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专利名称：一种用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条的制作方法
技术领域：
，本发明属于生物检测领域，涉及ー种医用检测耗材，具体涉及ー种用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条。
背景技术：
肠道病毒71型IgM属于肠道病毒属A型，肠道病毒一般是以数字命名的，排列顺序代表着其发现的先后次序。按顺序，这种病毒被命名为肠道病毒71型(Humanenterovirus 71),简称 EV71,是引起婴幼儿手足 ロ 病(hand-foot and mouth disease ；HFMD)主要病原体之一。人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统 疾病的婴儿粪便标本中分离出来的。EV71主要引起手足ロ�。�还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髄灰质炎样的麻痹等多种神经系统疾病。手足ロ病和中枢神经系统感染是EV71感染而引起的两大常见临床症状。病毒从咽部或肠道侵入，在局部黏膜或淋巴组织中繁殖，并由局部排出，此时可引起局部症状。继而病毒又侵入局部淋巴结，并由此进入血液循环导致第一次病毒血症。病毒经血循环侵入网状内皮组织、深层淋巴结、肝、脾、骨髓等处大量繁殖并由此进入血液循环，引起第二次病毒血症。病毒可随血流进入全身各器官，如中枢神经系统、皮肤黏膜、心脏等处，进一歩繁殖并引起病变。易感者感染EV71后，出现血管变态反应和组织炎症病变。当病毒累及中枢神经系统时，组织炎症较神经毒性作用更加強烈，中枢神经系统小血管内皮最易受到损害。细胞融合、血管炎性变、血栓形成可导致缺血和梗死。在脊髄索、脑干、间脑、大脑和小脑的局部组织中，除嗜神经性作用外，还存在广泛的血管周围和实质细胞炎症。肠道病毒71型IgM危害极大，目前急需简便快捷准确的仪器是实现对其的检测。免疫胶体金技术(Immunogold labelling techique)是上世纪80年代继突光素、放射性同位素和酶三大标记技术后发展起来的固相标记免疫測定技木。该技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，形成肉眼可见的红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新型层析材料基础上发展起来的ー项新型体外诊断技木，近年来发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。该技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在硝酸纤维膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体区域时，待测物金标试剂复合物与之发生特异性结合而被截留，胶体金标记聚集在检测带上，可通过目測得到直观的显色結果。而游离的标记物则越过检测带，从而达到与检测物自动分离的目的。抗体捕获法(亦称反向间接法)ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分的測定。其原理是将抗原固化在基质上，加入含抗体的杂交瘤培养上清，洗去未结合的抗体，结合于抗原上的抗体可由标记有荧光素、放射性核素或一些酶的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体识别。
市场上检测肠道病毒71型(IgM)多采用酶联免疫检测试剂盒，但试剂盒检测虽然检出限较低(O. 15mg/L)，但是检测时间长，不适合现场測定，申请号为201010171862. 2的发明专利申请，提出一种肠道病毒71型抗体(IgM)诊断试剂盒(酶联免疫法)，该试剂盒检测检测肠道病毒71型抗体(IgM)前、后都需要做必要的仪器清洗及保养工作，检测时间长，并且要求本领域专业技术人员来操作。目前，将抗体捕获法和免疫胶体金技术相结合，同间保证检测的灵敏度和特异性，并且使用方便，操作简单，准确快速，用于检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条鲜有报道。

发明内容
为解决上述领域的需求和空白，本发明g在提供一种用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，本发明试纸条采用抗体捕获法和免疫胶体金技术相结合快速检测 人血清、血浆或全血中的肠道病毒71型IgM，用于手足ロ疾病患者的检测；本发明试纸条操作简单，拿来即用，不需要本领域的专业人员，能够满足不同层次人员的需要，容易普及到基层社区医院以符号显示結果，摆脱了对设备、仪器、人员及贮存和运输环境的特殊要求，并且具有快速、简便、灵敏、准确、特异的特点。一种用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，在高度方向上包括基板支撑层、反应试剂载体吸附层，所述反应试剂载体吸附层固定在所述基板支撑层上；所述反应试剂载体吸附层从沾液端到手持端依次设有样品纤维垫，金标纤维垫，纤维素药膜，手持端吸水材料垫；在所述样品纤维垫、金标纤维垫和手持端吸水材料垫上覆盖有保护膜层，所述纤维素药膜垫上从手持端到沾液端依次设有对照线C、检测线T，所述对照线C和检测线T相互平行且与所述胶体金试纸条长度方向相垂直，其特征在于，所述金标纤维垫上包被有胶体金标记的EV71抗体；所述对照线C包被有抗鼠IgG多抗，所述检测线T包被有抗μ链单抗，所述样品纤维垫包被有EV71重组抗原。所述金标纤维垫上包被的胶体金标记的EV71抗体为EV71单抗。所述用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，其特征在于，在样品纤维垫上对应的保护膜层上表面标有与所述检测线T平行的可视的MAX标志线。所述吸水材料层的材料是粗纤维吸水纸，所述金标纤维垫的材料是吸附金标蛋白的玻璃纤维棉。所述保护膜层为胶帯。所述基板支撑层为不吸水的塑料基板。还包括外壳，所述外壳具有中空位，所述中空位与所述反应试剂载体吸附层及所述基板支撑层形成的简易胶体金试纸条的形状大小相匹配，用于装载所述反应试剂载体吸附层，所述外壳上表面对应于样品纤维垫及纤维素药膜的位置分别设有加样窗和视窗。一种用于快速检测肠道病毒71型IgM的试剂盒，其特征在于包括上述任ー胶体金试纸条和样品稀释用具。技术效果根据胶体金检测的原理，将本发明的胶体金试纸条的粘液端浸入待测液(待测液为取10 μ I样本液，按照1:200倍用样本稀释液进行稀释，配制而得)中，或者在粘液端的样品纤维层滴加待测液，待测液中的靶标物质在纤维层材料的毛细作用下沿着试纸条从沾液端向手持端移动，待测液中的EV71 IgM抗体经过样品垫时与样品垫中含有EV71重组抗原，以及经过金标纤维层时与胶体金标记EV71单抗粘附在一起井向吸水纸垫方向移动，待测液中的EV71IgM抗体经过检测线时，与检测线上包被的抗μ链单抗由于特异性结合导致胶体金在检测线上聚集，使检测线显色。其余胶体金标记蛋白继续迁移，到对照线吋，由于采用的胶体金标记EV71单抗与对照线上包被的抗鼠IgG多抗能特异结合，因此，胶体金在对照线上聚集使对照线显色。即检测线和对照线都显色，表明待测液为阳性；如果，待测液中不存在EV711 gM抗体，那么，待测液迁移至检测线时，待测液中没有与检测线上包被的抗μ链单抗能够结合的成分，从而导致胶体金不会聚集于检测线，因此，检测线不会显色，但是对照线处仍然显色。即仅仅有对照线显色，表明待测液为阴性。本发明的胶体金试纸条不同于现有的试纸条之处在于所述纤维素药膜垫上从手持端到沾液端依次设有对照线C、检测线Τ，所述对照线C和检测线T相互平行且与所述胶体金试纸条长度方向相垂直，其特征在于，所述金标纤维垫上包被有胶体金标记的EV71抗体；所述对照线C包被有抗鼠IgG多抗，所述检测线T包被有抗μ链单抗，所述样品纤维垫·包被有EV71重组抗原。本发明试纸条采用抗体捕获法原理以及胶体金技术快速检测血清/血浆/全血样本中的肠道病毒71型IgM，用于手足ロ疾病患者的检测。本发明试纸条通过选定金标纤维垫、T线、C线和样品纤维垫上的相应的生物包被试剂来实现对肠道病毒71型IgM快速检测，同时本发明试纸条兼顾检测的灵敏度和特异性。本发明,优选地,所述金标纤维垫上包被有胶体金标记的EV71抗体为EV71单抗，样品纤维垫上包被有EV71重组抗原与对照线T上包被的抗μ链单抗进行特异性结合。本发明，优选在样品纤维垫上对应的保护膜层上表面标有与所述检测线T平行的可视的MAX标志线。用于提醒操作人员，操作时待测液不要超过标志线，以免引起假阳性。本发明，优选所述样品纤维垫的材料是玻璃纤维棉，所述吸水材料垫的材料是粗纤维吸水纸，所述纤维素药膜的材料是硝酸纤维素膜，所述金标纤维垫的材料是吸附金标蛋白的玻璃纤维棉。这些材料配合使用，其吸水性及毛吸作用配合良好，保证本发明检测试纸条的检测速度和准确性。本发明，优选保护膜层为胶�。�使试纸条免受污染，成本低且效果好。本发明，优选基板支撑层为不吸水的塑料基板，不吸水的材料，避免支撑材料吸收待测液从而影响水平方向的迁移。本发明，优选还包括外壳，所述外壳具有中空位，所述中空位与所述反应试剂载体吸附层及所述基板支撑层形成的简易胶体金试纸条的形状大小相匹配，用于装载所述反应试剂载体吸附层，所述外壳上表面对应于样品纤维垫及纤维素药膜的位置分别设有加样窗和视窗。便于携带和保存。本发明试纸条采用抗体捕获法原理以及胶体金技术快速检测血清/血浆/全血样本中的肠道病毒71型IgM，用于手足ロ疾病患者的检测；本发明试纸条操作简单，拿来即用，方便快捷，不需要本领域的专业人员，能够满足不同层次人员的需要，并且保证检测的灵敏性、准确性和高效率。


图I本发明试纸条的俯视图；其中1-手持端，2-对照线C线，3-检测线T线，4MAX标志线，5_沾液端，6_纤维素药膜，7-样品纤维垫，8-手持端吸水材料垫，9-金标纤维垫13-胶带边缘线。图2本发明试纸条 的纵向剖面图其中6-纤维素药膜，7-样品纤维垫，8-手持端吸水材料垫，9-金标纤维垫，10-手持端胶带，11-箭头胶带，12-基板支撑层。
具体实施例方式提供下述实施例是为了更好地进ー步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。本发明g在提供一种用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，本发明试纸条采用抗体捕获法原理以及胶体金技术快速检测血清/血浆/全血样本中的肠道病毒71型IgM，用于手足ロ疾病患者的检测；本发明试纸条操作简单，使用方便，拿来即用，不需要本领域的专业人员，能够满足不同层次人员的需要，容易普及到基层社区医院，以符号显示结果，摆脱了对设备、仪器、人员及贮存和运输环境的特殊要求，可广泛用于肠道病毒71型IgM的定性检测，并且具有快速、简便、灵敏、准确、特异的特点。根据胶体金检测的原理，将本发明的胶体金试纸条的粘液端浸入待测液(待测液为取10 μ I样本液，按照1:200倍用样本稀释液进行稀释，配制而得)中，或者在粘液端的样品纤维层滴加待测液，待测液中的靶标物质在纤维层材料的毛细作用下沿着试纸条从沾液端向手持端移动，待测液中的EV71 IgM抗体经过样品垫时与样品垫中含有EV71重组抗原，以及经过金标纤维层时与胶体金标记EV71单抗粘附在一起井向吸水纸垫方向移动，待测液中的EV71IgM抗体经过检测线时，与检测线上包被的抗μ链单抗由于特异性结合导致胶体金在检测线上聚集，使检测线显色。其余胶体金标记蛋白继续迁移，到对照线吋，由于采用的胶体金标记EV71单抗与对照线上包被的抗鼠IgG多抗能特异结合，因此，胶体金在对照线上聚集使对照线显色。即检测线和对照线都显色，表明待测液为阳性；如果，待测液中不存在EV711 gM抗体，那么，待测液迁移至检测线时，待测液中没有与检测线上包被的抗μ链单抗能够结合的成分，从而导致胶体金不会聚集于检测线，因此，检测线不会显色，但是对照线处仍然显色。即仅仅有对照线显色，表明待测液为阴性。本发明试纸条，在高度方向上包括基板支撑层12、反应试剂载体吸附层，所述反应试剂载体吸附层固定在所述基板支撑层12上；所述反应试剂载体吸附层从沾液端5到手持端I依次设有样品纤维垫7，金标纤维垫9，纤维素药膜6，手持端吸水材料垫8 ;在所述样品纤维垫7、金标纤维垫9和手持端吸水材料垫8上覆盖有保护膜层。本发明的胶体金试纸条不同于现有的试纸条之处在于所述纤维素药膜上6从手持端I到沾液端5依次设有对照线C-2、检测线Τ-3，所述对照线C-2和检测线Τ-3相互平行且与所述胶体金试纸条长度方向相垂直，其特征在干，所述金标纤维垫9上包被有胶体金标记的EV71抗体；所述对照线C-2包被有抗鼠IgG多抗，所述检测线Τ-3包被有抗μ链单抗，所述样品纤维垫7包被有EV71重组抗原。本发明，优选地,所述金标纤维垫9上包被有胶体金标记的EV71抗体为EV71单抗，所述样品纤维垫7上包被有EV71重组抗原，与对照线T-3上包被的抗μ链单抗进行特异性结合。本发明，优选在样品纤维垫7上对应的保护膜层上表面标有与所述检测线T 3平行的可视的MAX标志线4。用于提醒操作人员，操作时待测液不要超过标志线4，以免引起假阳性。本发明，优选所述样品纤维垫7的材料是玻璃纤维棉，所述吸水材料垫8的材料是粗纤维吸水纸，所述纤维素药膜6的材料是硝酸纤维素膜，所述金标纤维垫9的材料是吸附金标蛋白的玻璃纤维棉。这些材料配合使用，其吸水性及毛吸作用配合良好，保证本发明检测试纸条在检测速度和准确性。
本发明，优选保护膜层为胶�。�使试纸条免受污染，成本低且效果好。本发明，优选基板支撑层12为不吸水的塑料基板，不吸水的材料，避免支撑材料吸收待测液从而影响水平方向的迁移。本发明，优选还包括外壳，所述外壳具有中空位，所述中空位与所述反应试剂载体吸附层及所述基板支撑层形成的简易胶体金试纸条的形状大小相匹配，用于装载所述反应试剂载体吸附层，所述外壳上表面对应于样品纤维垫及纤维素药膜的位置分别设有加样窗和视窗。便于携带和保存。实验例I.本发明试纸条的制备方法试剂EV71单抗、EV71重组抗原的来源宁波市疾病预防控制中心抗鼠IgG多抗和抗P链单抗的来源加拿大Artron BioResearch Inc.进ロ。试纸条的制备程序如下步骤I.纤维素药膜的包被I、将抗鼠IgG多抗作为对照线C，抗μ链单抗作为检测线Τ，两个试剂分别按照所需的浓度(范围I. 5-2mg/ml)，用20mM的PBS进行稀释。2、将配制好的上述试剂，按照C、T线位置分别包被到硝酸纤维素膜上，然后干燥6小时，温度为30°C，湿度< 35%，从而制得纤维素药膜。步骤2.金标纤维层的标记I、取40nm的胶体金溶液，按终浓度8-12 μ I/ml加入O. 2M K2CO3,加入一定浓度的EV71单抗，放置室温反应15-30分钟，然后按照浓度20 μ Ι/ml加入20%BSA的溶液，用于饱和游离的胶体金。最后lOOOOrpm，离心30分钟，去除上清液中未结合的蛋白质。用等体积的O. 5m硼酸溶液(含l%Tween、5%蔗糖、1%水解BSA、1%水解酪蛋白、O. 1%PVA)复溶沉淀的胶体金标记原液。2、将上述胶体金标记原液按照10-20%浓度，用O. 5m硼酸溶液进行稀释，从而配制成标记后的胶体金工作液。然后再将该工作液铺于30*30cm玻璃纤维垫上,干燥6小时,温度为30°C，湿度彡35%，从而制得金标垫。步骤3.样品纤维垫的制备I、用20mMPBS将EV71重组抗原按照一定浓度进行稀释，制备成样品纤维垫处理液。2、用样品垫处理液铺于30*30cm玻璃纤维垫上，干燥6小时，温度为30°C，湿度(35%，从而制得样品纤维垫。步骤4.试纸条的组装I、将塑料板平放在操作台上，贴上双面胶带。2、撕掉双面胶带衬纸，在距塑料板上端30mm处贴上已包被有抗μ链单抗和抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜。3、将粗纤维吸水纸压硝酸纤维素膜上端2mm贴上，上端与塑料板上端取齐。 4、将金标垫压于硝酸纤维素药膜下端2mm。5、将样品纤维垫压于金标垫上约一半,下端与塑料板下端取齐贴上。6、将箭头胶带压硝酸纤维素膜I. 5-2mm贴上。7、将手持端胶带压粗纤维吸水纸贴上。实施例2.使用方法及方法学对比实验本产品使用方法待测血清/血浆/全血，稀释200倍，滴加到水平试纸条的样品纤维层上，或将试纸条的粘液端MAX线以下部分浸入稀释样品中3 5分钟，取出水平放置等待显色。对比I :产品对比本发明产品与现有技术检测肠道病毒71型IgM的产品相比具有快速，准确，特异，便捷的特点，并且在检测肠道病毒71型IgM前、后都不需要做必要的仪器清洗及保养工作，并且不要求本领域的专业人员来操作。例如试剂盒等其他产品对照产品I :申请号为201110151009. 9的发明专利公开的ー种肠道病毒71型(EV71) IgM抗体检测试纸条。使用方法将全血、血浆或血清标本100-150 μ I直接滴加检测，10-15分钟判读結果。对照产品2 :北京万泰生物药业股份有限公司《肠道病毒71型IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)》国食药监械(准)字2010第3400526号使用方法I配液将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。2编号将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照I孔。(用双波长检测，可不设空白对照孔)。3加稀释液每孔加入样品稀释液100 μ 1，空白孔除外。4加样分别在相应孔中加入待测样品或明、阳性对照10μ 1，轻轻振荡混均。5温育用封板膜封板后,置37°C温育30分钟。6洗板小心接掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。7加抗原每孔加入抗原试剂50 μ 1，空白孔除外。8加酶每孔加入抗原试剂50 μ 1，空白除外，轻轻振荡混均。9温育操作同5.10洗板操作同6.
11显色每孔加入显色剂A、B液各50 μ 1，轻轻振荡混均，37°C避光显色15分钟。12測定每孔加終止液50 μ 1，轻轻振荡混均，10分钟内測定結果。设定酶标仪波长于450nm处(建议用双波长450nm/630nm检测)，用空白孔调零点后测定各孔A值。对比数据列表如表I :
权利要求
1.一种用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，在高度方向上包括基板支撑层、反应试剂载体吸附层，所述反应试剂载体吸附层固定在所述基板支撑层上； 所述反应试剂载体吸附层从沾液端到手持端依次设有样品纤维垫，金标纤维垫，纤维素药膜，手持端吸水材料垫； 在所述样品纤维垫、金标纤维垫和手持端吸水材料垫上覆盖有保护膜层，所述纤维素药膜垫上从手持端到沾液端依次设有对照线C、检测线T，所述对照线C和检测线T相互平行且与所述胶体金试纸条长度方向相垂直，其特征在于，所述金标纤维垫上包被有胶体金标记的EV71抗体；所述对照线C包被有抗鼠IgG多抗，所述检测线T包被有抗μ链单抗，所述样品纤维垫包被有EV71重组抗原。
2.根据权利要求I所述用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标纤维垫上包被有胶体金标记的EV71抗体为EV71单抗。
3.根据权利要求I所述用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，其特征在于，在样品纤维垫上对应的保护膜层上表面标有与所述检测线T平行的可视的MAX标志线。
4.根据权利要求I所述用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，其特征在于，所述样品纤维垫的材料是玻璃纤维棉，所述吸水材料垫的材料是粗纤维吸水纸，所述金标纤维垫的材料是吸附金标蛋白的玻璃纤维棉。
5.根据权利要求I所述用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，其特征在于，所述保护膜层为胶帯。
6.根据权利要求I所述用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，其特征在于，所述基板支撑层为不吸水的塑料基板。
7.根据权利要求1-6任一所述用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，其特征在于，还包括外壳，所述外壳具有中空位，所述中空位与所述反应试剂载体吸附层及所述基板支撑层形成的简易胶体金试纸条的形状大小相匹配，用于装载所述反应试剂载体吸附层，所述外壳上表面对应于样品纤维垫及纤维素药膜的位置分别设有加样窗和视窗。
8.一种用于快速检测肠道病毒71型IgM的试剂盒，其特征在于包括上述任一胶体金试纸条和样品稀释用具。
全文摘要
本发明一种用于快速检测肠道病毒71型IgM的胶体金试纸条，属医用检测耗材，其特征在于，所述金标纤维垫上包被有胶体金标记的EV71抗体；所述对照线C包被有抗鼠IgG多抗，所述检测线T包被有抗μ链单抗，所述样品纤维垫包被有EV71重组抗原，本发明试纸条采用抗体捕获法原理以及胶体金技术快速检测血清/血浆/全血样本中的肠道病毒71型IgM，本发明试纸条简捷灵敏准确；可快速检测肠道病毒71型IgM，用于手足口疾病患者的检测。
文档编号G01N33/577GK102680694SQ20121016445
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者倪红霞, 孙茜, 张莹 申请人:宁波市疾病预防控制中心, 蓝十字生物药业(北京)有限公司