专利名称：血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，具体的涉及血管紧张素II (Ang II)化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
血管紧张素II (Angiotensin II，Ang II)是血管紧张素中最重要的组成部分，是由血管紧张素I在血管紧张素转换酶的作用下形成的，是一种8肽物质。血管紧张素II与人体的血管平滑机、肾上腺皮质球状带细胞、心脏、肾脏器官的细胞上的血管紧张素受体结合，引起相应的生理效应。血管紧张素作用于血管平滑�。墒谷砦⒍鍪账酰鲅股�。血管紧张素II是已知最强的缩血管活性物质之一。
血管紧张素II是一种可通过内分泌、自分泌/旁分泌以及胞内分泌发挥作用的激素。它具有强烈收缩血管的作用，全身微动脉收缩，外周阻力增加，血压升高；静脉收缩，回心血量增多。Ang II介导交感神经系统而促进去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)释放,减少NE的再摄�。岣哐芏訬E的反应性，促进肾上腺释放儿茶酚胺，从而加强心功能同时通过血管的外周作用而提升血压。Ang II可强烈刺激肾上腺皮质球状带细胞合成和分泌醛固酮，后者促进远曲小管和集合管重吸收氯化钠及水并排钾；此外，Ang II尚可直接刺激近球小管重吸收氯化钠、刺激垂体后叶释放抗利尿激素而增加水的重吸收；引起入球及出球小动脉收缩，导致肾小球血流量减少，滤过系数降低。故Ang II有调节水盐平衡、保证循环血量、维持血压和减少尿生成的作用。所以血浆中血管紧张素II含量的测定，可为多种高血压和肾脏疾病的分型与诊断提供依据。目前，国内外对血管紧张素II的检测较少，其中有放射免疫分析法，酶免法，化学发光法等。放射免疫分析法有放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤等缺点。随着标记免疫技术的迅速发展，各种新的检测方法层出不穷，例如ELISA方法、时间分辨免疫分析法、免疫荧光法、化学发光发等。其中化学发光免疫分析法具有敏感性高、特异性强、检测范围广、速度快等优点，越来越受到人们的关注。
发明内容
本发明要解决的问题是提供血管紧张素II的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，解决了灵敏度低，检测范围窄的缺陷。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒包括Ang II抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的Ang II > Ang II校准品、Ang II质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。。所述的血管紧张素II抗体包被板的固相载体为96孔或48孔的白色微孔板。所述的血管紧张素II化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的辣根过氧化物酶纯度要求RZ彡3. 0,活性彡250U/mL。所述的发光液A包含0. IgL鲁米诺和0. 165gL对碘酚；发光液B包含0.675gL过氧化脲。所述的20倍浓缩洗液包括75. 5gL Tris, 120gL NaCl,5mL / L Tween-20, IgLProclin300o一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤I) Ang II抗体包被板制备将Ang II抗体加到pH9. 6碳酸盐缓冲液中混匀，在每个微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置过夜，用洗涤液洗涤五次之后，用牛血清蛋白溶液对微孔板进行封闭，弃去孔内液体后，将酶标板干燥，密封，即得经Ang II抗体包被的微孔板； 2)辣根过氧化物酶标记Ang II,得Ang II酶结合物；利用高碘酸钠氧化法，将Ang II与辣根过氧化物酶连接在一起，形成经辣根过氧化物酶标记的Ang II ；
3) Ang II 校准品；将Ang II抗原用校准品稀释液配制成不同浓度的校准品(浓度分别为0，20，50，150，400，1000pg/mL),分装，贴标签，储存于2 8°C。4)Ang II质控品的配制在正常人血清中加入适量的Ang II纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为78. 50pg/mL和492. 94pg/mL。5)配制发光液A液和B液；A 液是含有 0. 7g / L 鲁米诺和 0. 165g / L 对碘酚的 pH8. 6 的 5mmol / LTris .HCl缓冲液为液是浓度为0. 675g / L的过氧化脲，用工艺用水配制。6)配制20倍浓缩洗液；20倍浓缩洗液的配方如下75. 5gL Tris, 120g / L NaCl，5mL / L Tween-20, Ig /LProclin300o7)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8V ;其中包含发光液A、发光液B、20倍浓缩洗液、Ang II酶结合物各I瓶，Ang II抗体包被板I块，Ang II校准品6瓶、Ang II质控品2瓶。8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定；进一步所述的包被板为包被含有Ang II抗体的96孔或48孔白色微孔板。本发明方法制备的试剂盒采用如下具体形式，其包括Ang II抗体包被的96孔或48孔的白色微孔板、辣根过氧化物酶标记的Ang II、不同浓度的Ang II校准品、发光底液A为鲁米诺和对碘酚、发光底液B为过氧化脲、20倍浓缩洗液为配方为75. 5g / L Tris，120g /L NaCl,5mL / L Tween-20, Ig / LProclin300oProClin300以其广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性，ProClin300成为用于诊断试剂的理想高效防腐剂。Proclin300防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长产品的储存时间。其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中。特别是，ProClin300防腐对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验指示剂。本专利发明的血管紧张素II定量检测试剂盒，采用目前最为敏感的免疫测定方法——化学发光免疫分析技术，具有以下有点(1)本产品分析灵敏度不高于0. 05pg / mL；
(2)本产品的特异性良好，与血管紧张素I及血管紧张素1-7的交叉特异性均小于1%。(3)精密度良好，批内精密度不高于15%，批间精密度不高于20%。(4)稳定性良好，本产品在37°C可存放7天以上，在疒8°C可存放I年。(5)特异性强，反应快速，可在65分钟内判断检测结果，操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好、等优点。性能优于国内同类产品，达到了国际先进水平，成本较国外的产品低。
图I是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定Ang II与放免试剂盒测定Ang II的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的Ang II值，横坐标为放免试剂盒测定Ang II值，两种方法相关系数(r) =0. 9754，直线方程y=0. 9861x_0. 2961。
具体实施例方式实施例I :制备血管紧张素II化学发光免疫定量检测试剂盒血管紧张素II化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 Ang II抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的Ang II、Ang II校准品、Ang II质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。通过下述方法制备血管紧张素II化学发光免疫定量检测试剂盒I)包被将Ang II抗体加到pH=9. 6碳酸盐缓冲液中混匀，在每个微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置过夜，用洗涤液洗涤五次之后，用牛血清蛋白溶液对微孔板进行封闭，弃去孔内液体后，将酶标板干燥，密封，即得经Ang II抗体包被的微孔板。2)利用高碘酸钠氧化法，将Ang II与辣根过氧化物酶连接在一起，形成经辣根过氧化物酶标记的Ang II。3 ) Ang II校准品的配制将Ang II抗原用校准品稀释液配制成不同浓度的校准品(浓度分别为0，20，50，150，400，1000pg/mL),分装，贴标签，储存于2 8°C。4)Ang II质控品的配制在正常人血清中加入适量的Ang II纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为78. 50pg/mL和492. 94pg/mL。5 )配制发光液A液和B液；A 液是含有 0. 7g / L 鲁米诺和 0. 165g / L 对碘酚的 pH8. 6 的 5mmol / LTris .HCl缓冲液为液是浓度为0. 675g / L的过氧化脲，用工艺用水配制。6)配制20倍浓缩洗液；20 倍浓缩洗液的配制方法如下75. 5g / L Tris, 120gL NaCl，5mL / LTween-20，lgLProclin300o7)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ;其中包含发光液A、发光液B、20倍浓缩洗液、Ang II酶结合物各I瓶，Ang II抗体包被板I块，Ang II校准品6瓶、Ang II质控品2瓶。8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。说明指标检测准确性试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行(t检验，11|〈2. 447);以企业标准品为对照品，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0. 90 1. 10范围内。企业校准品的配制将高纯度的Ang II用稀释液(含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)稀释为系列梯度，经WHO标准品(NIBSC编号86/538)标定，其浓度分别为20、50、150、400、1000pg/mL，并以不含Ang II的稀释液作为零值对照。剂量-反应曲线的线性用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，剂量-反应曲线在(Tl2ng/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于0. 9900。分析灵敏度分析灵敏度不高于0. 05ng/mL。精密度批内不精密度(CV%)应不高于15.0%;批间不精密度(CV%)应不高于20. 0%。
质控品测定值平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为62. 80 94. 21pg/mL和394. 36 591. 53pg/mL。特异性交叉反应应符合下表要求。
权利要求
1.血管紧张素II化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:AngII抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的Ang II、Ang II校准品、Ang II质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。
2.根据权利要求I所述 的血管紧张素II化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的血管紧张素II抗体包被板为包被含有Ang II抗体的96孔或48孔白色微孔板。
3.根据权利要求I所述的血管紧张素II化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的辣根过氧化物 酶纯度要求RZ ^ 3. 0，活性> 250U/mL。
4.根据权利要求I所述的所述的血管紧张素II化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的Ang II质控品包括低值质控品和闻质质控品两种，其中低值质控品的浓度范围是62. 80 94. 21pg/mL,高质质控品的浓度范围是394. 36 591. 53pg/mL。
5.根据权利要求I所述的血管紧张素II化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A包含0. 7g / L鲁米诺和0. 165gL对碘酚；发光液B包含0. 675g / L过氧化脲。
6.根据权利要求I所述的血管紧张素II化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的 20 倍浓缩洗液包括 75. 5g / L Tris，120g/L NaCl,5mL / LTween-20，Ig /LProclin300o
7.一种制备所述权利要求I的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤 1)Ang II抗体包被板制备 将Ang II抗体加到pH9. 6碳酸盐缓冲液中混匀，在每个微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置过夜，用洗涤液洗涤五次之后，用牛血清蛋白溶液对微孔板进行封闭，弃去孔内液体后，将酶标板干燥，密封，即得经Ang II抗体包被的微孔板； 2)辣根过氧化物酶标记AngII,得Ang II酶结合物 利用高碘酸钠氧化法，将Ang II与辣根过氧化物酶连接在一起，形成经辣根过氧化物酶标记的Ang II ； 3)Ang II校准品 将Ang II抗原用校准品稀释液配制成不同浓度的校准品，浓度分别为0，20，50，150，·400，1000pg/mL,分装，贴标签，储存于2 8°C ； 4)AngII质控品的配制在正常人血清中加入适量的Ang II纯品，配制低值质控品和高值质控品，其浓度的平均值分别为78. 50pg/mL和492. 94pg/mL ； 5)配制发光液A液和B液 A液是含有0. 7g / L鲁米诺和0. 165g / L对碘酚的pH8. 6的5mmol / LTris *HC1缓冲液为液是浓度为0. 675g / L的过氧化脲，用工艺用水配制； 6)配制20倍浓缩洗液 ·20 倍浓缩洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g / L NaCl,5mL / L Tween-20,1g/LProclin300 ； 7)组装 将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ; 8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。
8.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的包被板为包被含有有Ang II抗体的96孔或48孔白色微孔板。
全文摘要
本发明公开了一种血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括AngII抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的AngII、AngII校准品、AngⅡ质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。另外本发明还公开了一种血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好等优点。
文档编号G01N33/68GK102749455SQ20121021401
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者刘萍, 宋启超, 张影, 范利花 申请人:博奥赛斯(天津)生物科技有限公司
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