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专利名称：一种适合双向电泳的蚯蚓蛋白样品制备方法
技术领域：
本发明涉及一种适合双向电泳的蚯蚓蛋白样品制备方法。
背景技术：
蚯蚓在生态系统中具有重要的功能，能疏松土壤，增加土壤有机质并改善土壤结构，还能促进酸性或碱性土壤变为中性土壤，增加磷等速效成分，使土壤适于农作物的生
长，促进农业增产。蚯蚓是土壤污染的敏感指示物，对多种重金属、有机农药、多氯联苯、多环芳烃、放射性污染物等环境有害物质有反应指示和积累指示的特殊作用。利用蚯蚓的分子、生物化学和生理反应(生物标志物)监测土壤污染情况现已备受关注。目前，国内外利用蚯蚓指示污染物对土壤生态系统造成的影响主要通过实地调查污染土壤中蚯蚓种群数量及种群结构；或是在实验室条件下，通过毒性和繁殖试验研究污染物对某一种类蚯蚓造成的伤害，即蚯蚓的生态毒理学研究。而从分子生物学，尤其是蛋白质组学方面的研究尚且较少。蛋白质组学分析是研究蚯蚓蛋白的自身变化及周围环境刺激响应的重要技术手段。其中双向电泳技术是在蛋白质水平上研究基因表达产物最有效的方法之一。选择合适的样品制备方法是双向电泳成功的关键因素之一，样品的制备直接影响到分离结果的有效性、可靠性及可重复性。由于蚯蚓中杂质成分复杂，如色素、多糖和核酸等都会严重干扰双向电泳，因此目前还没有制备适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品的分析研究，从而导致蚯蚓相关的蛋白质组研究滞后。

发明内容
为了解决上述问题，本发明利用土壤中的蚯蚓为试材，通过对蛋白质样品制备步骤的大量摸索，建立了一套适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品制备体系，为蚯蚓的蛋白质组学研究提供技术保障。本发明的技术方案包括以下步骤I)取吐泥Id后的蚯蚓于液氮中快速研磨成蚯蚓干粉，研磨时间为5_15min ；2)按蚯蚓干粉质量与以丙酮为溶剂的溶液A的体积之比为I :10的比例，向蚯蚓干粉中加入适量溶液A充分混合，-20°C静置8_12h，得到蚯蚓总蛋白样品；所述以丙酮为溶剂的溶液A中的溶质为0. 01-0. 03mmol/L的二硫苏糖醇、10%(w/v)的三氯乙酸；3)步骤2)中所得的蚯蚓总蛋白样品离心20-30min :4°C，转速12000_15000g，弃上清液；用_20°C下预冷的以丙酮为溶剂的溶液A洗涤沉淀，-20°C静置l_2h，弃上清液；使用溶液A洗涤沉淀3次以上，直至上清液为无色透明为止，弃上清液，收集沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物；4)收集沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物；5)将步骤4)中得到的蚯蚓总蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液中振荡混合l_2min后冰浴冷却lmin，如此重复振荡混合l_2h。裂解缓冲液包括9. 8mol/L尿素(urea)，4%(w/V)的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)，65mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，2%(v/v)的胶条缓冲液(IPG buffer)，1%(w/v)的苯甲基磺酰氟(PMSF)。所述裂解缓冲液与蚯蚓总蛋白样品的质量体积比为O. 04g/400 μ L-O. 05g/400 μ L ；6)将步骤5)中混合液离心取上清液得到适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品。使用的样品裂解液中，尿素作为变性剂能破坏蛋白质的高级结构，打断非共价键链接。CHAPS是一 种兼性去污剂，能打断蛋白质分子或亚基间的疏水作用，增加蛋白质的溶解性。加入DTT是为了打断二硫键，并使所有蛋白质处于还原状态。PMSF是一种蛋白酶抑制剂，能有效抑制丝氨酸蛋白酶以及巯基蛋白酶的活性，防止目标蛋白的降解。所使用的胶条缓冲液能通过电荷间的相互作用减少蛋白质结合，从而增加蛋白质可溶性。本发明的有益效果在于采用三氯乙酸-丙酮沉淀蛋白质，并且增加蛋白清洗次数，可以有效去除盐离子、多糖、脂类、核酸等干扰电泳的物质。本发明的方法简单易行，进行双向电泳分析获得了重复性好、分辨率高的电泳图谱。便于后续的质谱分析鉴定，具有较大的实际应用价值。


图I为蚯蚓总蛋白样品双向电泳图谱
具体实施例方式以下实例中未详尽描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。应理解以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何形式限制本发明的范围。实施例II.样品制备I)取吐泥Id后的3条性成熟赤子爱胜蚓于液氮中快速研磨10min(液氮添加量以能冻住蚯蚓并可研磨成蚯蚓干粉末为准)，将研磨后的粉末转移至5ml离心管中，O. 2g/管；每管加入2mL以丙酮为溶剂的溶液A (溶质为0. 01-0. 03mmol/L的二硫苏糖醇、10% (w/v)的三氯乙酸)，充分漩涡混合，-20°C静置IOh ;静置后的蚯蚓总蛋白样品离心30min :4°C，转速12000g，弃上清液；将_201下预冷的以丙酮为溶剂的溶液A与所得沉淀充分混合，洗涤沉淀，-20°C静置l_2h，弃上清液；洗涤步骤重复3次以上，直至上清液为无色透明为止；收集沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物。2)将上述所得的蚯蚓总蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液中(裂解液包括9. Smol/L尿素,4% (w/v)的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，65mmol/L 二硫苏糖醇，2%(v/v)胶条缓冲液(IPGbuffer), 1%(w/v)的苯甲基磺酰氟(PMSF)),所用裂解液与Φ丘蝴总蛋白样品的体积质量比为O. 045g/400 μ L0振荡混合Imin后冰浴冷却lmin,如此重复振荡混合2h ;所得混合液离心60min :15°C，转速14000g ;取上清液得到适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品；-20°C保存备用。2.双向电泳检测I)水化上样吸取50μ L蚯蚓总蛋白样品，加入到260μ L的水化液中，充分混合，混合液离心IOmin: 15°C，转速10000r/min;取离心后所得的350 μ L上清液，加入到IPG胶条泡涨盘中，将ΡΗ4-7，18cm的胶条胶面朝下放入泡涨盘中，保证胶面与样品液之间无气泡产生。胶条与水化液充分接触O. 5h后，加l_2mL覆盖油，20°C水化10_12h。水化液包括8mol/L尿素，2% (w/v)的3_[3_(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，18mmol/L 二硫苏糖醇,2% (v/v)胶条缓冲液(IPG buffer) ,0. 05%(w/v)的溴酹蓝。2)等电聚焦水化结束后将胶条转移至Ettan IPGhor胶条槽中，进行等电聚焦。等点聚焦程序设置为step,500VXlh !Gradient，1000VX Ih gradient, 8000VX 20000Vh ；Gradient,8000VX60000Vh ；3)胶条平衡将聚焦好后的IPG胶条进行平衡。采用两步平衡法，每次平衡15min，平衡缓冲液配制如下胶条平衡液母液6mol/L尿素,2% (w/v)十二烧基磺酸钠，50mol/LpH8. 8的Tris-HCL, 30%(v/v)的甘油，O. 002% (w/v)的溴酚蓝，溶剂为去离子水。 胶条平衡缓冲液I :每IOmL胶条平衡液缓冲液母液加入IOOmgDTT。胶条平衡缓冲液II :每IOmL胶条平衡液缓冲液母液加入400mgIAA。4) SDS-PAGE电泳将平衡结束后的IPG胶条转移至12. 5% (w/v)已聚合的聚丙烯酰胺分离胶上，以恒功率方式进行电泳先5W电泳20min，然后功率调制20W，继续电泳5h.。当溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部时，关闭电源，结束电泳。5)凝胶染色、脱色将剥离的凝胶置于含40%(v/v)乙醇，10%(v/v)乙酸的固定液中固定 2-3h，之后转入含有 O. 08%(w/v) R-250,8%(w/v)硫酸铵，I. 6%(w/v)磷酸和 20%(v/v)甲醇的染色液染色12h，换脱色液A(l. 2%(w/v)的pH6. 5TrIs-H3PO4)脱色，之后换脱色液B(25%(v/v)甲醇)中脱色，直至背景为无色透明，蛋白点清晰为止。6)使用扫描仪对脱色后的凝胶进行扫描、拍照。结果表明该蚯蚓总蛋白双向电泳样品制备和分离效果较好，最终获得分辨率较高，重复性较好的双向电泳图谱(图I)。实施例2一种双向电泳蚯蚓总蛋白样品制备方法，与实施例I基本相同，所不同的只是所用裂解液与蚯蚓总蛋白样品的质量体积比为O. 04g/400 μ L。利用实施例I中2)双向电泳检测方法的结果表明该蚯蚓总蛋白双向电泳样品制备和分离效果较好，与双向电泳图谱与图I高度相似。实施例3一种双向电泳蚯蚓总蛋白样品制备方法，与实施例I基本相同，所不同的只是所用裂解液与蚯蚓总蛋白样品的质量体积比为O. 05g/400 μ L。利用实施例I中2)双向电泳检测方法的结果表明该蚯蚓总蛋白双向电泳样品制备和分离效果较好，与双向电泳图谱与图I高度相似。
权利要求
1.一种制备蚯蚓总蛋白双向电泳样品的方法，其特征在于包括以下步骤 1)取吐泥Id后的蚯蚓于液氮中快速研磨成蚯蚓干粉，研磨时间为5-15min； 2)按蚯蚓干粉质量与以丙酮为溶剂的溶液A的体积之比为I:10的比例，向蚯蚓干粉中加入适量溶液A充分混合，-20°C静置8-12h，得到蚯蚓总蛋白样品； 所述以丙酮为溶剂的溶液A中的溶质为0. 01-0. 03mmol/L的二硫苏糖醇、10% (w/v)的三氯乙酸； 3)步骤2)中所得的蚯蚓总蛋白样品离心20-30min:4°C，转速12000_15000g，弃上清液；用_20°C下预冷的以丙酮为溶剂的溶液A洗涤沉淀，-20°C静置l_2h，弃上清液；使用溶液A洗涤沉淀3次以上，直至上清液为无色透明为止，弃上清液，收集沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物；· 4)收集沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物； 5)将步骤4)中得到的蚯蚓总蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液中振荡混合l_2min后冰浴冷却Imin,如此重复振荡混合l_2h ;裂解缓冲液包括9. 8mol/L尿素(urea), 4%(w/v)的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)，65mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，2%(v/V)的胶条缓冲液(IPG buffer)，1%(w/v)的苯甲基磺酰氟(PMSF);所述裂解缓冲液与虫丘虫引总蛋白样品的质量体积比为O. 04g/400 μ L-0. 05g/400 μ L ； 6)将步骤5)中混合液离心取上清液得到适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品。
全文摘要
本发明公开了一种适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品制备的方法。以蚯蚓为试材，于液氮中快速研磨，制得蚯蚓干粉。向蚯蚓干粉中加入以丙酮为溶剂的10%(w/v)的三氯乙酸，之后将-20℃下预冷的以丙酮为溶剂的10%(w/v)的三氯乙酸与所得沉淀充分混合，洗涤沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物。最后加入样品裂解液充分混合，离心取上清，制得适合双向电泳的高质量的蚯蚓总蛋白样品。本发明制备蚯蚓总蛋白双向电泳样品的方法可获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，为蚯蚓蛋白组学研究提供重要技术支撑。
文档编号G01N1/28GK102914460SQ20121039364
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年10月16日
发明者王金花, 葛伟丽, 朱鲁生, 王军, 谢慧, 王慧 申请人:山东农业大学