清识别；rSj-SLP免疫新西兰大白兔可产生1: 12800的特异性抗体，表明该蛋白具有较强的免疫原性和抗原性。日本血吸虫含鞘脂激活蛋白B结构域蛋白(SjSap)是一种含有SaposinB的结构域的蛋白，与SAPLIP具有类似的疏水氨基酸的分布、具有形成二硫键以稳定结构的6个半胱氨酸以及保守的脯氨酸残基。该蛋白与已报道的SAPLIP家族成员的氨基酸序列同源性低于30%，是血吸虫新的蛋白序列。本发明通过PCR扩增出日本血吸虫SjSap全基因，并在大肠杆菌中重组表达此基因，得到大小约为20kDa的重组蛋白，经ELISA试验确认所得重组蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有较高的敏感性和特异性，是潜在的诊断抗原候选靶标，从而完成了本发明。在本发明之前，还没有出现涉及本发明日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白及其用于日本血吸虫病诊断的公开报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白。本发明要解决的技术问题之二是提供一对用于日本血吸虫SjSap基因PCR扩增的特异性引物。本发明要解决的技术问题之三是提供该日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法。本发明要解决的技术问题之四是提供该日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白在检测日本血吸虫病人血清抗体中的应用。本发明通过生物信息学技术分析获得了日本血吸虫SjSap的编码基因序列(如SEQ ID N0.1所示序列(Genbank FN315902.1))。利用分子生物学技术对日本血吸虫SjSap基因进行PCR扩增，纯化扩增产物，将所得产物、质粒载体pET-28a(+)分别进行酶切、回收，连接构建成SjSap基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)_SjSap，通过转化筛�。樘嶂刈橹柿＃璓CR、测序及酶切鉴定确认后，转化至宿主细胞大肠肝菌中表达；取表达量较高的克�。⒔椭票妇澹ㄖ刈榈鞍椎娜芙庑裕挥捎诒泶锏闹刈榈鞍孜夷讶苡诒湫约林校虼酥苯咏褰蠸DS-PAGE，经卡马斯亮蓝染色后切下目的条带，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收纯化目的蛋白，最终得到纯化的重组蛋白SjSap，完成了 SjSap基因的体外克隆表达及纯化。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:本发明第一个方面是提供一种日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白，其具有SEQ IDN0.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功 能的蛋白。本发明第二个方面是提供了一对用于日本血吸虫SjSap基因PCR扩增的特异性引物，其序列为:上游:5'-CCGGAATTC ATGTTGAAACGATTGTTTATATTGATTG-3'(如 SEQ IDNO:3所示)或其互补链；下游:5'-CCG CTCGAG TTAAGTGGTGAATTGAACTAGAAACTTC-3'(如 SEQ ID NO:4所示)或其互补链。本发明第三个方面提供了一种日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤:I)日本血吸虫SjSap基因序列的扩增(用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA中获得SjSap的DNA片段);2)日本血吸虫SjSap重组质粒的构建和鉴定:用pET_28a(+)载体构建日本血吸虫 SjSap 重组表达质粒 pET-28a(+)-SjSap ；3)将pET_28a (+) -SjSap重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达的重组蛋白SjSap ；4)PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收纯化表达的重组蛋白SjSap。步骤I)日本血吸虫SjSap基因序列的扩增，具体为:以含有日本血吸虫SjSap基因序列的cDNA克隆为模板，SEQ IDN0.3 (CCG GAATTC ATGTTGAAACGATTGTTTATATTGATTG)或其互补链为 5’ 引物，SEQ IDN0.4 (CCG CTCGAG TTAAGTGGTGAATTGAACTAGAAACTTC)或其互补链为 3’ 引物，进行 PCR 扩增，所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，用QIAquick 胶回收试剂盒(QIAquick Gel ExtractionKit)回收纯化。所述PCR扩增的反应条件为95°C预变性5min ;94°C变性lmin，59°C退火lmin，72°C延伸lmin，72°C延伸10min，30个循环；最后保存于4°C。步骤2)构建可在宿主细胞中表达SjSap编码基因的重组质粒pET-28a(+)_SjSap，具体为:将纯化的SjSap基因PCR产物片段和质粒载体pET_28a(+)分别用限制性内切酶EcoR I 和Xho I 进行酶切，用QIAquic 胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)回收纯化。纯化后的目的基因片段和载体酶切片段按照3: 1(摩尔比)的比例进行连接，构建成SjSap编码基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-SjSap。将此质粒通过CaCl2法转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，培养后收集菌体，用AxyPrep质粒小量制备试剂盒抽提菌体中所含重组质粒，进行PCR鉴定、测序鉴定及酶切鉴定。步骤3)重组质粒pET_28a (+) -SjSap在大肠肝菌(宿主细胞)中的表达，具体为:通过钙转化将上述抽提所得pET-28a(+)_SjSap重组质粒转化入大肠杆菌BL2KDE3)中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上。随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂(IPTG)继续培养。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。步骤4)纯化SjSap重组蛋白:取表达重组蛋白SjSap量较高的冻存菌种划线于含卡那霉素的LB琼脂平板上，培养过夜之后，随机挑取上述平板上的菌落接种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续`培养，最后收取菌体；在上述菌体中加入BugBuster蛋白抽提剂裂解细菌，离心后保留上清液与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果。根据上述结果，用变性剂裂解所得沉淀，沉淀难溶于变性剂。将表达重组蛋白的全菌体进行SDS-PAGE，凝胶经考马斯亮蓝染色后，切下目的条带，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒进行回收纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。本发明第四个方面提供了一种日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白在检测日本血吸虫病人血清抗体中的应用。本发明以纯化的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白包被酶标板，4°C过夜。加入封闭液，ΙΟΟμ I/孔，封闭酶标板上的非特异性结合位点。分别加入I: 100稀释的血吸虫病人血清、其他常见人体寄生虫病人血清和正常人血清，100 μ I/孔，每份样品均做复孔，于37°C反应2小时。每孔加入100 μ I的HRP标记羊抗人IgG全分子(Sigma-Aldrich，适当的稀释度)，37°C反应I小时。加入100 μ I/孔的TMB底物溶液，室温显色后加入100 μ I/孔的2Μ H2SO4终止反应。用酶标仪读取0D450 的数值。以上各步骤之间分别用PBST (磷酸盐吐温缓冲液)进行洗涤。经上述日本血吸虫SjSap重组蛋白的间接ELISA试验的验证，本发明的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有较高的敏感性和特异性，是潜在的诊断抗原候选靶标，可以作为日本血吸虫病免疫诊断的目的抗原。
图1是实施例1中日本血吸虫SjSap基因序列的扩增结果示意图。图1中，M:DNA分子量标准;1 =SjSap ；2:空白对照。图2是实施例3中日本血吸虫SjSap基因重组质粒菌落PCR鉴定结果示意图。图2中，M =DNA分子量标准；1_4 =SjSap ；5:空白对照。图3是实施例4中日本血吸虫重组蛋白(SjSap)的SDS-PAGE分析结果示意图。图3中，M:蛋白分子量标准；1:未诱导对照；2:诱导后4h(lmM/L IPTG) ；3:菌体裂解后上清；
4:菌体裂解后沉淀。图4是实施例5中SjSap重组蛋白纯化效果的SDS-PAGE分析结果示意图。图4中，M:蛋白分子量标准；1:未诱导对照；2:诱导后4h(lmM/L IPTG) ；3:菌体裂解后上清；4:菌体裂解后沉淀；5纯化后SjSap重组蛋白。图5是实施例6中SjSap重组蛋白用于血清抗体检测的敏感性和特异性试验结果示意图。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。主要试剂如表1所示:表权利要求
1.一种日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白，其特征在于，具有SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。
2.一对用于日本血吸虫SjSap基因PCR扩增的特异性引物，其特征在于，其序列为: 上游:5' -CCGGAATTCATGTTGAAACGATTGTTTATATTGATTG-3/ (如 SEQ ID NO:3 所示)或其互补链； 下游:5' -CCGCTCGAGTTAAGTGGTGAATTGAACTAGAAACTTC-3'(如 SEQ IDNO:4 所示)或其互补链。
3.—种如权利要求1所述的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)日本血吸虫SjSap基因序列的扩增； 2)日本血吸虫SjSap重组质粒的构建和鉴定； 3)将该重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达的重组蛋白； 4)PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收纯化表达的重组蛋白。
4.如权利要求3所述的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤I)具体为:设计SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其互补链和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，以含日本血吸虫成虫cDNA为模板进行PCR扩增；所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，并回收纯化。
5.如权利要求4所 述的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为95°C预变性5min ;94°C变性lmin，59°C退火lmin，72°C延伸Imin，72°C延伸10min，30个循环；最后保存于4°C。
6.如权利要求3所述的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为:将步骤I)所得的PCR产物片段与质粒载体pET-28a(+)分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切，并回收纯化；根据纯化后的目的基因片段和载体酶切片段的浓度进行连接，构建成SjSap编码基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-SjSap ;将此重组质粒通过CaCl2法转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，培养后收集菌体，抽提菌体中所含重组质粒，进行PCR鉴定、测序鉴定。
7.如权利要求3所述的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为:通过钙转化将步骤2)测序鉴定无误的pET-28a(+)-SjSap重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上；随机挑取上述平板上的菌落，培养大肠杆菌至对数生长期，加入诱导剂继续培养；SDS-PAGE电泳鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。
8.如权利要求3所述的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为:取表达重组蛋白SjSap量较高的冻存菌种划线于含卡那霉素的LB琼脂平板上，培养过夜之后，随机挑取上述平板上的菌落接种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体；在上述菌体中加入BugBuster蛋白抽提剂裂解细菌，离心后保留上清液与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果；根据上述结果，用变性剂裂解所得沉淀，沉淀难溶于变性剂；将表达重组蛋白的全菌体进行SDS-PAGE，凝胶经考马斯亮蓝染色后，切下目的条带，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒进行回收纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。
9.一种如权 利要求1所述的重组抗原蛋白在检测日本血吸虫病人血清抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种日本血吸虫含鞘脂激活蛋白B结构域蛋白(SjSap)重组抗原蛋白，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。此外，本发明还公开了该日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法，包括日本血吸虫SjSap基因序列的扩增、日本血吸虫SjSap重组质粒的构建和鉴定、重组蛋白的诱导表达和纯化等步骤。此外，本发明还公开了该日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白在检测日本血吸虫病人血清抗体中的应用。经过酶联免疫吸附试验(ELISA)的验证，本发明的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有较高的敏感性和特异性，是潜在的诊断候选靶标，可以作为日本血吸虫病诊断的目的抗原。
文档编号G01N33/68GK103102404SQ201110359988
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者卢艳, 胡薇, 徐斌, 鞠川, 莫筱瑾, 陈绅波, 冯正 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
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