专利名称：凝集素途径缺陷测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析补体系统。更具体地，本发明涉及一种在生理条件下功能性测定补体系统中的凝集素途径中的缺陷的方法以及试剂盒。
补体系统是先天免疫系统的一个复合部分，它包括许多相互作用的血浆蛋白质和跨膜蛋白质。术语先天免疫用以使这种类型的免疫区别于所定义的适应性免疫。然而，补体也在适应性免疫中起作用，但在这种联系中被了解甚少。
当被活化时，血清中出现的一系列可溶蛋白质辅助消除微生物和其它来自组织和来自血液的抗原。这是通过单独的补体成分，或通过随后它们与表达补体受体的细胞的相互作用来完成，所述补体受体诱发其它种类的免疫应答。
为了阻止宿主组织受到损害，补体系统必须进行严格调控。出现在血清中的或在细胞表面表达的大量蛋白质涉作为补体调节分子而涉及对宿主细胞的保护，在由抗原活化时控制补体，并且一旦抗原被清除则灭活补体。
作为宿主对致病生物体的主要防御组成部分，补体系统的活化对于抗入侵病原体的先天防御是至关重要的。在较高级的生物中，动物通过形成特异性的免疫反应而对由入侵生物的抗原性胁迫进行反应。形成抗体并产生具有识别特异性外来抗原能力的细胞。因此，除通过间接结合衔接子分子如抗体或急性期蛋白之外，补体还通过补体成分直接识别微生物表面来确定其目标。补体系统随后的活化通常最终通过体液和细胞机制而导致活化因子的清除。最佳宿主免疫性需要这些补体系统的功能。
例如，甘露糖结合聚集素(MBL)能够结合经常出现在许多临床相关微生物表面上的重复性糖类。MBL的这种直接结合涉及免疫系统对病原体的清除。通过MBL基因的遗传突变人们清楚地阐明了在抗入侵病原体的先天免疫中MBL的重要性。这些突变导致MBL分子结构异常，最终通过凝集素途径损害补体活化，这与传染易感性的增加相关。
补体系统的活化是宿主防御的重要部分。在感染后由补体成分直接结合到微生物表面诱发补体活化级联反应可以导致通过体液和细胞机制的调理作用并清除病原体。此外，补体活化可以诱导并扩大获得性免疫系统。
除在宿主防御抗感染中起重要作用以外，补体系统还是致病机制和防止免疫复合疾病之间的一个介质。在起抗适当病原体的温和作用时它具有保护作用，这是由于在没有适当控制时，补体活化引起的炎症同时可以导致细胞损害。
通过至少三种已知的活化途径可以诱发补体活化级联反应，例如，经典途径(CP)、旁路途径(AP)和凝集素途径(LP)。这三种途径集中于C3复合物上。补体途径末端由C3后活化的所有蛋白质组成，并最终在C5-9蛋白质组装配成膜攻击复合体(MAC)。MAC通过在细胞膜上穿孔起到有效的杀灭作用。
补体系统中的缺陷可以导致补体级联活化部分或全部阻断。依赖于缺陷水平，既可以阻碍补体活化诱导期也可以阻碍效应期，并且该缺陷可以影响不只一种途径。由于遗传缺陷或获得性补体成分缺陷，补体系统损害功能可能出现。后天性补体缺陷可能由于补体成分的自身抗体的形成或额外的补体消耗而发生。在系统的所有水平中已阐明遗传性的补体缺陷。
大多数补体缺陷都与疾病相关，范围从感染易感性的相对适度增加到严重的系统自身免疫症状的出现。而且，补体功能的损害与系统红斑狼疮(SLE)病人中红肿的出现相关联。因此，测量人体血清的补体活性的功能性测定有着明确的诊断和预后价值。
然而，过去几年中已经愈加清楚补体成分通过相似机制使自身组织损害。因此，补体导致组织损害和炎症的扩大，如自身免疫性疾病、免疫复合疾病、阿茨海默病和如发生在例如心肌梗塞、中风和重要外科手术中的缺血/再灌注损伤。例如，近来研究也提供证据，即由甘露聚糖结合凝集素活化凝集素途径可以引起补体活化和在缺血/再灌注损害以及心肌梗塞中的相关炎症。而且，补体活化对同种异体移植和异种移植物排斥的发病机理起作用。因而，不希望的补体活化出现在许多病理条件下的炎症和相关组织损害中。
很难准确地指出并在功能上鉴定补体系统中的缺陷。缺陷可以导致在补体级联反应中缺陷点上的阻断。通常，患有经典途径缺陷的病人沿途径进行到缺陷点为止，并且后面的级联蛋白质不能得以募集。另一方面，旁路途径异常的个体比经典途径变态的个体更少见，并且在一些情况下，仅对少数的异常个体进行过阐明。
凝集素途径的功能缺陷通常是归因于在MBL基因中的遗传性多态。在人类已阐明的补体缺陷中，MBL缺陷具有最高的频率。这些缺陷具有明确的临床意义，既增加感染的易感性又加快慢性疾病的进程。
补体级联中的缺陷能够导致不可抵抗的感染和败血症。补体中的缺陷主要通过两种机制使病人易于感染，例如无效的调理作用和溶细菌活性缺陷(MAC中的缺陷)。
一个实例是导致出现不充分调理作用的缺陷。调理作用是覆盖病原生物以便它更容易被巨噬细胞摄取的过程。补体蛋白质C3b，随同它的分裂产物C3bi，在补体级联反应中是潜在的调理剂。任何引起C3b产量减低的缺陷都会造成不足的调理能力。如调理缺陷可能由经典的、旁路的、或MBL途径的补体缺陷引起，或缺陷可能由C3复合物自身的缺陷引起。
主要通过使用溶血测定法测试补体功能，它能够分别进行经典补体途径和旁路补体途径的功能评价。在这些溶血测定法中，补体途径的功能表示成它在活化后产生C5b-9复合物的能力。这种测定目前不适于补体的凝集素途径。考虑到MBL缺陷在人类群体中的高频率，测试凝集素途径功能的可靠测定法是高度保证的。
通常，在血液中检测补体或其缺陷的方法是利用繁复的溶血性和抗原性手段来进行的。测试补体途径不同成分的增减水平。这些试验需要靶向性抗体，它会识别特异性的补体蛋白质。通常，血清或血浆中补体蛋白质的抗原性测试是最容易利用的试验，尤其是对于C3。在后面的检测中，提供了C3的血清水平，但它很少或几乎不能表明功能性活性。低功能变体存在，但没有描述过非功能性的C3变体。
在研究功能补体时，使用绵羊血红细胞，因为它们易为抗体和补体所裂解。对功能性补体活性最普遍进行的试验是CH50，它是一种病人血清的稀释物溶解涂有抗体的绵羊血红细胞的能力的测试。当例如经典途径的某一蛋白质缺失时，在CH50检测中的细胞溶解被阻断，缺陷蛋白质的功能滴定量接近0，而且得到的CH50为0。旁路途径溶细胞测试存在并称为AP50。该测试不如CH50灵敏并被用作筛选试验。
为了检测凝集素途径的功能性缺陷，采用这样一种方式来设计功能测定是很重要的，例如检测中抗体介导的经典途径活化不会干扰和造成假阳性结果。因为在人类群体中用作凝集素途径活化剂的针对MBL配体的抗糖类抗体是普遍的，而且因为这些抗体能够通过MBL缺陷血清中的经典途径导致补体的活化，故这是重要的。所以，可靠的功能性凝集素途径测定法应当避免经典补体途径的活化。
至今可用于检测凝集素途径中的缺陷的测定法仍有着严重的局限性，并且不能检测整个活化级联反应的功能性活性。通过利用在人工条件下的测试，它们或使用外源的补体(和仅检测MBL-MASP复合物的活性)或使用内源性的C4(但无随后的活化步骤)，所述的人工条件大大抑制了生理性的补体活化。
在Zimmermann-Nielsen等(Scand.J.Immunol.55105-110，2002)的一篇文章中，公开了一种在人血浆中量化补体系统的MBL诱导的活化的测定法。在此测定法中，将补体活化确定为自体同源的C4活化。使用高离子强度的稀释缓冲液(1M NaCl)作血清培育缓冲液阻断旁路途径的起始。
然而，1M NaCl的存在有力地阻碍C4对经典途径和凝集素途径的活化。因此，此测定法除了使它们高度无效不能真正区别上述两种途径。另外，这导致在此测定法中使用极高的血清浓度(1/5)的必要性，因为这些次优化的条件造成强烈抑制的补体活化，其接近检测极限。
因而，Zimmerman-Nielsen测定法中的补体活化不是在生理条件下测量的，并且提供的人工条件可能对不同来源血清和/或不同基因型MBL具有不同的影响。此外，在这种测定法中不可能在比C4更晚的状态评价补体活化，因为C4b2a的形成强烈依赖离子强度(Laich和Sim，BBA 154496-112，2001)，并且因此在1M NaCl中及在高血清浓度下完全不能检测到C3的活化。
因此，需要一种方法用于在生理条件下进行哺乳动物，包括人类的补体系统凝集素途径中的缺陷的功能性鉴定。这样的方法应当允许进行直至C5b-9形成的补体活化的完整凝集素途径的特定评价。
本发明的目的是获得一种体外功能性鉴定补体系统中的缺陷的方法，籍此上面提及的问题得以消除。
为达到该目的，提供了一种在生理条件下功能性测定补体系统凝集素途径中的缺陷的体外方法，该方法包括步骤(a)提供哺乳动物血液、血清、血浆或另一种体液的样品；(b)通过将样品与补体系统C1复合物分子的抑制剂相接触来阻止样品中经典途径的活化；(c)阻止样品中旁路途径的活化；(d)活化样品中的凝集素途径；和(e)测定样品中自体C5b-9复合物的任何活化。
本发明的目的还是制备功能性鉴定体液样品中的补体系统凝集素途径中的缺陷的试剂盒。
通过包含以下各项的试剂盒实现本发明目的(a)惰性载体和凝集素途径活化剂；(b)包含C1复合物分子的抑制剂的稀释剂；和(c)抗自体C5b-9复合物的抗体。
根据本发明提供了一种在生理条件下功能性测定补体系统凝集素途径(LP)中的缺陷的体外方法。在本发明方法中首先利用现有技术中的方法提供哺乳动物血液、血清、血浆或另一种体液的样品。两种未测定途径，即经典途径(CP)和旁路途径(AP)的活化，随后在样品中得以抑制，并且活化凝集素途径。最后，在C5b-9复合物的水平上测定补体途径的任何活化。
本发明的方法需要一定要考虑到大量的事实和问题。例如，补体系统的大的多聚体蛋白质复合物C1由亚基C1q、C1r和C1s组成。经典途径的活化起始于特异性抗体与外来抗原结合形成免疫复合物，例如IgM。每种免疫球蛋白Fc区都具有单一的C1q结合位点，并且每个C1q必须结合2个重链以进行活化(因此既可以是交联的2IgG，也可以是1IgM)。
在经典补体途径中，识别单元C1q与已知为胶原凝集素的蛋白质家族大为相关，它具有三聚体组成的复合结构，成胶序列的片段在N-末端，C型凝集素结构域在它的C-末端。C1q没有凝集素结构域，但与胶原凝集素有许多相同结构和功能的特性。C1q的血浆浓度总计为100μg/ml左右，并且体外实验表明只要一小部分的C1q就足以进行完整的补体活化。
在本发明方法中利用有效的和特异性的补体抑制剂来防止每个补体途径不需要的活化。至少能够利用两种不同类型的C1q抑制剂来阻止经典途径的活化，那些结合球状头部并干扰配体识别的抑制剂，以及那些结合胶原尾部并削弱与补体活化酶和/或C1q受体的相互作用的抑制剂。显然，那些干扰配体结合的抑制剂抑制经典途径活化的早期步骤。另一方面，结合C1q球状头部的分子可以在液相中诱发C1活化，尤其是当这些C1q结合分子为多聚体时。
优选地，利用针对C1q的单克隆抗体以便有效地抑制C1q介导的配体结合和补体活化。
下面在表1中显示多种经鉴定的分子，它们能够调节的C1q功能性活性。
表1
在表1中，显示了天然C1q结合分子、多个系列的C1q结合肽和源自C1q序列的竞争性抑制剂，它们可以用于本发明方法中抑制补体系统的C1q或当阻止经典途径活化时用作抑制性C1q结合蛋白质。
经典的C1q结合蛋白质是免疫球蛋白，并且C1q的球状头部区在抗原结合后，或在它的聚合或固定以后，与IgG和IgM二者都相互作用。静脉用的人免疫球蛋白(IVIg)可以抑制补体活化，并且主要的作用机制似乎是通过可溶性的免疫球蛋白来清除C1q和活化的C4以及C3。
继免疫球蛋白之后，许多能结合C1q的其它蛋白质已经得以鉴定。其中有C1q结合蛋白质，它们(在某种条件下并在某种细胞类型上)出现在细胞膜上，如钙网蛋白(CRT)、内皮C1q受体和球状C1q受体(gC1q-R)。这些C1q结合蛋白质的膜表达形式涉及C1q介导的细胞活化，然而这些分子的溶解形式能够抑制C1q的功能。
钙网蛋白(CRT)是主要存在于内质网内腔的钙结合蛋白质。蛋白质测序数据表明CRT可能与存在于在多种细胞类型的细胞表面上的C1q受体相同。CRT能够在细胞表面结合α2巨球蛋白受体(CD91)，并且结合C1q的CRT的不同区域能够进行区别，即邻近的N结构域和P结构域，而非C结构域。而且，重叠N结构域和P结构域部分的S结构域也显示清晰的C1q结合。CRT的S结构域显然类似于C1r和C1s中存在的CUB结构域，提示此结构域可以与C1q胶原部分相互作用。
相应地，C1q上的不同部位与不同的CRT结构域相互作用。天然的和重组的CRT，与N结构域、P结构域和S结构域一样均抑制C1q依赖的溶血以及C1的形成。多种C1q结合肽也已被鉴定为能够抑制C1q的功能，这些肽在本发明的方法中是有用的。其中有人嗜中性粒细胞肽-1、源自天然C1q结合蛋白质的肽和筛选自肽文库的合成肽。
也能够利用特异性结合C1q球状头部的C1q结合蛋白质(gC1qR)。从人内皮细胞膜或多形核白细胞膜分离得到的天然C1q受体(C1qR)功能上抑制活性C1的形成。由C1q胶原尾部而非球状头部来逆转抑制性活性。以类似的方式，从结合C1q的由大肠肝菌上分离的一种可溶性蛋白质可以抑制C1的形成。
此外，能够通过在试验中将样品与针对C1r或C1s的抗体接触来阻止经典途径的活化。在这种联系中，可以使用一些调节C1q功能的其它C1q结合分子。实例为C1q相关的血浆蛋白多糖和由人B细胞生产的硫酸软骨素蛋白多糖，它能够结合C1q并抑制C1的形成。细胞外基质成分硫酸皮肤素核心蛋白多糖和相关的蛋白多糖二聚糖也是适宜的抑制剂。
同样地，可以通过提供C1r或C1s的肽抑制剂阻止经典途径的活化。一些穿透素(pentraxin)家族成员，即C反应性蛋白、血清淀粉样蛋白P复合物和穿透素-3已被阐明结合C1q。在某些条件下穿透素-3可以抑制C1q活性，并且胶原凝集素家族的成员，表面活性蛋白A能够结合C1q并抑制它的活性。这通过干扰C1r和C1s二者的结合，以及免疫复合物的结合而得以完成。
由源自C1q的分子引起的C1q竞争性抑制是用于抑制经典补体途径的另一方法。这里，应用C1q分子的功能上无活性的部分，它们每一个都可用作C1q配体结合的竞争性抑制剂。生产C1qA(ghA)和B链(ghB)重组的球状头部结构域，二者分离的结构域都能结合IgG，但B结构域比A结构域更有效。当采用表面活性蛋白D的颈区将重组C1qB链三聚体化时可得到更好的活性。
也可以采用一种小的抑制性的C1q结合分子，如能够结合C1q并抑制经典补体途径的人中性粒细胞肽-1(HNP-1)。该肽属于存在于嗜苯胺蓝的中性粒细胞颗粒体中的小阳离子肽α防卫素家族。为了以低成本获得足够的数量，优选这样的C1r或C1s的肽抑制剂为合成生产的肽。
在C1q结合蛋白质的氨基酸序列的基础上已经鉴定了几种C1q结合肽。通过使用92重合肽，已经鉴定了几个在CRT的N和P区的C1q结合位点。许多这种肽链能够抑制人血清中的经典途径的活化以及抑制C1q结合到IgG上。这些肽表征为一种基序，它类似于在IgG的CH2结构域中的C1q结合位点(ExKxKx)。
在这种联系中，直接源于IgG的肽已被描述为抑制C1q，如一种包含ExKxKx基序的7肽(即AEAKAKA)、一种源于IgG1的11肽(VQVHNAKTKPR)和一条二聚体肽(WY，见表1)，所述IgG1与相同的基序有关。在几种体外测试中，这些肽链能够抑制经典补体途径的活化。但是，WY肽链还抑制旁路补体途径。
在选自基于结合人C1q的噬菌体的噬菌体展示肽文库的42种肽中，已经鉴定了20种肽，它们能够抑制人血清中的经典补体途径。值得注意是，这20种肽中的13种能够抑制溶血试验中的经典途径和旁路途径，而7种肽则特异性地抑制经典途径。从这些肽中，选择2J肽(CEGPFGPRHDLTFCW)。2J肽是C1q溶血功能的强烈抑制剂。与具有IgG基序的肽相似，2J肽结合C1q的球状头部并抑制C1q结合到IgG上。此外，2J肽抑制来自人、灵长类和啮齿类的C1q。
对于抑制经典途径有用的其它所选的肽是CEGPFGPRHDLTFCW，CRWDGSWGEVRC，CMWVRMWGDVNC，CFWAGKFGLGTC，CKDRWVVEERCC和CWNRFKKMDRC。也可以使用其它几种肽，它们作为C1q结合的竞争物起作用并源自C1qB链，例如肽CBP2(LEQGENVFLQATLL)。
C1抑制剂蛋白质是在识别阶段有关补体调节的关键分子并抑制活化的C1复合物的丝氨酸蛋白酶。因而，任何C1抑制剂的强化因子都能够用以防止经典途径的活化。
此外，能够使用C1r或C1s的蛋白酶抑制剂，例如已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂。当要阻止凝集素途径的活化时也可以使用这些抑制剂。
甘露聚糖结合凝集素(MBL)是存在于血清中的C型凝集素，以大的酶原复合物形式存在，它表现出与C1的相似性。与C1q相似，MBL是三聚亚基的多聚体分子。MBL的三聚体由三条相同的链组成，所述链带有胶原尾部区和糖识别结构域。在血清中，MBL相关于MBL相关的丝氨酸蛋白酶MASP-1，MASP-2和MASP-3。已经证明活化的MASP-2能够活化C4和C2，它导致C3蛋白转化酶C4b2a的形成和C3随后的活化。MASP酶与C1r和C1s同源。
防止旁路途径活化的一种简单有效的方式是将样品稀释。通过向血清稀释缓冲液中加入1M NaCl，能够完全防止C1q的结合和CP的活化而MBL的结合可以继续进行。然而，应当考虑高离子强度的抑制作用。
在旁路途径中，丝氨酸蛋白酶因子D生产一种C3蛋白转化酶，如果没有活化，它将继续对C3成分起作用并导致它的总体耗尽。因而，可以通过在测试中将样品与补体系统因子D的蛋白酶抑制剂或其抗体相接触而阻止旁路途径的活化。
通过将胶原凝集素家族成员蛋白质结合在入侵病原体上的特异性糖部位而活化凝集素途径是已知的。这些随后直接活化经典途径的组分，不需要特异性的抗体。胶原凝集素家族成员之一为甘聚糖结合凝集素(MBL)，它在血清中发现并结合在细菌的末端甘露糖基团。
因此，凝集素途径可以通过将样品与高或低分子量的MBL结合糖而被活化。高分子量的甘露聚糖的例子为葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖。优选地，低分子量的MBL结合糖为甘露糖或岩藻糖。凝集素途径也可以通过结合合成的糖缀合物或微生物多糖而得以诱发。
因为血清中的GlcNAc结合凝集素，纤维胶凝蛋白被认为是具有活化凝集素途径的凝集素，也可以通过在测试中提供纤维胶凝蛋白结合糖来活化凝集素途径。
然而，特定病原体具有直接活化经典途径的能力，而不需要特异性的抗体相互作用。活化分子包括酵母细胞壁、细菌脂多糖(LPS)和几种病毒的衣壳。同样地，免疫球蛋白的聚集物，例如IgA或IgE能够活化旁路补体途径是已知的。因此，当阻止一种途径的活化时，在本发明方法中不应当使用自身活化该途径的活化因子。
在样品中任何补体途径的活化都可以通过建立其从C4到C9的补体蛋白质活化而随后得以确定。优选地，确定末端补体复合物SC5b-9，因为它是当补体活化发生时通过任一途径形成的膜攻击复合体(MAC，C5b-9)。在测试法中提供针对自体同源C5b-9复合物的抗体可以完成该测定。
应当注意在本发明方法中针对C5b-9复合物的抗体识别整个复合物而不是它的个别部分。
在补体功能测定法中需要一定浓度的活化物质。例如，为了活化补体，抗体必须结合例如抗原或可塑性材料。同样地，应当检测从C4到C9的任何补体蛋白质或任何形成的C5b-9复合物对活化表面的结合来进行所有补体的活化。
因此，优选在根据本发明的试剂盒中活化物质包被(被固定)在惰性载体上。对载体表面的包被可以通过使用常规技术完成。例如，活性物质可以通过共价结合到如珠或基质/凝胶的载体上而进行固定。
用于附着活化凝集素途径的物质的适宜载体是合成的多聚载体，如聚丙烯，聚苯乙烯，取代聚苯乙烯，例如氨化的或羧化的聚苯乙烯，聚丙烯酰胺，聚酰胺，聚氯乙烯等，玻璃，琼脂糖，硝化纤维等。载体可以是以珠，长条或微量滴定板孔的形式存在。优选地，使用ELISA板。然而，也可以使用其它载体。
包括在实施本发明方法的试剂盒中的分离的各项为(a)惰性载体和活化凝集素途径的物质；(b)包含C1复合物分子的抑制剂的稀释剂；(d)抗C5b-9复合物的抗体；(e)抗抗C5b-9复合物抗体的标记的抗抗体；(f)酶底物；(g)洗涤溶液；(h)正常体液；和(I)灭活的正常体液。
优选地，当实施本发明方法时该试剂盒用在ELISA分析中。这样的试剂盒能够手工使用或自动使用。也可以利用自动可调的多孔培养板分析的软件系统。
当怀疑补体系统凝集素途径中存在缺陷时，可以利用本发明方法来分析从病人身上获取的体液，通常是血清。血清、阴性和阳性对照都以相同方法用稀释剂稀释。
稀释剂包括用于抑制经典途径的C1复合物分子的抑制剂而且优选为C1q抑制剂。也可以使用上面提及的其它抑制剂。
稀释剂可以由包含多种盐和缓冲液的缓冲含水介质配制。优选地，盐指碱和碱土金属卤化物，例如，氯化钠、氯化钾或硫酸钠盐。只要缓冲液对于其目的是生理上可接受的，可以使用各种缓冲液，如柠檬酸盐、磷酸盐、羟乙基哌嗪乙磺酸、Tris等。稀释剂应当具有生理性的pH和生理性的离子强度。优选地，使用磷酸盐缓冲(PBS)剂。稀释剂应当包含钙和镁离子。
阴性对照是未活化的正常体液。在这种情况中，未活化的正常体液为热灭活的人血清。阴性对照定义为用本发明方法能够获得的最低可能信号，不仅是凝集素途径而且整个补体系统完全被消灭。
阳性对照是来自具有正常水平补体的人血清样品。当在样品中检测C5b-9复合物的任何活化时，将这样的对照包括在该试剂盒中以便评价信号是否合理。
阳性对照也可以是标准曲线的正常血清连续稀释(标准物)，其用于本方法的量化。这样的标准可以用于选择标准值，用该值有可能比较不同病人或跟踪病人的治疗。
在稀释需检验的血清以及阳性和阴性对照后，将这些液体与惰性载体和活化凝集素途径的物质相接触。
在本发明的一个非限制的例示性实施方案中载体是涂布了甘露聚糖的条状形式。于37℃培养每个带有稀释血清、阳性和阴性对照血清的条状载体30分钟，藉此活化补体，并形成末端复合物。
随后用洗涤溶液洗涤条状物，在该实施例中洗涤溶液应当是稀释剂的缓冲组分。
随后将标记了小鼠抗C5b-9复合物抗体的抗抗体的稀释剂缓冲液加到条状物上，将它再培养30分钟。该抗抗体可以进行酶标记或以其它一些方式标记，例如，荧光标记。优选地，标记物是一种酶。还优选抗体为单克隆抗体，最优选单克隆抗小鼠抗体。
抗C5b-9复合物的抗体也可以直接标记用于产生信号，如荧光或酶标记，优选采用酶标记，省略了抗抗体步骤。
再次洗涤条状物并且随后加入在适宜的反应缓冲液中的酶底物。使在酶标记的抗小鼠抗体和酶底物之间的反应进行30分钟，并采用分光光度计测定反应产物的颜色，参考阳性对照血清的低吸光率相应所检测血清中的缺陷。
实施例将通过下面的实施例对本发明作进一步的解释，但是本发明并不局限于这些实施例。
材料和方法人体材料取70个健康成人志愿者的人血清并立即在-80℃分样冷冻。过期的健康供体血浆取自荷兰Leiden的Leiden-Haaglanden血库。经血浆置换处理后获自IgM型骨髓瘤病患者的血浆变得可利用。
抗C1q和抗MBL抗体如以前所述在小鼠中生产抗C1q的单克隆抗体(Hoekzema R.等，Mol.Immunol.25，485-494，1988)。抗C1q单克隆抗体2204(IgG1)针对C1q球状头部区并能够抑制C1q和IgG的结合以及C1q依赖型溶血(Roos A.等，J.Immunol.167，7052-7059，2001)。对于单克隆抗体2204的纯化，使用50％(NH4)2SO4从腹水中沉淀γ-球蛋白。沉淀物相对于含2mM EDTA(pH7.8)的10mM Tris进行透析并使用DEAE-Sephacel(Pharmacia，Uppsala，Sweden)进行阴离子交换层析。蛋白质通过用盐梯度洗脱，同时将在1M NaCl存在下显示出小鼠IgG结合到涂布C1q的ELISA板上的级分进行合并、浓缩、相对于PBS透析并保藏在-80℃。
在兔子中制备多克隆抗C1q抗体。用180μg溶于完全弗氏佐剂中的C1q对新西兰白兔进行免疫(每周一次，连续四周)，造成在C1q涂布的ELISA板上阳性效价超过1/25,000的抗血清。使用40％的(NH4)2SO4从兔血清中沉淀IgG并通过上面提到的DEAE-Sephacel进行纯化。
从纯化的兔IgG抗-C1q开始，采用番木瓜酶制备Fab片段。因此，相对于含有10mM L-半胱氨酸和2mM EDTA(pH7.0)的10mM磷酸缓冲剂透析IgG。随后，加入mercuripapaine(购自Sigma)(1％w/w的蛋白质含量)后在37℃温育16小时。在相对于PBS进行透析后，将样品应用于琼脂糖凝胶偶联蛋白质G(购自Pharmacia，Uppsala，瑞典)，并且对包含Fab片段的级分的落差进行合并、浓缩并用于实验。用非还原性SDS-PAGE的分析显示在大约45kD的显著条带。
针对人MBL的凝集素结构域的小鼠单克隆抗体(单克隆抗体3F8)由G.L.Stahl博士(哈佛医学院，波士顿，马萨诸塞，美国)慷慨提供(Collard C.D.等，Am.J.Pathol.156，1549-1556，2000)。
人C1q和C1q耗尽的血清的制备精确地如前所述从人供体血浆中分离人C1q并且在-80℃贮存(Roos A.等，J.Immunol.167，7052-7059，2001)。分离的C1q能够完全保留由C1q耗尽的人血清所诱导的抗体包被的红细胞的溶解作用。
为了制备C1q耗尽的血清，将未稀释的正常人EDTA血浆(取自MBL/AA基因型供体)应用于由Biogel A5(购自Biorad)偶联兔IgG抗人C1q所组成的柱上。该柱采用含有10mM EDTA的巴比妥钠缓冲盐水(VBS；1.8mM Na-5，5-二乙基巴比妥，0.2mM 5，5-二乙基巴比妥酸145mM NaCl)进行洗涤。在有或无纯化的C1q存在下在C1q依赖型溶血测定法中对级分进行检测。将在C1q存在时显示完全红细胞溶解的而在不存在C1q时则不显示的级分进行合并，并浓缩到原先的体积。复钙后，将C1q耗尽的血清在-80℃保存。
人IgM的分离相对于含有2mMEDTA(PH5.0)的10mM醋酸钠透析含有IgM副蛋白的血浆。通过离心回收沉淀蛋白质，在PBS中溶解，相对于Tris/EDTA缓冲液进行透析(10mM Tris，2mM EDTA，pH7.8和导电性5.0mS)，并使用DEAE-Sephacel进行阴离子交换层析。合并盐梯度洗脱的IgM，相对于10mM醋酸钠盐(6.0mS，pH7.0)进行透析并应用于CM-C-50交联葡聚糖阴离子交换柱(购自Pharmacia)。在用盐梯度洗脱后，将含有IgM级分的部分进行合并、浓缩并应用于Superdex 300凝胶过滤柱。将含有IgM并且无IgG的峰值级分进行合并、浓缩并在-80℃保存而进行。
在附图中
图1显示如人血清ELISA所测定的C4(A)和C3(B)的活化，所述ELISA在涂布甘露聚糖的板上在含钙、镁和NaCl缓冲液中温育。
图2表示人血清中的抗甘露聚糖抗体；A-C三个不同健康供体的不同浓度的人血清在涂有甘露聚糖(闭合标志，实线)或BSA(开放标志，虚线)的板上进行温育。检测出IgG(A)、IgA(B)或IgM(C)结合。如图示，作为阳性对照，用合并的免疫球蛋白来培养板。D在健康供体血清(N＝70)中定量三种主要的Ig类型的抗甘露聚糖抗体。实线表示中间浓度，虚线表示检测限值。
图3显示C1q在CP和LP活化中的作用；A，B在涂有IgM(A)和甘露聚糖(B)的培养板上分别温育在GVB++中稀释的正常人血清和C1q耗尽的血清(C1qD-NHS)，随后检测C4结合；C如图示，在有或无纯化的C1q(0.5μg/ml)时于涂有IgM或甘露聚糖的培养板上温育NHS和C1q-耗尽的NHS(稀释1/400)。
D在有或无针对MBL(mAb 3F8，10μg/ml)或C1q(mAb2204，20μg/ml)，或二者(结合)的封闭性单克隆抗体时，在涂有IgM或甘露聚糖的培养板上温育NHS。
图4显示以所示浓度用纯化的IgG和IgM抗体分别检测C4的活化，在有或无单克隆抗体2204抗C1q时，在涂布了甘露聚糖的培养板上将其与MBL缺陷的血清一起温育。
图5显示通过LP和CP的补体活化；在有或无mAb 2204(20μg/ml)时，在培养板上温育不同浓度的NHS来诱导补体活化，所述培养板用IgM涂布以进行CP活化(A)，或用甘露聚糖涂布以进行LP活化(B)。通过使用特异性mAb检测C1q、C4、C3和C5b-9来显示补体的活化和结合。
图6显示旁路途径的活化；在涂布了甘露聚糖、LPS或BSA的培养板上于无钙缓冲液(GVB/MgEGTA)中温育NHS，以阻止CP和LP的活化。随后分别检测C3和C4的结合。
比较性的实施例高盐浓度消极影响补体系统，所以几种反应较弱。
在含有图1中所示浓度的钙、镁和NaCl的缓冲液中于涂布了甘露聚糖的微量滴定板孔内培养血清，并通过ELISA检测C4(A)和C3(B)的活化。
通过高盐浓度获得C4(A)活化的完全抑制以及C3(B)活化的完全抑制。相应地，高离子强度可能通过变性的方式抑制C3，藉此避免在C4后的任何活性的测量。
实施例1通过ELISA评价功能性凝集素途径的活性。
采用固定的甘露聚糖作为配体以ELISA来评定凝集素途径的功能性活性。由SIGMA获得甘露聚糖(来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；M7504)，在PBS(10mg/ml)中溶解并在-20℃保存。在涂布缓冲液中(100mM Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)用甘露聚糖涂布NuncMaxisorb培养板(Nunc，Roskilde，丹麦)，在室温下16小时或在37℃下2小时。在每个步骤之后，用含0.05％吐温20的PBS洗涤培养板三次。在37℃用含有1％BSA的PBS温育一小时以封闭残余的结合位点。血清样品在mAb 2204(20μg/ml)存在下稀释于GVB++(VBS含有0.5mM MgC12，2mM CaCl2，0.05％吐温-20，和0.1％明胶；pH7.5)中作为C1q的抑制剂，除非另有说明。在加入培养板上之前，该混合物在冰上预温育15分钟。随后培养板依次在4℃和37℃下各温育1小时，接着进行洗涤。通过缀合地高辛(dig)的小鼠mAb检测补体的结合，所述缀合是通过依照生产商提供的方法采用地高辛苷-3-O-甲羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰胺酯(购自Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)而进行的。利用由T.E.Mollnes博士(Oslo，Norway)慷慨提供的mAb 2214(抗人C1q)、mAb C4-4a(抗人C4d)、RFK22(抗人C3)和AE11(抗C5b-9)来分别进行C1q、C4、C3和C5b-9的检测。采用地高辛缀合的山羊抗小鼠抗体(Fab片段)检测Mab的结合，随后用HRP缀合的山羊抗地高辛抗体(Fab片段，均购自Boehringer Mannheim)。所有检测抗体都稀释于含1％BSA和0.05％吐温20的PBS中。在0.01％H2O2存在下用2，2’-吖嗪-双(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)(购自Sigma；2.5mg/ml于0.1M柠檬酸盐/Na2HPO4缓冲液，pH4.2)于室温温育30-60分钟后检测HRP酶活性。采用微量反应板生物动力阅读仪(EL312e，购自Biotek Instruments，Winooski，Vermont，美国)在415nm测量OD。
人血清中抗甘露聚糖抗体的定量为了量化人血清中的抗甘露聚糖抗体，用甘露聚糖涂布ELISA培养板并用含1％BSA的PBS进行封闭。分别稀释血清样品，1/100用于检测IgG抗甘露聚糖Ab，1/10用于检测IgA抗甘露聚糖Ab，而1/40用于检测IgM抗甘露聚糖Ab，除非另有说明。对于定量，合并的人IgG(48mg/ml IgG)、合并的人IgA(41mg/ml IgA)和合并的人IgM(35mg/ml IgM)分别用作检测IgG、IgA和IgM抗甘露聚糖抗体的测量标准(由Biotest Pharma GmbH，Dreieich，德国，慷慨提供)。在这些制备中抗甘露聚糖抗体的浓度被任意设定为1000U/ml。所有样品都稀释于含有0.05％吐温20和1％BSA的PBS中。分别采用生物素标记的HB43(小鼠mAb抗人IgG)、生物素标记的HB57(小鼠mAb抗人IgM)和地高辛缀合的4E8(小鼠mAb抗人IgA)，接着则用HRP缀合的抗生蛋白链菌素或HRP缀合的山羊抗地高辛抗体(均购自Boehringer)检测抗体的结合。
甘露聚糖是能够有效活化补体LP的MBL的主要配体。然而，人血清含有或许由以前的微生物接触所引起的抗糖抗体。这样的抗糖抗体可以结合甘露聚糖并且导致的免疫复合物通过经典补体途径的活化有助于甘露聚糖对补体的活化(Petersen S.V.等.Immunol.Methods257，107-116，2001)。如通过ELISA所检测的，甘露聚糖结合抗体在人血清中是可以清楚地检测到的(图2)。如通过同型特异性mAb所检测的，在固定的甘露聚糖上温育合并的人IgG(图2A)、IgA(表2B)和IgM(图2C)分别导致IgG、IgA和IgM剂量依赖性的结合。作为对照，在固定的BSA上做平行温育，导致合并的Ig的低的或不可检测的背景结合。在涂有甘露聚糖的培养板上温育来自健康供体的三种血清导致在所有三个血清中强烈的剂量依赖性的IgG结合。在供体1中，IgA和IgM抗甘露聚糖Ab是检测不到的，来自供体2的血清含有IgG、IgA和IgM抗甘露聚糖抗体，而在供体3中观察到一些IgM结合，但无IgA结合(图2A-C)。在涂有BSA的培养板上温育血清后没有检测到Ig的结合(图2A-C)。取自70位健康供体的血清中的抗甘露聚糖抗体的定量示于图2D中。IgG和IgM抗甘露聚糖Ab存在于几乎所有的供体中，具有很大的个体间变异，而IgA抗甘露聚糖Ab在63％的供体中检测到。在抗甘露聚糖抗体的三种主要同功型之间或抗甘露聚糖抗体与MBL的浓度(没有显示)之间没有发现显著的相关性。
实施例2.在C1q抑制性Ab存在时凝集素途径的功能性特征描述LP和CP二者都是钙依赖的并导致C4的活化。通过筛选一种诱导LP或CP的特异性活化的特异性配体可造成两种途径之间的差别。考虑到人血清中抗甘露聚糖Ab的存在，甘露聚糖有可能通过MBL活化LP，且通过抗甘露聚糖Ab活化CP。因此，为能由固定的甘露聚糖单独活化LP，发展了一种利用抑制性抗C1q抗体抑制CP活化的策略。
通过使用固定的IgM作为CP的特异性活化因子测试了抗C1q抗体抑制补体CP的能力。在固定的IgM上温育1％的正常人血清(NHS)诱导C4的沉积，由抗C1q的mAb 2204、由兔IgG抗C1q抗体和由这种兔抗C1q抗体制品制备的Fab片段能够对其进行剂量依赖性地抑制。当抗体以5μg/ml进行应用时可以达到完全的抑制。相反地，由未免疫的兔制备的兔IgG并不具有通过CP活化C4的作用。检验这些抗体对于由固定的甘露聚糖诱导的补体活化的作用。在甘露聚糖上温育NHS诱导剂量依赖性的C4累积，在1％的血清浓度时具有最大的活化。加入固定浓度的mAb2204、Fab抗C1q片段或正常的兔IgG作为对照对于C4活化具有轻微的抑制性效果。相反地，兔IgG抗C1q抗体完全抑制甘露聚糖对C4的活化，最可能是归因为经由C1q-抗C1q复合物的补体消耗。这些数据表明C1q抑制性抗体能够完全阻断CP的活化，而甘露聚糖诱导的LP活化能够以不依赖C1q的方式继续进行。
为了进一步地检测C1q在甘露聚糖和IgM对补体活化中的作用，NHS由C1q耗竭。如以前所描述的(Petersen S.v.，等人.J.Immunol.Methods 257，107-116，2001)，NHS引起的C1q耗尽导致由固定的IgM对C4活化的完全抑制，而C1q耗尽略微抑制由固定的甘露聚糖对C4的活化(图3B)。用纯化的C1q重构C1q耗尽的血清会导致由IgM对C4活化的完全恢复(图3C)。相反，将纯化的C1q加到C1q耗尽的血清中略微抑制由甘露聚糖对C4的活化，这可能归因于存在与C1q共分离的抑制性蛋白质。采用抗C1a和MBL的封闭性mAb分别进一步地研究C1q和MBL对于由IgM和甘露聚糖对C4活化的作用(图3D)。在涂布了IgM的培养板上的C4活化被抗C1q mAb完全抑制而对于封闭性的抗MBLmAb没有出现抑制。相反，甘露聚糖诱导的C4活化被抗C1q mAb部分地抑制并且被抗MBL mAb强烈地抑制。当抗C1q mAb和抗MBL mAb联合使用时，实现了甘露聚糖诱导的C4活化的完全抑制。总之，这些数据表明C4的IgM介导的活化完全依赖于C1q并且与MBL无关。相反，甘露聚糖诱导的C4活化主要通过LP介导，但也包括小部分的CP作用。CP的后一作用能够通过阻断C1q的Ab进行抑制，因此仅允许LP的活化。
实施例3.在甘露聚糖导致的补体活化中的经典途径和凝集素途径之间协同作用的阐释通过使用来自正常人血浆的纯化的IgG和IgM，在功能性实验中抗甘露聚糖抗体的补体活化能力得到进一步检测。使用含1％BSA、0.05％Tween 20和10mM EDTA的PBS作为稀释缓冲液在涂布甘露聚糖的培养板上温育抗体。洗涤后，用MBL缺失的血清来温育培养板(在mAb 2204存在或不存在下稀释1/100)，并如上所述来评测C4的活化。
在有或无抗C1q mAb 2204时在ELISA中由OD415测定的C4耗损显示于图4中。用纯化的IgG或IgM预温育涂布甘露聚糖的培养板在加入MBL缺失的血清(BB基因型)后于甘露聚糖上诱导C4的剂量依赖性沉积，而单独使用这种血清则不能检测到补体活化。在MBL缺失的血清中加入C1q抑制性抗体完全抑制了由抗甘露聚糖抗体诱导的C4活化，这清楚地表明在缺乏功能性MBL时，通过补体经典途径的活化，结合甘露聚糖的IgG和IgM能够在MBL缺失的血清中恢复由甘露聚糖对补体的活化。
实施例4.通过ELISA评测功能性的经典途径的活性经典途径的功能性活性的方案类似于实施例1的LP测定的方案，有重要的改进。作为CP活化的配体，将人IgM以2μg/ml进行涂布。封闭残余的结合位点后，把溶解在GVB++中的血清样品加入到培养板上并在37℃下温育1小时。通过使用针对C1q、C4、C3和C5b-9的地高辛缀合的mMb测定补体结合，随后通过使用HRP缀合的山羊抗地高辛抗体测定mAb结合。
实施例5.通过CP和LP活化补体以及形成C5b-9通过使用mMb分别检测在其经由CP和LP活化之后的特异性补体成分的结合，来进一步研究补体活化级联反应。在固定的IgM上温育NHS导致C1q、C4、C3和C5b-9在培养板上的剂量依赖性沉积(表5A)。通过mAb2204能够完全抑制C1q的结合以及随后由IgM诱导的补体活化。在固定的甘露聚糖上温育NHS导致C4、C3和C5b-9的剂量依赖性的结合，而C1q的结合则很难检测到(表5B)。通过加入mAb 2204仅能略微抑制由甘露聚糖引起的补体活化。因此，加入mAb 2204到血清中使得能够特异性检测利用甘露聚糖作为配体导致的LP活化，而无CP的任何干扰。
实施例6通过ELISA评测功能性的旁路途径的活性旁路途径的功能性活性的方案类似于实施例5的LP测定的方案，有重要改进。作为AP活化的配体，将LPS以10μg/ml进行涂布。来自肠伤寒沙门菌(Salmonella typhosa)的LPS获自Sigma(L-6386)，以1.6mg/ml溶于PBS中，保存于-20℃。通过利用含1％BSA的PBS封闭培养板。在GVB/MgEGTA(含10mM EGTA，5mM MgCl2，0.05％吐温20，和0.1％明胶的VBS；pH7.5)中稀释血清样品并在37℃于培养板中温育1小时。通过使用针对C4和C3的地高辛缀合的mAb测定补体的结合，随后通过使用HRP缀合的山羊抗地高辛抗体测定mAb的结合。
旁路途径的活化为了能够在一个测定系统中进行所有补体活化途径的检测，还研究了在一个ELISA系统中旁路途径的活化。与LP和CP相反，AP的活化是钙-非依赖型。所以，使用无钙的缓冲液，因此避免了CP和LP干扰。如前所述(Fredrikson G.N.等，J.Immunol.Methods 166，263-270，1993)，在涂布了LPS的培养板上在含有EGTA和Mg++的缓冲液中温育NHS造成C3的剂量依赖性的沉积(图6)。在仅涂布了BSA的培养板上也可以观察到一些C3活化，很可能归因于AP的自发活化。令人惊讶的是，当采用相同条件在涂布了甘露聚糖的培养板上培养NHS时，也可以观察到C3的激烈活化，这提示甘露聚糖也可以支持AP的活化。当EDTA存在于补体源中时，C3的检测减少到直至背景水平为止。如由AP依赖机制所预期的，在无钙缓冲液中C3活化需要的血清浓度比经LP在含钙缓冲液中由甘露聚糖引起的C3活化所需要的血清浓度大约高出10倍(图6与图5B相比)。尽管在无钙缓冲液中C3活化是可以清楚检测到，但不能确定C4的活化(图6)，这提示在这些条件下C3的活化不依赖于MBL结合与C4活化。
权利要求
1.在生理条件下功能性测定补体系统的凝集素途径中的缺陷的体外方法，该方法包括步骤(a)提供哺乳动物血液、血清、血浆或另一种体液的样品；(b)通过将样品与补体系统C1复合物分子的抑制剂相接触来阻止样品中经典途径的活化；(c)阻止样品中旁路途径的活化；(d)活化样品中的凝集素途径；和(e)测定样品中自体C5b-9复合物的任何活化。
2.如在权利要求1中所述的方法，其中在(b)中C1复合物分子的抑制剂是抗C1q抗体。
3.如在权利要求1中所述的方法，其中在(b)中C1复合物分子的抑制剂是抑制C1q的肽。
4.如在权利要求1中所述的方法，其中在(b)中C1复合物分子的抑制剂是抑制性的C1q结合蛋白质。
5.如在权利要求1中所述的方法，其中在(b)中C1复合物分子的抑制剂是抑制性的结合C1q的小分子。
6.如在权利要求1中所述的方法，其中在(b)中C1复合物分子的抑制剂是针对C1r或C1s的抗体。
7.如在权利要求1中所述的方法，其中在(b)中C1复合物分子的抑制剂是C1r或C1s的肽抑制剂。
8.如在权利要求1中所述的方法，其中在(b)中C1复合物分子的抑制剂是一种C1r或C1s的蛋白酶抑制剂。
9.如在权利要求1中所述的方法，其中在(c)中旁路途径的活化由样品的稀释而得以阻止。
10.如在权利要求1中所述的方法，其中在(c)中旁路途径的活化由将样品与因子D的蛋白酶抑制剂相接触而得以阻止。
11.如在权利要求1中所述的方法，其中在(c)中旁路途径的活化由将样品与针对因子D的抗体相接触而得以阻止。
12.如在权利要求1中所述的方法，其中在(d)中通过将样品与MBL结合糖类接触来活化凝集素途径。
13.如在权利要求12中所述的方法，其中MBL结合糖类是甘露聚糖。
14.如在权利要求1中所述的方法，其中在(d)中凝集素途径通过将样品与纤维胶凝蛋白结合糖接触而活化。
15.如在权利要求1中所述的方法，其中在(e)中自体C5b-9复合物的任何活化通过将样品与针对自体C5b-9复合物的抗体接触来测定。
16.在哺乳动物体液中功能性测定补体系统的凝集素途径中的缺陷的试剂盒，它包括以下各项(a)惰性载体和凝集素途径活化物质；(b)包含C1复合物分子的抑制剂的稀释剂；和(c)抗自体C5b-9复合物的抗体。
17.如在权利要求16中所述的试剂盒，其中在(a)项中活化物质是MBL结合糖。
18.如在权利要求17中所述的试剂盒，其中MBL结合糖是甘露聚糖。
19.如在权利要求16中所述的试剂盒，其中在(a)项中活化物质是纤维胶凝蛋白结合糖。
20.如在权利要求16-19任一项中所述的试剂盒，其中在(a)项中活化物质涂布在载体上。
21.如在权利要求16中所述的试剂盒，其中在(b)项中C1复合物分子的抑制剂是抗C1q抗体。
22.如在权利要求16中所述的试剂盒，其中在(b)项中C1复合物分子的抑制剂是抑制C1q的肽。
23.如在权利要求16中所述的试剂盒，其中在(b)项中C1复合物分子的抑制剂是抑制性的C1q结合蛋白。
24.如在权利要求16中所述的试剂盒，其中在(b)项中C1复合物分子的抑制剂是抑制性的结合C1q的小分子。
25.如在权利要求16中所述的试剂盒，其中在(b)项中C1复合物分子的抑制剂是针对C1r或C1s的抗体。
26.如在权利要求16中所述的试剂盒，其中在(b)项中C1复合物分子的抑制剂是C1r或C1s的肽抑制剂。
27.如在权利要求16中所述的试剂盒，其中在(b)项中C1复合物分子的抑制剂是C1r或C1s的蛋白酶抑制剂。
28.如在权利要求16中所述的试剂盒，其中在(c)项中抗体是标记过的抗体。
29.如在权利要求16中所述的试剂盒，它进一步包括针对抗自体C5b-9复合物抗体的标记过的抗抗体作为单独的(d)项。
30.如在权利要求28或29中所述的试剂盒，其中标记是荧光标记。
31.如在权利要求28或29中所述的试剂盒，其中标记是酶。
32.如在权利要求16和31中所述的试剂盒，它进一步包括酶底物作为单独的(e)项。
33.如在权利要求16中所述的试剂盒，它进一步包括洗涤溶液作为单独的(f)项。
34.如在权利要求16中所述的试剂盒，它进一步包括来自哺乳动物的正常体液作为单独的(g)项。
35.如在权利要求34中所述的试剂盒，其中在(g)项中正常的体液是正常的人血清。
36.如在权利要求16中所述的试剂盒，它进一步包括来自哺乳动物的灭活的正常体液作为单独的(h)项。
37.如在权利要求36中所述的试剂盒，其中在(h)项中未活化的正常体液是热灭活的人血清。
全文摘要
本发明涉及一种在生理条件下功能性测定补体系统的凝集素途径中的缺陷的体外方法，该方法包括步骤(a)提供哺乳动物血液、血清、血浆或另一种体液的样品；(b)通过将样品与补体系统C1复合物分子的抑制剂相接触来阻止样品中经典途径的活化；(c)阻止样品中旁路途径的活化；(d)活化样品中的凝集素途径；和(e)测定样品中自体的C5b－9复合物的任何活化。本发明也涉及一种在哺乳动物体液中功能性测定补体系统的凝集素途径中的缺陷的试剂盒，它包括以下分离的各项(a)一种惰性载体和凝集素途径活化物质；(b)一种包含C1复合物分子的抑制剂的稀释剂；和(c)一种抗自体的C5b－9复合物的抗体。
文档编号G01N33/68GK1671861SQ03817948
公开日2005年9月21日 申请日期2003年7月11日 优先权日2002年7月26日
发明者J·罗斯, M·R·达哈, L·H·鲍曼, C·E·哈克 申请人:维斯拉伯股份公司
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