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专利名称：利用拉曼光谱检测液体制剂的方法
技术领域：
本发明涉及光谱分析领域，具体地，涉及一种利用拉曼光谱检测液体制剂的方法。
背景技术：
为了快速筛查假冒伪劣注射液，希望能够直接对包装瓶内的液体制剂的活性药物成分(API)和辅料进行无损鉴别，而不用破坏包装取出样品。由于近红外光谱是吸收光谱，因此对于澄清的液体通常以透射或者透反射方式测量。而测量的光程取决于注射液包装瓶的直径，通常由于液体制剂包装瓶都较大(从ImL到500mL),因此导致测量的光程太大而不能获得需要的近红外光谱。因此对于液体制剂，特别是较大规格的包装，近红外技术无法作为一种通用的解决方案。中红外光谱能够采用ATR附件有效地分析液体样品。中红外谱区具有很高的吸收效率，因此测试时测量的光程通常只有几个微米。而包装瓶的壁厚从零点几毫米到几个毫米不等，因此中红外ATR技术不能穿透瓶壁实现无损检测，样品需要从包装中取出。拉曼光谱是一种散射技术，当一束激光照射到样品上会发生散射，大部分的散射光的能量不会发生变化。只有一小部分散射光(只占总量的10-6以下)的能量发生了变化，这部分变化的能量对应于分子的特征振动。拉曼测试的采样点位于激光束的焦点，使用不同的光学设计，聚焦长度能够在几毫米或者更长的范围内变化。因此拉曼光谱可以通过选择合适的焦长的光纤探头，来实现物体的无损测量。因此，拉曼光谱技术是透过包装无损鉴别液体制剂的最好的、也可能是唯一的选择。若能很好地运用拉曼光谱技术，建立定性定量模型，透过包装无损鉴别液体制剂，将会有十分广阔的应用前景。

发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种利用拉曼光谱检测液体制剂的方法。本发明提供的利用拉曼光谱检测液体制剂的方法，包括以下步骤I)获得本方法所需的各拉曼光谱，包括对水进行拉曼检测，得到其拉曼光谱，以W表示；对空的液体制剂包装进行拉曼检测，得到其拉曼光谱，以B表示；对带有包装的液体制剂进行拉曼检测，得到其拉曼光谱，以DWB表示；通过光谱差减的方式获得液体制剂中活性成分的拉曼光谱，以D表示；对液体制剂中活性成分标准品的水溶液进行拉曼检测，得到包含有活性成分和水的参考拉曼光谱，以RDW表示；通过光谱差减的方式获得液体制剂中活性成分的参考拉曼光谱，以RD表示；对液体制剂中辅料对照品的水溶液进行拉曼检测，得到包含有辅料和水的参考拉曼光谱，以REW表示；通过光谱差减的方式获得液体制剂中辅料的参考拉曼光谱，以RE表示；2)定性鉴别将液体制剂中活性成分的拉曼光谱(D)和参考拉曼光谱(RD)进行对比，计算二者的相关系数，根据相关系数对液体制剂中的活性成分进行定性鉴别；
3)定量计算液体制剂中各组分的浓度。其中，步骤I)中，液体制剂中活性成分的拉曼光谱差减拟合的公式为D=a*DWB-b*W_c*B,其中a, b, c均为差减拟合系数。其中，步骤I)中，液体制剂中活性成分的参考拉曼光谱差减拟合的公式为RD=d*RDW-f*W，其中d，f为差减拟合系数。其中，步骤I)中，液体制剂中辅料的参考拉曼光谱差减拟合的公式为RE=g*REW-h*W，其中g，h均为差减拟合系数。其中，步骤2)中，根据相关系数阈值判断液体制剂的真伪，大于或等于该阈值的为可鉴别为该液体制剂的活性成分物质，小于该阈值的为不能鉴别为该液体制剂的活性成分物质；其中，步骤2)中，根据同一药品不同批次或者不同厂家的相关系数的变化来设定所述相关系数阈值。其中，步骤2)中，所述相关系数阈值用不同成分但结构相似液体制剂的相关系数进行反向验证。其中，步骤3)中，液体制剂中各组分浓度的计算公式如下··C未知浓度=(P已知浓度/p未知浓度己知浓度；其中C未知浓度为未知浓度的液体制剂中各组分的浓度，C己知浓度为已知浓度的液体制剂中各组分的浓度，P 为未知浓度`的液体制剂中各组分的P值，已知浓度的液体制剂中各组分的P值。当检测液体制剂中的活性成分时，P_ 和 均可以用以下公式进行计算P API=I / J ;当检测液体制剂中的辅料时，P 和1均可以用以下公式进行计算=Pflm=l/j ;当获得已知浓度液体制剂的步骤I)所述各拉曼光谱时，分别计算得到活性成分和辅料相应的P已知浓度;当检测获得未知浓度液体制剂的步骤I)所述各拉曼光谱时，分别计算得到活性成分和辅料相应的其中，1、j和I分别为步骤I)中拉曼光谱RD、W和RE的拉曼信号强度系数，通过经典最小二乘法使残差e最小来获得，所述残差e=DWB-1*RD-j*W-k*B-l*RE，k为步骤I)中拉曼光谱B的拉曼信号强度系数。其中，本发明所述的液体制剂包括注射液，口服液体制剂，外用液体制剂等。其中,本发明所述液体制剂的包装包括包装瓶或包装袋等。其中，本发明可用来检测含有结构确认的活性成分的液体制剂。本发明运用拉曼光谱技术，建立定性定量模型，透过包装无损鉴别液体制剂。在检测过程中，将API标准品溶于水溶液进行测试，再差减掉水的信号得到拉曼参考光谱，得到稳定可靠的光谱和数据。并且，在本发明方法中，选择液体制剂中的水作为内标，很好地解决了当激光强度发生改变、不同探头或者测试光路发生改变，同一样品的拉曼信号也会相应改变的问题。总之，本发明与现有技术相比，很好地运用拉曼光谱技术进行液体制剂的无损检测，并解决了诸多技术问题，将会有十分广阔的应用前景。


图1 :按实施例1，透过安瓿瓶测得的多索茶碱注射液的拉曼光谱(DWB);空安瓿瓶的拉曼光谱(B);纯水的拉曼光谱(W);纯多索茶碱(API)的光谱(D)。
图2 :按实施例1，多索茶碱API标准品水溶液置于比色皿中的拉曼光谱(RDW);纯水的拉曼光谱(W);差减得到的多索茶碱(API)标准光谱(RD)。图3 :按实施例2，透过玻璃瓶测得的葡萄糖酸锌口服液的拉曼光谱(DWB);空玻璃瓶的拉曼光谱(B);纯水的拉曼光谱(W);纯葡萄糖酸锌(API)的拉曼光谱(D);纯蔗糖(辅料)的拉曼光谱(RE)。图4 :按实施例2，葡萄糖酸锌(API)标准品水溶液置于比色皿中的拉曼光谱(RDff);纯水的拉曼光谱(W);差减得到的葡萄糖酸锌(API)标准光谱(RD)。图5 :按实施例2，蔗糖(辅料)标准品水溶液置于比色皿中的拉曼光谱(RDW)JbK的拉曼光谱(W)差减得到的蔗糖(辅料)标准光谱(RD)。图6 :按实施例3，透过包装袋测得的多索茶碱葡萄糖大输液的拉曼光谱(DWB)，空白包装袋的拉曼光谱(B)，纯水的拉曼光谱(W)，纯葡萄糖(辅料)的拉曼光谱(RE)，纯多索茶碱(API)的拉曼光谱(RD)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明中的API即指液体制剂中的活性成分。本发明可以对液体制剂进行无损检测1、建立模型所需的光谱一张透过包装瓶无损测得的液体制剂的拉曼光谱中，包括了来源于有效成分(API)、辅料、水和包装瓶的拉曼信号。为了鉴别API或者辅料，需要把来源于API和辅料的拉曼信号分别从整体的拉曼光谱中分离开。(I)首先需要获得纯水、玻璃瓶的光谱a.将纯水倒入比色皿中进行拉曼检测，测得纯水的拉曼光谱(以W表示)；b.将空的包装瓶直接进行拉曼检测，得到空的安瓿瓶或者玻璃瓶的拉曼光谱(以B表示)。(2)此外，需要获得一张包含AP1、水、包装瓶的整体拉曼光谱即透过包装瓶(装有液体制剂)进行拉曼测试得到一张无损检测的拉曼光谱(以DWB表示)。(3)最后，需要获得API或者API标准物质(API参考拉曼光谱)的光谱及相应辅料的参考拉曼光谱a. API的拉曼光谱(以D表示)，可以通过光谱差减的方法获得；b.将API标准品配置成浓度相当的水溶液，然后盛放在比色皿中进行拉曼测试，得到包含有API标准品和水的拉曼信号的光谱，以RDW表示；按同样方式获得辅料标准品水溶液的参考拉曼光谱，以REW表示；c.API参考拉曼光谱(以RD表示)以及辅料的参考拉曼光谱(以RE表示)，可以通过光谱差减的方式得到。需要说明的是，通常API标准品的状态为固态，而固态时测得的拉曼光谱不能直接在本发明的方法中使用，这是因为物质溶于水溶液中的拉曼光谱和其处于固态时的拉曼光谱是不同的，特别是对于结晶态的物质，因此需要将API标准品溶于水溶液进行测试，再差减掉水的信号得到拉曼参考光谱。可以采用两种方法获得API标准品的拉曼光谱，一是当API标准品容易获得时，将其溶于水溶液进行测试，然后差减掉水的信号；二是如果API标准品难于获得或者价格昂贵时，可以将经过其他方法检测认证过的液体制剂样品取出倒入比色皿中进行测试，然后差减掉其中水的信号和辅料的信号。2、API的拉曼光谱和API标准品参考拉曼光谱的获取根据下列公式进行光谱差减拟合D=a*DWB - b*W - c*B公式①RD=d*RDW - f*ff公式②其中a, b, c, d, f均为差减拟合系数。由此，分别获得了液体制剂样品中API的拉曼光谱和API标准物质的参考拉曼光
-1'TfeP曰。3、定性鉴别接下来需要将这两个光谱(RD及D)进行对比，例如，计算二者的相关系数(correlation coefficients, R)0根据正向验证结果和反向验证结果设定合适的相关系数阈值，来对液体制剂进行鉴别；大于或等于该阈值的为鉴别为该品种，小于该阈值的为不能鉴别为该品种(大于或等于该阈值，表示能够定性为所检测液体制剂中含有该药物品种的API物质)。实际检测中 ，纯水和包装瓶的拉曼光谱具有通用性，即对于多种液体制剂的检测并不需要每次进行纯水和包装瓶的检测，因此实际检测中只需要进行一次测量，即透过包装瓶进行拉曼测试得到一张无损检测的拉曼光谱(以DWB表示)。阈值的设定定性鉴别标准即阈值的设定方法有很多种，例如最常用的方法是可根据同一药品不同批次或者不同厂家的相关系数(正向验证)的变化来设定定性的相关系数阈值。另外，所得的阈值应再用不同成分但最好结构相似液体制剂的相关系数进行验证(反向验证)。也就是，同一药品但不同批次或者不同厂家的相关系数要大于或等于阈值(即均为可以鉴别为该药物品种)，而不同成分液体制剂的相关系数要小于阈值。接下来，浓度的测试基于定性鉴别的结果，如果鉴别的结果为肯定的(即可以鉴别为该药物品种)，则进行浓度的计算。4、定量计算API浓度拉曼光谱的定量测试相比于中红外和近红外光谱方法，存在的一个问题就是拉曼光谱是绝对测量值。当激光强度发生改变、不同探头或者测试光路发生改变，同一样品的拉曼信号也会相应改变。可以使用内标或者外标法来解决这一问题。在本发明方法中，选择液体制剂中的水作为内标，很好地解决了这一问题。拉曼光谱在CCD检测器的线性相应范围内符合下面公式表示的光谱与各组分的关系DWB-1*RD-j*W-k*B-l*RE=e公式③这里，e表示残差；i，j, k，I分别为光谱RD，W，B, RE在整体光谱中拉曼信号强度系数，光谱RD，W，B，RE分别代表API参考拉曼光谱及水、空包装瓶和辅料的拉曼光谱，其中i，j，I亦做为API，水，辅料的浓度因子，用于后述定量计算。i，j，k，l可以通过经典最小二乘法(classic least squares, CLS算法)使残差e最小来获得。
溶液中某个组分(用组分η来表示，可能存在的组分有ΑΡΙ、辅料和水)的拉曼信号强度系数(Irn)与激光强度L、η组分的浓度(Cn)、拉曼散射系数rn和拉曼信号采集系数Cm)成正比(不管检测的是什么成分，m和L的数值是不变的)，可以表示如下Irn=m*L*rn*Cn公式④则公式③中AP1、水和辅料的浓度因子(拉曼信号强度系数)i, j, I可表示为API的拉曼信号强度系数i=IrAPI=m*L*rAPI*CAPI 公式⑤水的拉曼信号强度系数j = Ir水=m*L*r水*C水公式⑥辅料的拉曼彳目号强度系数1=Ιγ__ψ=πι*Ι^*;γ_*C_ 公式⑦以水作为内标，则可以消除激光强度(L)和拉曼信号采集系数(m)的影响，将公式⑤与公式⑥相除，得到P值PAPI=i/j=(rAPI/r 水)*(CAPI/C水) 公式⑧rAPI/r#与API和水的物质组成有关，因此理论上是一个常数。当液体制剂的浓度一定时，P值是定值，与入射激光能量及探头位置等仪·器因素无关。任何溶液均可通过公式③拟合计算获得P值。因此可以通过已知浓度的样品溶液，对未知液体制剂中的API浓度进行定量计算，这是解决拉曼光谱因为绝对测量而不易定量的问题的关键点之一。用已知浓度API样品溶液的P值(P 除以需要检测的液体制剂中API的p值(P未》度)(代入公式⑧中进行计算)，因已知浓度API样品溶液和需要检测的液体制剂的rAPI和r#相同，因此得到下面的公式Papi己知浓度/Papi未知浓度_ (Capi己知浓度/C水)/ (Capi未知浓度/C水) 公式⑨当已知浓度和未知浓度处于同一水平时，C#可近似视为常数，因此得到则Capi未知浓度-(Papi己知浓度/Papi未知浓度)*CAPI己知浓度公式⑩其中，已知浓度的API样品溶液可配制得到或参考药典或各标准的方法测定得到，Capi已知浓度为API样品溶液的已知浓度，Capi未嫌度则为需要检测的液体制剂中API的浓度。同理，若要测得液体中辅料的浓度，按上述同样方式将公式⑦和公式⑥相除，得到辅料的P值(可用Pim表示)，然后再通过配制已知浓度的辅料样品溶液，与公式⑨和公式⑩同理，计算得到未知浓度液体制剂中辅料的浓度。需要说明的是有些液体制剂中可能并未添加辅料，其浓度因子接近于零。实施例1 :多索茶碱注射液的检测以多索茶碱注射液为例，采用光栅型拉曼光谱仪，785nm激光器，激光功率400mW，光纤探头测量，测量时间200s。按照具体实施方式
中描述的方法，得到关于多索茶碱以下拉曼光谱:W (纯水)、B (空包装瓶)、DWB (透过装有多索茶碱注射液的包装瓶，测得整体的无损拉曼光谱)、RDW (测得多索茶碱活性成分标准品配制而成的水溶液，得到包含多索茶碱活性成分标准品和水的拉曼光谱);再通过光谱差减的方式获得D和RD拉曼光谱(图1是根据公式①CLS模型计算所需的光谱；图2是根据公式②CLS模型计算所需的光谱)。利用上述光谱建立拉曼模型(先定性，后定量)，选取验证样品(如表I中的样品，五个样品来自于五个不同生产厂家)进行模型验证(即根据同一药品不同厂家的相关系数进行正向测试)，计算所得结果如下表I所示。其中除样品2含有少量的辅料外，其他厂家的样品均不含辅料。表I
权利要求
1.一种利用拉曼光谱检测液体制剂的方法，包括以下步骤1)获得本方法所需的各拉曼光谱，包括对水进行拉曼检测，得到其拉曼光谱，以W表示；对空的液体制剂包装进行拉曼检测，得到其拉曼光谱，以B表示；对带有包装的液体制剂进行拉曼检测，得到其拉曼光谱，以DWB表示；通过光谱差减的方式获得液体制剂中活性成分的拉曼光谱，以D表示；对液体制剂中活性成分标准品的水溶液进行拉曼检测，得到包含有活性成分和水的参考拉曼光谱，以RDW表示；通过光谱差减的方式获得液体制剂中活性成分的参考拉曼光谱，以RD表示；对液体制剂中辅料对照品的水溶液进行拉曼检测，得到包含有辅料和水的参考拉曼光谱，以REW表示；通过光谱差减的方式获得液体制剂中辅料的参考拉曼光谱，以RE表示；2)定性鉴别将液体制剂中活性成分的拉曼光谱和参考拉曼光谱进行对比，计算二者的相关系数，根据相关系数对液体制剂中的活性成分进行定性鉴别；3)定量计算液体制剂中各组分的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中，液体制剂中活性成分的拉曼光谱差减拟合的公式为D=a*DWB - b*W-c*B，液体制剂中活性成分的参考拉曼光谱差减拟合的公式为RD=d*RDW-f*W，液体制剂中辅料的参考拉曼光谱差减拟合的公式为RE=g*REW-h*W ;其中a, b，c，d，f，g, h均为差减拟合系数。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，根据相关系数阈值判断液体制剂的真伪，大于或等于该阈值的为可鉴别为该液体制剂的活性成分物质，小于该阈值的为不能鉴别为该液体制剂的活性成分物质。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，根据同一药品不同批次或者不同厂家的相关系数的变化来设定所述相关系数阈值。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述相关系数阈值用不同成分但结构相似液体制剂的相关系数进行反向验证。
6.根据权利要求f5任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，液体制剂中各组分浓度的计算公式如下C未知浓度=(P B知浓度/P未知浓度)*c己知浓度；其中C未知浓度为未知浓度的液体制剂中各组分的浓度，Cbmjs为已知浓度的液体制剂中各组分的浓度，P etoM为未知浓度的液体制剂中各组分的P值，P为已知浓度的液体制剂中各组分的P值。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当检测液体制剂中的活性成分时，P和P未》度均可以用以下公式进行计算PAPi=i/j ;当检测液体制剂中的辅料时，P 度和P未ω 均可以用以下公式进行计算当获得已知浓度液体制剂的步骤I)所述各拉曼光谱时，分别计算得到活性成分和辅料相应的P已知浓度;当检测获得未知浓度液体制剂的步骤I)所述各拉曼光谱时，分别计算得到活性成分和辅料相应的
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中1、j和I分别为步骤I)中拉曼光谱RD、W和RE的拉曼信号强度系数，通过经典最小二乘法使残差e最小来获得，所述残差e=DWB-1*RD-j*W-k*B-l*RE，k为步骤I)中拉曼光谱B的拉曼信号强度系数。
9.根据权利要求Γ8任意一项所述的方法，其特征在于，所述液体制剂包括注射液，口服液体制剂或外用液体制剂。
10.根据权利要求Γ9任意一项所述的方法，其特征在于，该方法用来检测含有结构确认的活性成分的液体制剂。
全文摘要
本发明涉及利用拉曼光谱检测液体制剂的方法，包括获得拉曼光谱纯水的拉曼光谱；空的液体制剂包装的拉曼光谱；带有包装的液体制剂的拉曼光谱；通过光谱差减获得液体制剂中活性成分的拉曼光谱；对液体制剂中活性成分标准品的水溶液进行拉曼检测，得到包含有活性成分和水的参考拉曼光谱；通过光谱差减的方式获得液体制剂中活性成分的参考拉曼光谱；对液体制剂中辅料对照品的水溶液进行拉曼检测，得到包含有辅料和水的参考拉曼光谱；通过光谱差减获得液体制剂中辅料的参考拉曼光谱；然后进行定性鉴别和定量计算。本发明与现有技术相比，很好地运用拉曼光谱技术进行液体制剂的无损检测，并解决了诸多技术问题，将会有十分广阔的应用前景。
文档编号G01N21/65GK103063648SQ201210593760
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者尹利辉, 赵瑜, 王军, 高延甲, 朱俐, 张学博 申请人:中国食品药品检定研究院