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专利名称：一种检测调节性t细胞免疫抑制功能的方法
一种检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法本发明涉及一种细胞检测方法技术领域，具体地说是一种检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法。调节T细胞，可以从自然调节性T细胞分化而来，也可以来自其他初始T细胞，表达CD25分子和R)xp3，其分化和发挥功能必需有特定细胞因子的参与。在维持外周免疫耐受，阻止自身免疫病的发生以及限制慢性炎症性疾病等方面起到重要的作用。如今测定调节性T细胞的免疫抑制功能常采用3H-TdR掺入法，原理为T淋巴细胞受ConA或PHA激活后，进入细胞周期有丝分裂。当进入细胞周期S期时，细胞合成DNA量明显增加，在培养基中加入氚(3H)标记的DNA前身物质胸腺嘧啶核苷(TdR)，则3H-TdR被作为合成DNA的原料被摄入细胞，掺入到新合成的DNA中。根据同位素掺入细胞的量可推测淋巴细胞对刺激物的应答水平。掺入的同位素3H经液体闪烁测量法测出，将;3H每分脉冲数(cpm)加以计算， 用不同公式表示结果。该方法不但需要专门的昂贵设备如液体闪烁仪、细胞收集仪和专门的试剂如β 液体闪烁液等，更重要的是同位素3Η可以造成对周围环境的放射性污染。本发明的目的就是要解决上述的不足，而提供一种检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法。为实现上述目的设计了一种检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法，其中该方法步骤包括1)纯化⑶4+Τ细胞并用PBS磷酸盐缓冲液洗涤；2) IO^M+T细胞重悬于500 μ 1预热的PBS磷酸盐缓冲液中；3)加入等体积CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，预热PBS磷酸盐缓冲液 5 μ M, CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂终浓度为2. 5 μ M ；4)室温孵育2分钟；5)加入等体积的胎牛血清，室温孵育1分钟；6)完全培养基洗涤3次，重新计数，加入96孔板培养5天；7)加入调节性T细胞，第5天时根据CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂的强弱检测其对反应细胞的抑制能力。所述室温孵育为避光条件。本发明的有益效果1.安全不需使用放射性同位素，不存在安全隐患；2.时间长标记的荧光可以维持长达数周之久；3.活体标记可以追踪细胞在体内的分裂增殖过程；
4.相关性高与H3掺入法结果一致，可代替后者；5.特定跟踪可以与细胞亚群特定抗体结合使用；6.简单操作简单，可靠；7.稳定进入细胞后荧光不受内环境影响；8.结果客观对细胞生理活动没有任何影响；9.经济实惠费用经济，效率高。

图1是本发明的方法步骤图；图2是本发明的细胞分裂增殖图；图3是本发明CFSE强度检测示意图；下面结合附图对本发明作以下进一步说明本发明的方法步骤包括8)纯化⑶4+T细胞并用PBS磷酸盐缓冲液洗涤；9) 107CD4+T细胞重悬于500 μ 1预热的PBS磷酸盐缓冲液中；10)加入等体积CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，预热PBS磷酸盐缓冲液 5 μ M, CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂终浓度为2. 5 μ M ；11)室温孵育2分钟，避光条件；12)加入等体积的胎牛血清，室温孵育1分钟，避光条件；13)完全培养基洗涤3次，重新计数，加入96孔板培养5天；14)加入调节性T细胞，第5天时根据CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂的强弱检测其对反应细胞的抑制能力。本发明的原理用荧光染料CFSE(羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂)标记T细胞，检测调节性T细胞对反应细胞的免疫抑制功能。CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。当CFSE以含有两个乙酸基团和一个 succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的 CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法，其中该方法步骤包括1)纯化⑶4+T细胞并用PBS磷酸盐缓冲液洗涤；2)107CD4+T细胞重悬于500 μ 1预热的PBS磷酸盐缓冲液中；3)加入等体积CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，预热PBS磷酸盐缓冲液5μ Μ, CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂终浓度为2. 5 μ M ；4)室温孵育2分钟；5)加入等体积的胎牛血清，室温孵育1分钟；6)完全培养基洗涤3次，重新计数，加入96孔板培养5天；7)加入调节性T细胞，第5天时根据CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂的强弱检测其对反应细胞的抑制能力。
2.如权利要求1所述的检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法，其特征在于所述室温孵育为避光条件。
全文摘要
本发明涉及一种检测调节性T细胞免疫抑制功能的方法，其中该方法步骤包括纯化CD4+T细胞并用PBS磷酸盐缓冲液洗涤；107CD4+T细胞重悬于500μl预热的PBS磷酸盐缓冲液中；加入等体积CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，预热PBS磷酸盐缓冲液5μM，CFSE羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂终浓度为2.5μM；室温孵育2分钟；加入等体积的胎牛血清，室温孵育1分钟；完全培养基洗涤3次，重新计数，加入96孔板培养5天；本发明的有益效果安全，标记的荧光可以维持长达数周之久；可以追踪细胞在体内的分裂增殖过程；相关性高；特定跟踪操作简单，可靠；稳定，结果客观，费用经济，效率高。
文档编号G01N21/64GK102288587SQ201110161298
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月15日 优先权日2011年6月15日
发明者顾鹏 申请人:顾鹏