专利名称：新的严重急性呼吸道综合症冠状病毒蛋白及其抗体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒蛋白及其抗体，具体的说，本发明涉及一种新的严重急性呼吸道综合症冠状病毒蛋白或其片段，编码该蛋白或其片段的核苷酸序列，以及该蛋白或其片段的特异性抗体和应用。
背景技术：
严重急性呼吸道综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)为严重呼吸道传染疾�。屑毙苑⒉。缙诔鱿址尾坎”洌劳雎矢叩忍氐悖俅仓饕硐治窝祝湫椭⒆次⒏呱�(＞38℃)、干咳、呼吸急促或呼吸困难，死亡率约为5％-7％。SARS病患，中国人称之为“非典”，已经成为严重�：θ死嘟】档氖澜缧晕侍狻Ｊ澜缥郎橹啡弦恢中滦偷墓谧床《疚猄ARS的病原体，并将之命名为SARS病毒。SARS病毒为正链的单链RNA病毒，复制不经过DNA中间体，使用标准密码子。
目前，对于SARS病毒除了有已知蛋白如P、S、M、E、N等之外，至少还编码预测的5个开放读码框架(ORF)，分别命名为X1-X5(Rota PA，ObersteMS，Monroe SS等，严重急性呼吸道综合症相关冠状病毒的特性描述(Characterization of a novel coronavirus associated with severe acuterespiratory syndrome，Science 2003；300(5624)1394-1399)或ORF3，4，7，8，11(Marra MA，Jones SJ，Astell CR等SARS相关冠状病毒的基因组序列(The Genome sequence of the-associated coronavirus)Science2003；300(5624)1399-1404)。但是对于这些蛋白是否存在、是否能进一步分离获得和对于病毒感染的意义目前尚无任何报道。
目前，尽管有一些关于SARS的早期实验室诊断技术，但其仍然存在问题，特异性高的免疫检测技术只能检测病人的抗病毒结构蛋白抗体，由于其出现时间晚，发病10-14天以前的病人难以测出，使患者的及时隔离造成困难。敏感性较高的PCR技术虽然能在发病4天检测出病毒RNA，但由于存在假阳性和假阴性的问题，其诊断的特异性仍有疑问。目前迫切需要开发和研制高特异性的早期诊断方法及试剂，特别是免疫检测方法及试剂。
在SARS的发病机理研究方面，目前也尚存在许多疑问，特别是急性期病人出现的间质性肺炎，推测自身免疫病理损伤可能发挥重要作用，但仍缺乏实验证据和分子机理研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种分离的蛋白，该蛋白包含如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或其片段。
如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列(genebank登记号NP-828857)为本发明所述严重急性呼吸道综合症冠状病毒X4蛋白的全长氨基酸序列，含有122个氨基酸，计算机分析发现它1-17位氨基酸含有信号肽序列，101-117位氨基酸含有跨膜区序列，属于I型膜蛋白。基序扫描(Motif Scan)分析发现118-121位氨基酸含有潜在的cAMP-依赖性和cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点；83-85和116-118位氨基酸含有潜在的PKC磷酸化位点；5-15位和57-67位氨基酸含有潜在的原核膜脂蛋白脂质体结合位点(Prokaryoticmembrane lipoprotein lipid attachment site)；38-43和70-75位氨基酸含有潜在的N-豆蔻酰化位点。同源比较分析证明X4蛋白与粘附分子L-选择素(L-Selectin，CD62L)在氨基酸序列上有26.2％的同源性。
针对目前尚无任何资料报道X4蛋白是否存在、能否获得分离的X4蛋白和对于病毒感染的意义的现状，本发明以实验证明了SARS病人血清能测出抗X4蛋白的抗体(参见实施例3和4)，SASR病毒转染的真核细胞膜上表达X4蛋白(参见实施例6)，证明了X4蛋白的表达和客观存在。在此基础上，并进一步分离和获得了X4蛋白。进一步的功能研究证明重组X4蛋白能抑制Balb/C 3T3细胞的生长(参见实施例7)。
本发明中的X4蛋白片段是指具有部分或全部本发明X4蛋白的蛋白，它至少由20个氨基酸组成，优选由40个以上氨基酸组成，所述片段可以与X4蛋白在功能上相同、相似或不同，优选为与其生物学活性基本相同的蛋白。
在本发明的一个实施方式中，提供一种蛋白片段(重组X4蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列无全长X4蛋白的信号肽、跨膜区和外膜区。由于其保留了X4蛋白的主要编码区(对应于SEQ ID NO2所示的18-100位氨基酸)，其具有与所述全长序列基本相同的生物学活性。重组X4蛋白可以代替全长X4蛋白用于检测X4蛋白的抗体的存在，或用于功能检测，参见实施例1和2。本发明以实验证明了SARS病人血清能测出抗X4蛋白的抗体(参见实施例3和4)，SASR病毒转染的真核细胞膜上表达X4蛋白(参见实施例6)，证明了X4蛋白的表达和客观存在。功能研究证明重组X4蛋白能抑制Balb/C 3T3细胞的生长(参见实施例7)。本发明的重组蛋白与全长序列相比，不仅功能基本相同，而且可以快速、低成本制备。
本发明的SARS病毒X4蛋白或其片段可以是天然的、合成的、半合成的、或者重组产生。本发明的SARS病毒X4蛋白或其片段可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生。实施例1和2，是以一个重组X4蛋白作为例子，详细描述了X4蛋白的制备过程，本领域普通技术人员已知，可以用X4蛋白全长序列代替该重组X4蛋白，其余条件按相同或相似条件进行，获得X4蛋白；其它的蛋白片段也可以按相同或相似条件获得。本发明的SARS病毒X4蛋白也可按照Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，PierceChemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪按固相化学技术合成，或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的蛋白。
在本发明的一个实施方式中，所述的SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白可由如SEQ ID NO1所示核苷酸序列编码。如SEQ ID NO1所示的序列为分离自SARS病毒基因组的序列。在本发明的另一个实施方式中，所述的如SEQ IDNO4所示氨基酸序列的蛋白可由如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列编码。如SEQ ID NO3所示的序列是发明人根据X4蛋白的主要编码区设计的核苷酸序列，其适于在大肠杆菌中表达。本领域技术人员已知，可以根据不同的宿主和表达载体，设计编码本发明的X4蛋白的多核苷酸。本发明的基因，或者各种DNA片段的核苷酸序列可以用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger等人，PNAS，1977，745463-5467)测定。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。
本领域普通技术人员已知，本发明所述的蛋白可以同其它的蛋白或蛋白形成融合蛋白。其它蛋白或蛋白的编码序列一般是已知的，有些可以以载体形式购买得到，或者可以按常规方法合成或者从已知生物体中克隆得到。
本发明还提供一种单克隆抗体或多克隆抗体，该单克隆抗体或多克隆抗体与SARS病毒X4蛋白或其片段特异性结合。这里所述的“特异性”是指抗体能结合于本发明的X4蛋白基因产物或片段。优选那些能与本发明的X4蛋白或其片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体也包括那些能够结合并抑制本发明冠状病毒X4蛋白或其片段的抗体。这种结合并抑制本发明冠状病毒X4蛋白或其片段的抗体，可包含于用于抑制SARS病毒的药物组合物中，用于结合并抑制本发明的冠状病毒X4蛋白或其片段。
本发明的单克隆抗体或多克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法进行制备。例如，纯化的本发明X4蛋白基因产物或其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导单克隆抗体和多克隆抗体的产生(参见实施例5和6)。本发明的抗体优选单克隆抗体，其可利用杂交瘤技术制备(见Kohler等人，Nature 256495；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and Tcell Hybridaomad，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的各类抗体可以利用X4蛋白基因产物或其片段或功能区，通过常规免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用蛋白合成仪合成。与本发明X4蛋白的基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如，E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或蛋白)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明提供一段分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含选自(1)编码如SEQ ID NO2所示蛋白或其片段的多核苷酸；
(2)如(1)所述的多核苷酸序列的互补序列。
本领域普通技术人员已知，编码本发明的X4蛋白(如SEQ ID NO2所示)的多核苷酸序列可以是DNA也可以是RNA。其中，DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。反义链或者其一部分(反义寡核苷酸)可用于抑制细胞内X4蛋白的表达。本领域普通技术人员还已知，RNA序列与相对应的非模板DNA序列基本相同，只是以U(胞嘧啶)代替T(胸腺嘧啶)。本发明的多核苷酸序列还可以包括非编码序列，例如内含子、编码序列5′或3′端的非编码序列等。
本发明还进一步涉及与编码本发明X4蛋白的多核苷酸序列杂交的多核苷酸，优选序列间存在至少有80％，更优选90％，最优选95％同源性的多核苷酸序列。“同源性”是通过多核苷酸序列之间核苷酸序列的比较以及保守序列核苷酸序列的数量而确定的。所述多核苷酸编码的蛋白可以与本发明所述如SEQ ID No2所示蛋白具有相同或相似的生物学活性，也可以具有不同的生物学活性，优选具有相同的生物学活性。特别涉及在严格条件下与本发明X4蛋白基因杂交的多核苷酸，所说的“严格条件”已知杂交发生在低于Tm(meliting temperature，融解温度)5℃至低于Tm20-25℃的条件下。所述多核苷酸可以含有至少20个碱基，优选至少30个碱基并且更优选至少50个碱基与X4蛋白的多核苷酸杂交且与之具有如上所述同源性。
编码本发明的X4蛋白的片段的多核苷酸也应包含在本发明范围内。编码所述X4蛋白片段的多核苷酸序列可以是例如，去掉信号肽、跨膜区、膜外区的序列后的主要编码区序列，也可以是引物或者杂交探针，以用于检测编码本发明的X4蛋白的多核苷酸序列。所述片段编码的蛋白可以与X4蛋白在功能上相同、相似或不同，优选为与其生物学活性基本相同的蛋白。
本领域的普通技术人员还已知，当一条多核苷酸的序列确定后，按照碱基互补原则，同样可以确定其互补序列。
在本发明的一个实施方式中，提供一种如SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列。经GenBank检索，对于如SEQ ID NO1所示核苷酸序列，在所有117株不同来源的SARS病毒毒株的序列中，只有4株(AY304493、AY351680、AY394978和AY394979)出现单核苷酸突变，其它未发现在X4蛋白编码序列中出现变异，这表明X4蛋白高度保守。生物信息学的研究还发现，X4蛋白仅存在于SARS病毒的基因组中，其它种属的冠状病毒如鸡、猪、牛、马、人类及鸟类等基因组中均未发现X4基因，说明X4分子可能与SARS病毒的致病性密切相关。针对X4蛋白是否存在和对于病毒感染的意义尚无任何报道的现状，本发明以实验证明了SARS病人血清能测出抗X4蛋白抗体(参见实施例3和4)，SASR病毒转染的真核细胞膜上表达X4蛋白(参见实施例6)，证明了X4蛋白的表达和客观存在。在此基础上，进一步分离并获得了本发明的X4蛋白。
本发明提供一种分离的多核苷酸序列，其核苷酸序列为如SEQ ID NO1所示或为其互补序列。
如SEQ ID NO1所示的多核苷酸为本发明全长X4蛋白(SEQ ID NO2)的编码序列，全长369bp，编码122个氨基酸的开放读码框架。本领域普通技术人员已知，本发明的X4蛋白的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ ID NO1所示的编码序列，也可以由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核苷酸的编码序列。例如，根据每个具体的原核宿主或者真核宿主所使用的密码子的频率不同，可以选择相应的密码子，从而提高所述的多核苷酸在相应的宿主中表达效率。也可以为了获得比天然的核苷酸序列具有更好性能的多核苷酸，如更长的半衰期，转换密码子。
在本发明的一个实施方式中，提供一种分离的多核苷酸序列，其核苷酸序列为如SEQ ID NO3所示或为其互补序列。
如SEQ ID NO3所示多核苷酸序列为不含信号肽和跨膜区的可溶性X4编码区基因，编码如SEQ ID NO4所示氨基酸序列的X4蛋白片段(以下称为重组X4蛋白，该重组X4蛋白对应于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列18-100)，同时针对大肠杆菌修改了一些密码子，以利于提高所述的多核苷酸在大肠杆菌中表达效率。在本发明的一个实施方式中，利用化学合成方法，获得SEQ ID NO3，通过在大肠杆菌中表达，并经离子交换层析，获得95％以上纯度蛋白。本领域普通技术人员已知，本发明所述的蛋白也可通过GST原核系统表达融合蛋白，经亲和层析纯化蛋白获得。
本发明还提供一种含有编码本发明X4蛋白的多核苷酸的载体。按照载体的功能或用途来划分，载体可以分为普通型载体和表达载体。其中，普通载体主要用于各种基因组文库和cDNA文库构建的。表达载体主要用于研究基因的表达或是用于大量生产一些有用的转录产物或蛋白质，有的也可用于cDNA文库的构建。表达载体中应含有适当的启动子、核糖体结合位点、终止子等。为了便于表达产物在细胞中定位，在蛋白编码序列上游可加入适当的前导序列。合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员周知。在细菌中适用的有效表达载体可以这样构建将编码目的蛋白的结构DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号插入到带有一个功能启动子的可操纵的阅读框中。本领域普通技术人员周知用于构建含有本发明核苷酸序列以及合适的转录及翻译调控元件之载体的方法。本领域技术人员知晓，根据本发明DNA序列所插入的表达载体或构建体的种类和特性选择合适的宿主以表达目的蛋白。具体地说，适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，带有lacI、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及已知克隆载体pBR322(ATCC37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。GST原核表达系统也可用于本发明。适用于真核细胞的载体带有真核细胞启动子如CMV、SV40等，这样的载体包括pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等(1991)高技术通讯1126-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本发明的一个实施方式中(参见实施例1)，本发明的重组X4蛋白的多核苷酸序列是利用将PCR产物克隆至pGEM-T载体中(Promega)，进行纯化测序；在本发明的另一个实施方式中(参见实施例1)采用大肠杆菌质粒载体pGEX-4T-1(AmershamPharmacia Biotech)，构建本发明携带重组X4蛋白的表达载体pGEX-X4。
本发明同时提供一种适于表达本发明蛋白的宿主包括但不限于原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如酵母属、曲霉属、昆虫细胞，诸如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系，Gluzman(Cell 23175，1981)及其它的能表达相容载体的细胞系。将构建体导入上述宿主细胞的方法为本领域技术人员周知，包括但不限于氯化钙介导的转化、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法(Sambrook，J.(1989)，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N.Y.；Ausubel，F.M.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.；Hobbs，S.等人，McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)，McGraw Hill，N.Y.191-196；Engelhard，E.K.等人，PNAS，913224-3227；Logan，J.等人，PNAS，813655-3659)。在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞选择以及所表达的目的蛋白的性质相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。在本发明的一个实施方式中(参见实施例1)，采用大肠杆菌XL-1Blue菌和DH5α作为宿主细胞。
本发明还提供一种生产蛋白的方法，其包括以下步骤(1)在适于表达的条件下，培养含有编码本发明蛋白的多核苷酸的宿主细胞；(2)从细胞培养物中获得多核苷酸编码的蛋白。
具体地说，在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学物质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的X4蛋白或其片段的蛋白或融合蛋白，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。在本发明的一个实施方式中，(参见实施例2)，采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱梯度洗脱。
本发明还提供一种检测本发明的X4蛋白或其片段的方法，该方法为免疫荧光方法或酶联免疫吸附法(ELISA)。免疫荧光方法是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。免疫荧光方法又分为直接法、间接法和补体法。在本发明中优选直接免疫荧光试验或间接免疫荧光试验。在本发明的一个实施方式中，利用荧光素标记的抗X4蛋白全长或其片段的单克隆抗体或多克隆抗体，检测本发明的X4蛋白或其片段。
本发明还提供一种检测本发明X4蛋白的特异性抗体的方法，所述方法为免疫印迹法或酶联免疫吸附法(ELISA)。免疫印迹法(immunoblotting test，IBT)，亦称酶联免疫电转移印斑法，因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southern blot相类似，亦被称为Western blot。主要方法分三阶段第一阶段为抗原等蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；第二阶段为电转移将在凝胶中已分离的条带转移到硝酸纤维素膜上；第三阶段为显色检测硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)，依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成显色物的酶反应底物，使条带染色。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horserad-ish Peroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatease，AP)。也可以使用葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。在本发明的一个实施方式中，选用碱性磷酸酶(参见实施例3)。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于临苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS等。碱性磷酸酶的底物一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)，AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)，在本发明的一个实施方式中，采用NBT(氮蓝四唑)。常用的酶标第二抗体已有市售。在本发明的一个实施方式中，可以使用全长X4蛋白，或其重组片段作为抗原，检测本发明X4蛋白的特异性抗体的方法。具体方法参见实施例3和4。
本发明提供一种体外检测严重急性呼吸道综合症的方法，其为体外检测待测样品中本发明的X4蛋白或其片段，和/或体外检测待测样品中本发明的X4蛋白或其片段的特异性抗体。可从病人的体液中，如血液、尿液、唾液、咽试子、活体或尸检材料中得到用于诊断试验的样品，优选血液。本发明通过大量的实验，证明了SARS病人血清能测出抗X4蛋白抗体(参见实施例3和4)，SASR病毒转染的真核细胞膜上表达X4蛋白(参见实施例6)，从而，提供了一种体外检测严重急性呼吸道综合症的方法。
所述体外检测来自待测样品的本发明的蛋白的方法是本领域技术人员已知的，例如，放射免疫法、竞争性结合法、免疫印迹法、ELISA及免疫荧光法等。在本发明的一个实施方式中，利用免疫荧光法体外检测待测样品中本发明所述的X4蛋白或其片段，优选间接免疫荧光试验或直接免疫荧光试验。在本发明实施例6中，利用荧光素标记的抗X4蛋白全长或其片段的单克隆抗体或多克隆抗体，检测外周血细胞膜的X4蛋白表达，或检测咽试子中X4蛋白的存在。体外检测待测样品中本发明所述的X4蛋白或其片段可能更具早期诊断价值，因抗原应该先于抗体产生。
由于X4抗原的出现先于病毒裂解宿主细胞，X4蛋白的特异性抗体可能早于病毒结构蛋白的特异性抗体的出现。因而，X4蛋白抗体具有很重要早期诊断价值(初步预实验已经证明X4抗体可以先于抗病毒结构蛋白抗体出现，参见实施例4)。所述体外检测待检样品中本发明X4蛋白或其片段的特异性抗体的方法是本领域技术人员已知的，例如，放射免疫法、竞争性结合法、免疫印迹法、ELISA及免疫荧光法等。在本发明的一个具体实施方式
中，采用免疫印迹法，检测不同发病时期病人血清中针对X4蛋白的IgG、IgM、IgA抗体，这些抗体的出现早于针对病毒结构蛋白抗体。作为本发明的抗原的蛋白可以是X4全长的氨基酸序列，也可以是其活性片段，如SEQ ID NO4所述的重组X4序列。在本发明的一个实施方式中，分别采用的全菌裂解物和含有如SEQ IDNO4所述的重组X4序列的纯化蛋白样品作为抗原，检测抗X4蛋白的特异性抗体的存在。在本发明的另一个实施方式中，利用酶联免疫吸附实验(ELISA间接法)，早期检测正常人和SARS患者血清中抗X4蛋白的抗体。
本发明还提供一种体外检测严重急性呼吸道综合症的试剂盒，其含有本发明X4蛋白或其片段，和/或X4蛋白或其片段的特异性抗体。
本发明对于SARS的诊断、治疗、以及发病机理的研究提供了新的思路。本发明的实验已经证明，SARS病毒感染细胞后，X4蛋白确实能在SARS病毒感染的早期出现，且在宿主细胞膜上表达(参见实施例6)，从而成为机体免疫系统攻击的早期目标，并且殃及宿主细胞，引发机体对病毒感染细胞的自身免疫损伤。X4蛋白的功能研究表明，重组的X4蛋白能够抑制Balb/C 3T3细胞的生长(参见实施例7)，说明宿主细胞表面的X4蛋白以及从细胞脱落的可溶性X4蛋白本身对宿主细胞有直接的病理作用，这可能与SARS疾病的进展和疾病的恢复密切相关。本发明的研究对SARS免疫病理机制的研究具有重要的理论意义，同时也具有针对性治疗意义。例如，采用X4蛋白的拮抗剂可以抑制X4蛋白的功能，从而阻断其生物学活性，达到治疗和/或辅助治疗的目的。
图1显示pGEX-X4表达质粒构建示意图。
图2显示X4蛋白的PCR产物结果图。其中，1DL2000分子量标准；2X4蛋白的PCR产物。
图3显示pGEM-X4鉴定结果图。其中，1和4DL2000分子量标准；2pGEM-X4-1 PCR鉴定；3pGEM-X4-2 PCR鉴定；5pGEM-X4-1酶切鉴定；6pGEM-X4-2酶切鉴定。
图4为经过BamHI-SalI酶切的pGEX-4T-1和pGEM-X4。其中，1λ-HindIII分子量标准；2BamHI-SalI切的pGEX-4T-1；3BamHI-SalI切的X4片段；4DL2 000分子量标准。
图5为pGEX-X4的BamHI-SalI双酶切结果。其中，1DL2000分子量标准；2-5pGEX-X4的4个不同克隆。
图6为pGEX-X4(DH5α)诱导表达后的SDS-PAGE图。其中11-4和5-9单独诱导的个克�。�5蛋白分子量标准；10诱导前样品。
图7为IPTG诱导后，收获的包涵体进行的SDS-PAGE图。其中，1分子量标准；2诱导1小时；3诱导2小时；4诱导3小时；5诱导4小时；6诱导前。
图8为柱层析后，目的蛋白的SDS-PAGE图。其中，1分子量标准；210％NaCl洗脱峰310％NaCl洗脱峰；4包涵体；5诱导后的菌；6诱导前的菌；7空载体诱导。
图9A-图9C分别为pGEX-X4(DH5α)全菌裂解物电泳后与三个康复期病人血清进行Western-blot结果示意图。
图10A为全菌裂解物和纯化的GST-X4蛋白与急性期病人血清做Western-blot结果示意图；图10B为全菌裂解物和纯化的GST-X4蛋白与康复期病人做Western-blot结果示意图。其中，1为pGEX-4T-1(DH5α)诱导后样品(对照)；2为pGEX-X4(DH5α)诱导后样品；3为纯化的GST-X4蛋白样品。
图11为不同克隆的鼠抗X4蛋白的单克隆抗体与重组的X4蛋白反应的Western-blot结果示意图。8A5、4A2、8H6分别代表分泌抗X4蛋白的单克隆抗体的不同克隆株，阳性对照为鼠抗X4蛋白多克隆抗体。
图12为间接免疫荧光检测X4蛋白在SARS病毒感染VERO-E6细胞后表达和定位的示意图。其中A对照；B-E分别为SARS病毒感染Vero E6细胞系8小时、16小时、30小时、40小时和48小时后，间接免疫荧光试验结果。
图13为重组X4蛋白抑制Balb/C 3T3细胞生长的结果示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用试剂如未标明，则为Sigma公司产品或为国产分析纯生化试剂。
实施例1 X4蛋白在大肠杆菌中的表达一、方法1、DNA的酶切、连接、转化等均为常规分子生物学操作。构建流程示意图参见图1。
2、X4蛋白基因的全合成根据生物信息学分析的结果，X4蛋白基因序列如SEQ NO.1所示。去掉信号肽、跨膜区、膜外区，并针对大肠杆菌修改了一些密码子之后的序列如SEQ NO.3所示。根据此序列，合成互补的4个片段，并利用片段互补PCR技术扩增出了用于大肠杆菌表达的X4基因片段，具体方法如下PCR反应体系Pyrobest DNA聚合酶(购自TAKARA公司)0.4ul10×Pyrobest Buffer10ul dNTP(2.5mM)8ulX1(SEQ NO.5)0.5ulX2(SEQ NO.6)0.5ulX3(SEQ NO.7)0.5ulX4(SEQ NO.8)0.5ulX5-1(SEQ NO.9)3ulX3-1(SEQ NO.10)3ulH2O73.6ulX15′--ATgTATCACTATCAggAgTgCgTTCgCggTACgACCgTTCTACTCAAAgAACCgTgCCCgTCCggCACgTACgAAggCA--3′(SEQ ID NO5)X25′--gTgggTgCTggTgCAggTCAgTgCAAATTTgTTgTCAgCCAgCgggTgAAATggggAgTTgCCTTCgTACgTgCCggAC--3′(SEQ ID NO6)X35′--TgACCTgCACCAgCACCCACTTTgCTTTTgCTTgCgCTgACggTACCCGTCACACCTATCAgCTgCgTgCACgTTCCgT--3′(SEQ ID NO7)X45′--TTATggAgAgTACAgCTCCTgCTgAACCTCCTCCTgACggATgAACAgTTTCggggAAACggAACgTgCACgCAgCTg--3′(SEQ ID NO8)X5-15′--ggATCCTATCACTATCAggAg--3′(SEQ ID NO9)X3-15′--gTCgACTTATggAgAgTACAgCT--3′(SEQ ID NO10)所用核酸片段及PCR引物由北京赛百盛公司合成。
PCR扩增参数为94℃，1min；94℃，30s；60℃，45s；72℃，20s；25个循环；最后72℃延伸15min；在最后延伸前加入少许的普通Taq酶(购自鼎国生物)和dATP(PCR产物加A末端)。跑电泳，并纯化出260bp左右的片段。PCR结果如图2所示。
3、PCR产物克隆、测序将纯化的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，并提取质粒，用BamHI-SalI双酶切和PCR方法进行鉴定(鉴定结果见图3)，并阳性克隆测序获得序列正确的克隆。
4、pGEX-X4表达质粒的构建将质粒载体pGEX-4T-1(购自AmershamPharmacia Biotechp)和序列正确的pGEM-X4分别用BamHI、SalI(均购自TAKARA公司)双酶切，采用DNA片段快速回收试剂盒(购自鼎国生物)回收片段(参见图4)，并进行连接；转化XL1-Blue(购自鼎国生物)感受态细胞后采用质�？焖偬崛∈约梁�(购自博大泰克)提取质粒，用酶切方法鉴定阳性克隆(参见图5)，获得pGEX-X4阳性质粒。
5、GST-X4融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达将构建好的pGEX-X4转化到DH5α(购自鼎国生物)感受态细胞中，挑取单克隆分别接种含有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养后，以1∶100分别稀释至含AMP(100mg/l)的LB培养基中，37℃振荡培养至OD值为0.4-0.6，加入诱导剂IPTG(购自Merck公司)至终浓度1mmol/L，37℃继续培养4小时后，4℃5000g10min离心收集菌体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测GST-X4的表达情况。融合蛋白的表达量，占大肠杆菌总可溶性蛋白的10％左右。pGEX-X4(DH5α)诱导表达后的SDS-PAGE可以参见图6。
6、表达产物的可溶性分析用Tris-HCl(pH8.5)20mmol/L的EDTA缓冲液悬浮经IPTG诱导的pGEX-X4的菌体，超声波破碎后，4℃10000g离心10min，分别收集上清液和沉淀。SDS-PAGE检测表达蛋白是否以可溶的形式存在。
二、结果用摇瓶培养工程菌株，在对数生长后期加入IPTG诱导，诱导4小时后，表达量达到10％以上。在诱导表达过程中，菌体浓度一直呈增长趋势。按上述优化的表达条件，用多个摇瓶分批培养。
实施例2 表达蛋白的分离纯化一、方法将表达的菌体收集后，用20mmol/LTris-HCl(pH8.5)5mmol/L的EDTA缓冲液悬�。痪ㄆ扑椋胄暮蟮某恋聿糠治炕�。
1、包涵体的洗涤洗涤缓冲液50mmol/LTris-HCl(pH8.5)5mmol/L的EDTA 1％TritonX-1001mol/L尿素缓冲液
2、包涵体变性将粗提后的样品溶解在尽量少的变性缓冲液(50mmol/L Tris-ClpH8.5，8mol/L尿素，1μl/mlβ-ME或10mmol/L DTT)中，37℃放置0.5-1小时，离心，去沉淀，上清即为包涵体变性液。
3、包涵体的复性将变性包涵体用复性液(20mmol/L Tris-HCl pH8.5)稀释10倍，室温复性4小时，加入凝血酶(2000U/ml)每1mg变性蛋白加20U凝血酶，室温复性过夜。
4、柱层析纯化采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(2.6cm*20cm)，20mmol/LTris-Cl pH8.5平衡5-10个柱床体积，将复性液上柱，用相同的缓冲液流洗至基线；然后改用含1M NaCl的20mmol/L Tris-Cl pH8.5缓冲液进行线性梯度洗脱，流速20ml/min，收集蛋白峰。
二、结果1、包涵体的分离和初步纯化目的蛋白在菌体中主要以包涵体形式表达，用含去污剂的缓冲液洗涤菌体裂解液，离心获得的沉淀，除去一部分杂蛋白。收获的包涵体经SDS-PAGE分析，纯度达到70％以上。
2、蛋白的变性和复性将10g(湿重)包涵体用100mL 8mol/L脲的缓冲液充分溶解，高速离心后，取上清用稀释法复性。
3、酶切结果按每毫克变性蛋白加20U的凝血酶(2000U/ml)。SDS-PAGE表明融合蛋白部分被全部切开。
4、柱层析纯化结果复性液采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱线性梯度洗脱，10％NaCl梯度时出现一个洗脱峰。经SDS-PAGE分析，为目的蛋白峰，纯度达到95％以上。结果参见图7、图8。
实施例3免疫印迹检测血清中抗X4蛋白的特异性抗体一、试剂1)电转液(15.6mmol/L Tris-HCl 120mmol/L甘氨酸pH8.4)2)封闭液(5％牛血清白蛋白)3)碱性磷酸酶显色液(100mmol/L NaCl 50mmol/L MgCl2100mmol/LTris-HCl pH9.5)4)2，5-二溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)5)氮蓝四锉(NBT)6)一抗(患者血清)，二抗(碱性磷酸酶标记抗人IgG)7)TBST(10mmol/L Tris-HCl 150mmolNaCl 0.1％Tween 20)二、方法(一)pGEX-X4(DH5α)全菌裂解物与三个康复期病人血清进行Western-blot1、pGEX-X4(DH5α)全菌裂解物，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳跑2/3下胶，量胶的长度宽度，浸入电转液中10min。
2、按胶的大小剪硝酸纤维膜，滤纸(稍大)6层，也浸入电转液中。
3、用半转干仪器先放三层滤纸，放中不要有气泡。
4、电压22V 160A 20min开始。
5、5％脱脂粉浸泡，4℃封闭，过夜。
6、分别加入三个康复期病人血清(K1、k2和K3)(即理论上一抗)+TBST+0.1％Tween20(1∶5000)2h。
7、TBST+0.1％Tween 20洗3次/10min。
8、加入二抗+TBST+0.1％Tween20(1∶7500)2h。
9、TBST+0.1％Tween 20洗3次/10min。
10、66μl氮蓝四锉(NBT)溶液同10ml碱性磷酸酶显色液充分混匀后加入33μl 2，5-二溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)溶液，显色。
(二)全菌裂解物和纯化的GST-X4蛋白与急性期和康复期病人血清做Western-blot1、分别以全菌裂解物和纯化的GST-X4蛋白作为抗原，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳跑2/3下胶，量胶的长度宽度，浸入电转液中10min。
2、按胶的大小剪硝酸纤维膜，滤纸(稍大)6层，也浸入电转液中。
3、用半转干仪器先放三层滤纸，放中不要有气泡。
4、电压22V 160A 20min开始。
5、5％脱脂粉浸泡，4℃封闭，过夜。
6、分别加入急性期和康复期病人血清(即理论上一抗)+TBST+0.1％Tween20(1∶5000)2h。
7、TBST+0.1％Tween 20洗3次/10min。
8、加入二抗+TBST+0.1％Tween20(1∶7500)2h。
9、TBST+0.1％Tween 20洗3次/10min。
10、66μl氮蓝四锉(NBT)溶液同10ml碱性磷酸酶显色液充分混匀后加入33μl 2，5-二溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)溶液，显色。
二、结果1、pGEX-X4(DH5α)全菌裂解物与三个康复期病人血清进行Western-blot实验结果显示(参见图9A-图9C)，在康复期病人血清中可以检测到抗X4蛋白的特异性抗体存在。
2、全菌裂解物和纯化的GST-X4蛋白与急性期和康复期病人血清做Western-blot结果参见图10A和图10B，实验结果显示，急性期病人血清和康复期病人血清中可以检测到抗X4蛋白的抗体，而且与全菌裂解物中GST-X4和纯化的GST-X4结合，两例病人血清中均产生了抗X4蛋白的抗体。
实施例4 利用酶联免疫吸附实验(ELISA间接法)，早期检测正常人和SARS患者血清中抗X4蛋白的抗体一、试剂1)包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH9.6)2)封闭液(5％牛血清白蛋白/PBS溶液)3)洗涤液(PBS-T PH7.4)4)标本稀释液(PBS，PH7.4)5)酶标第二抗体(辣根酶标记抗人IgG)6)底物液A(OPD-H2O2溶液)A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)B液(0.2mol/LNa2HPO4)临用前取A液4.86ml+B液5.14ml混合，加入OPD(邻苯二胺)4mg，待充分溶解后加入30％(V/V)的H2O250ml7)终止液(2mol/L H2SO4溶液)
二、方法1、包被pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液稀释至5ug/ml 150ul/孔，置于4℃过夜。
2、次日洗涤3次/孔，洗液为PBS-T。
3、封闭每孔加封闭液BSA，200ul/孔置37℃2小时。
4、稀释样品阴性对照为正常人血清；样品稀释度为1∶200，取60ul血清置于12ml PBS。
5、加样每孔150ul；空白对照加入样品稀释液(PBS)置于37℃1小时30分。
6、洗涤(1)5次/孔。洗涤液PBS-T。
(2)加入酶标抗体IgG 150ul/孔，空白加入稀释液，其中IgG为1∶500稀释，置于37℃1小时。
7、加入底物显色液(1)先洗涤5次/孔。
(2)加底物液(邻苯二胺)150ul/孔，底物液用前加入H2O2100ul/ml，避光显色15分钟，37℃。
8、终止加入150ul终止液(浓H2SO4)；在490nm处检测OD值，分析试验结果。
三、结果通过检测正常人和SARS患者血清中抗X4抗体，结果发现1、正常人血清中抗X4抗体为阴性；2、患者A，4月5日发�。�4月7日入院治疗，分别在4月10日、4月14日、4月22日进行血清抗体检测。用其他方法检测血清中的IgG抗体，4月22日为阳性，4月10日和4月14日为阴性，用本方法同样检测，4月10日和4月14日检测血清抗体为阳性，即入院治疗3天后即可检测出抗体阳性，比其他方法提前12天做出诊断；3、患者B，4月1日发�。�4月3日入院治疗，分别在4月7日、4月9日、4月21日、4月29日和5月6日进行血清抗体检测。用其他方法检测血清中的IgG抗体，4月21日、4月29日、5月6日为阳性，4月7日和4月9日为阴性，用本方法同样检测血清抗体，4月9日检测抗体为阳性，即入院治疗6天后即可检测出抗体阳性，也比其他方法提前12天做出诊断；4、用其他方法检测的SARS患者血清为阳性者，用本方法检测同样为阳性。
实施例5鼠抗X4蛋白单克隆抗体的制备一、方法1、动物免疫将重组X4蛋白与等体积的弗氏佐剂混合制成油包水乳剂，每只小鼠腹腔注射0.5ml上述混合液(含X4蛋白100μg)，共注射5只小鼠。两周后同剂量抗原加弗氏不完全佐剂加强免疫，7天后以间接ELISA(波长为490nm)检测小鼠血清X4蛋白多抗的效价，效价高者静脉再追加免疫1次，每只20μg，3天后进行细胞融合。
2、细胞融合将X4蛋白加强免疫的小鼠在3天后无菌取脾，制备成单个细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的比例在PEG1500作用下融合，融合按常规法，PEG用1ml，1分钟内缓慢加完，反应时间为90秒，无血清的RPMI 1640终止反应，1000rpm离心10min，HAT完全1640培养基调细胞浓度至1×106/ml，加入已预先铺有饲养细胞(Balb/c小鼠的腹腔M)的96孔平底板，100μl/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3天观察并换液，10天后以HT1640培养基换液，1周后换完全1640培养基。
3、间接ELISA法筛选以重组X4蛋白(1μg/ml)包被酶标96孔板，37℃反应2小时或4℃过夜；3％牛血清白蛋白(BSA)封闭，4℃过夜，加入待检杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1小时，SP2/0细胞培养上清为阴性对照；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 37℃孵育1小时；邻苯二胺(OPD)底物液显色10-15min，2M H2SO4终止反应。每步完成均用含0.05％Tween 20的PBS充分洗涤，ELISA Reader测OD490值。所测的OD490值比阴性对照高5倍的克隆，进行亚克隆化，并进行扩增冻存。
4、克隆化-采用有限稀释法细胞以含IL-6(300U/ml)的HT1640培养基稀释至每孔1个细胞，铺于U型96孔板，4小时内镜下观察每孔实际细胞数，记录单个细胞孔，待其长成克隆且ELISA鉴定抗体分泌呈阳性，即获得单抗分泌株，大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定之。
5、制备单抗腹水12周龄以上的Balb/c小鼠腹腔内注射0.5ml不完全弗氏佐剂，7天后每只小鼠腹腔内注射0.5ml含4×106的杂交瘤细胞，7-10天后视小鼠腹部膨胀程度收集腹水，4℃离心，2500rpm离心20min，上清放置-20℃分装保存备用。
二、结果利用重组的X4蛋白免疫小鼠，经2次细胞融合、克隆筛选和亚克隆化，建立了3株稳定分泌抗X4蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为8A5、4A2、8H6。免疫印迹实验证明这些杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能够与X4蛋白特异性结合(图11)，腹腔接种给Balb/c小鼠后可以形成肿瘤，并稳定地产生特异性抗体，腹水抗体的效价为1∶105(良1)。
表1间接ELISA检测小鼠腹水中X4单克隆抗体的滴度8A5 4A2 8H6 Sp2/01∶1031.5751.2251.3250.0451∶1040.4640.6120.4940.0561∶1050.1790.2200.1540.0731∶1060.1170.1120.0910.059实施例6鸡抗X4蛋白多克隆抗体的制备和间接免疫荧光实验一、方法1、鸡抗X4蛋白多克隆抗体的制备将纯化的重组X4蛋白100ug/只与等量的完全弗氏佐剂混合，多点注射在鸡的两侧胸大肌上，2～3周后，同剂量的X4蛋白加弗氏不完全佐剂加强注射，一周后鸡翅放血，利用间接EIISA检测鸡血清中X4多抗的效价。
2、间接免疫荧光试验检测X4蛋白在感染宿主细胞中的表达和定位将SARS病毒株F69感染Vero E6细胞系，取不同时间(8小时、16小时、30小时、40小时和48小时)感染的Vero E6细胞铺在洁净的载玻片上，-20℃丙酮固定30分钟，加入鸡抗X4蛋白的抗血清(1∶50)，37℃反应1小时，PBS洗3次，然后加入FITC标记的羊抗鸡IgY，37℃反应30分钟，PBS洗3次，共聚焦显微镜下观察X4蛋白的表达和定位。
二、结果间接ELISA结果和免疫印迹的结果证明，鸡抗X4蛋白的多克隆抗体能够特异识别重组的X4蛋白，该抗体可以用于ELISA、Western Blot以及免疫荧光试验。间接免疫荧光的结果证明，X4蛋白主要表达在SARS病毒感染的宿主细胞膜的表面，且在感染的早期(感染8小时)即有表达，部分细胞的胞浆中也有表达(见图12)。说明SARS病毒感染宿主细胞后，X4蛋白能够转录并在细胞膜的表面表达，利用X4抗体能够检测到细胞膜表面的X4蛋白。
实施例7利用MTT实验检测X4蛋白的抑制细胞生长活性一、方法将正常培养的Balb/C 3T3细胞铺在96孔板中(2000细胞/孔)，分别加入不同浓度的重组X4蛋白(0.156μg/ml，0.312μg/ml，0.625μg/ml，1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml)，每个蛋白浓度设3个重复孔。培养4天后，每孔加入终浓度为0.5mg/ml的MTT试剂，继续培养5小时后，用ELISA自动分析仪570nm波长下测定光吸收值(OD570nm)。
二、结果MTT分析的结果证明(见图13)，重组X4蛋白能够明显抑制Balb/C 3T3细胞的生长，并呈浓度依赖性关系。
宿主细胞表面的X4蛋白以及从细胞脱落的可溶性X4蛋白本身对宿主细胞有直接的病理作用，这可能与SARS疾病的进展和疾病的恢复密切相关。本发明的研究对SARS免疫病理机制的研究具有重要的理论意义，同时也具有针对性治疗意义。例如，采用X4蛋白的拮抗剂可以抑制X4蛋白的功能，从而阻断其生物学活性，达到治疗和/或辅助治疗的目的。
应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。
序列表<110>北京大学北京北医联合生物工程有限公司北京地坛医院<120>新的严重急性呼吸道综合症冠状病毒蛋白及其抗体和应用<130>D0403056F<150>CN 03142562.3<151>2003-06-16<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>369<212>DNA<213>SARS病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(366)<223>
<400>1atg aaa att att ctc ttc ctg aca ttg att gta ttt aca tct tgc gag48Met Lys Ile Ile Leu Phe Leu Thr Leu Ile Val Phe Thr Ser Cys Glu1 5 10 15cta tat cac tat cag gag tgt gtt aga ggt acg act gta cta cta aaa96Leu Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys20 25 30gaa cct tgc cca tca gga aca tac gag ggc aat tca cca ttt cac cct144Glu Pro Cys Pro Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro35 40 45ctt gct gac aat aaa ttt gca cta act tgc act agc aca cac ttt gct192Leu Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Thr Ser Thr His Phe Ala50 55 60ttt gct tgt gct gac ggt act cga cat acc tat cag ctg cgt gca aga240Phe Ala Cys Ala Asp Gly Thr Arg His Thr Tyr Gln Leu Arg Ala Arg65 70 75 80tca gtt tca cca aaa ctt ttc atc aga caa gag gag gtt caa caa gag288
Ser Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Gln Glu85 90 95ctc tac tcg cca ctt ttt ctc att gtt gct gct cta gta ttt tta ata336Leu Tyr Ser Pro Leu Phe Leu Ile Val Ala Ala Leu Val Phe Leu Ile100 105 110ctt tgc ttc acc att aag aga aag aca gaa tga369Leu Cys Phe Thr Ile Lys Arg Lys Thr Glu115 120<210>2<211>122<212>PRT<213>SARS病毒<400>2Met Lys Ile Ile Leu Phe Leu Thr Leu Ile Val Phe Thr Ser Cys Glu1 5 10 15Leu Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys20 25 30Glu Pro Cys Pro Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro35 40 45Leu Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Thr Ser Thr His Phe Ala50 55 60Phe Ala Cys Ala Asp Gly Thr Arg His Thr Tyr Gln Leu Arg Ala Arg65 70 75 80Ser Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Gln Glu85 90 95Leu Tyr Ser Pro Leu Phe Leu Ile Val Ala Ala Leu Val Phe Leu Ile100 105 110Leu Cys Phe Thr Ile Lys Arg Lys Thr Glu115 120<210>3<211>252<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>重组X4蛋白<220>
<221>CDS<222>(1)..(249)<223>
<400>3tat cac tat cag gag tgc gtt cgc ggt acg acc gtt cta ctc aaa gaa48Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys Glu1 5 10 15ccg tgc ccg tcc ggc acg tac gaa ggc aac tcc cca ttt cac ccg ctg96Pro Cys Pro Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro Leu20 25 30gct gac aac aaa ttt gca ctg acc tgc acc agc acc cac ttt gct ttt144Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Thr Ser Thr His Phe Ala Phe35 40 45gct tgc gct gac ggt acc cgt cac acc tat cag ctg cgt gca cgt tcc192Ala Cys Ala Asp Gly Thr Arg His Thr Tyr Gln Leu Arg Ala Arg Ser50 55 60gtt tcc ccg aaa ctg ttc atc cgt cag gag gag gtt cag cag gag ctg240Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Gln Glu Leu65 70 75 80tac tct cca taa252Tyr Ser Pro<210>4<211>83<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组X4蛋白<400>4Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys Glu1 5 10 15Pro Cys Pro Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro Leu20 25 30
Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Thr Ser Thr His Phe Ala Phe35 40 45Ala Cys Ala Asp Gly Thr Arg His Thr Tyr Gln Leu Arg Ala Arg Ser50 55 60Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Gln Glu Leu65 70 75 80Tyr Ser Pro<210>5<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于合成重组X4蛋白的片段X1<400>5atgtatcact atcaggagtg cgttcgcggt acgaccgttc tactcaaaga accgtgcccg60tccggcacgt acgaaggca 79<210>6<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于合成重组X4蛋白的片段X2<400>6gtgggtgctg gtgcaggtca gtgcaaattt gttgtcagcc agcgggtgaa atggggagtt60gcct tcgtac gtgccggac79<210>7<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于合成重组X4蛋白的片段X3
<400>7tgacctgcac cagcacccac tttgcttttg cttgcgctga cggtacccgt cacacctatc60agctgcgtgc acgttccgt 79<210>8<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于合成重组X4蛋白的片段X4<400>8ttatggagag tacagctcct gctgaacctc ctcctgacgg atgaacagt ttcggggaaac 60ggaacgtgca cgcagctg 78<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物X5-1<400>9ggatcctatc actatcagga g 21<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物X3-1<400>10gtcgacttat ggagagtaca gct2权利要求
1.一种分离的蛋白，该蛋白包含如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或其片段。
2.如权利要求1所述的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.如权利要求2所述的蛋白，该蛋白由如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列编码。
4.根据权利要求1所述的蛋白，该蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
5.如权利要求4所述的蛋白，该蛋白片段由如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列编码。
6.一种单克隆抗体或多克隆抗体，该单克隆抗体或多克隆抗体与权利要求1-5任一项所述的蛋白特异性结合。
7.一段分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含选自(1)编码如SEQ ID NO2所示蛋白或其片段的多核苷酸；(2)如(1)所述的多核苷酸序列的互补序列。
8.如权利要求7所述的多核苷酸，其核苷酸序列为如SEQ ID NO1所示或为其互补序列。
9.如权利要求7所述的多核苷酸，其核苷酸序列为如SEQ ID NO3所示或为其互补序列。
10.一种检测如权利要求1-5任一项所述的蛋白的方法，该方法为免疫荧光方法或ELISA方法。
11.一种检测如权利要求1-5任一项所述的蛋白的特异性抗体的方法，该方法为利用如权利要求1-5任一项所述的蛋白采用免疫印迹法或ELISA方法检测。
12.一种体外检测严重急性呼吸道综合症的方法，其为体外检测待测样品中权利要求1-5任一项所述的蛋白，和/或体外检测待测样品中权利要求1-5任一项所述的蛋白的特异性抗体。
13.一种检测严重急性呼吸道综合症的试剂盒，其含有如权利要求1-5任一项所述蛋白，和/或如权利要求1-5任一项所述蛋白的特异性抗体。
全文摘要
本发明涉及一种新的严重急性呼吸道综合症冠状病毒X4蛋白及其片段，编码该蛋白及其片段的核苷酸序列，以及该蛋白及其片段的特异性单克隆抗体和多克隆抗体。本发明还涉及一种体外检测严重急性呼吸道综合症的方法，其为体外检测待测样品中本发明的X4蛋白或其片段，和/或体外检测本发明X4蛋白或其片段的特异性抗体。本发明进一步提供一种试剂盒，其含有本发明X4蛋白或其片段，和/或本发明X4蛋白或其片段的特异性抗体。本发明对于SARS的诊断、治疗以及发病机理的研究提供了新的思路。
文档编号G01N33/68GK1572799SQ20041004604
公开日2005年2月2日 申请日期2004年6月1日 优先权日2003年6月16日
发明者马大龙, 陈英玉, 双宝, 刘顺爱, 韩普, 朱仁英, 宋泉声, 张剑平 申请人:北京大学, 北京北医联合生物工程有限公司, 北京地坛医院
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