专利名称：包含心肌细胞的装置、制造方法和测量方法
技术领域：
本发明涉及用于体外心脏电生理学筛查的装置。本发明还涉及制造这样的装置的方法。本发明又还涉及利用这样的装置确定化合物的心脏毒性的方法。
背景技术：
许多药物具有心脏毒性的副作用，例如，心律不齐或者对心肌的收缩能力的负面影响。在过去，已经证实，许多药物的共同的副作用是对心动周期QT间期产生延长作用，这是由药物引起的危及生命的心律不齐的重要原因。例如，在过去，若干药物的研发在前临床试验或者临床试验的后期，甚至上市后被中止，其原因是归因于对表面心电图(ECG)的QT间期的不期望的影响。延长该间期到超过440-460mSec会导致发生危及生命的心律不齐，例如尖端扭转型室性心动过速(torsade de pointes) (TdP),这与许多药物相关。这在1998年食品和药品监督管理局(FDA)定义QT间期延长为主要的药物安全问题时就已经被认识到。随后，由于认识到QT延长以及临床的尖端扭转型室性心动过速，若干药物从美国市场上消失，包括特非那定、阿司咪唑、硫醚嗪和格帕沙星，同时，FDA要求许多其它药物必须具有额外的安全标识以警告潜在的危险。目前，评估延长的心室复极(ventricular repolarization)以及QT间期延长的风险是由FDA和EMEA采用的对所有研发药物的标准的NCE前临床评估的一部分。不幸地是，关于药物研发和心脏毒性评估的当前可用的临床前的体外基于细胞的模型系统并不能充分检测到大部分的这些副作用，而预测性的动物体内研究是非常昂贵的，并且在伦理上存在质疑。此外，从动物研究获得的心脏毒性结果并不能容易地外推应用于人体。测试过程基于以下事实而更加复杂，S卩，药物的这些心脏中毒效果仅在如同在跳动的心脏体内发生的实际的心脏肌肉舒张和收缩过程中才变得明显，尤其是在(费力的)体育锻炼过程中；以及在与心脏负荷过重有关的心脏疾�。缧牧λソ咧�。目前，没有足够的体外测试模型系统存在以模拟处于生理情形即舒张收缩周期，或者病理生理情形例如与心力衰竭有关的针对增大的压力的过度舒张中的正常跳动的心脏。而且，不同药物对心脏功能会具有不同的不利影响。这样的测试模型系统应当优选地为人体模型系统。一些基于人体细胞的模型系统可用于心脏毒性测试。这些模型系统典型地包括在标准的多电极阵列上的由人类胚胎干细胞(HESC)衍生的心肌细胞(cardiomyocytes)。但是,这些系统的有用性受到以下事实的限制，即，它们是没有考虑跳动的心脏以及锻炼时的心脏的动力学的静态模型系统。在Zhonggang Feng 等人的 An Electro-Tensile Bioreactor for3~D Culturingof Cardiomyocytes’ , IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine, July/August2005, pages73-79中，公开了一种生物反应器，其允许用布置在可拉伸的聚硅氧烷板上的包含心肌细胞的凝胶层的面内拉伸来模拟体内心肌层的机械和电学响应。该装置的缺点在于，它非常复杂并且并不特别适合于体外心脏电生理学筛查，这是因为心肌细胞被包埋在凝胶中的缘故。而且，不能测量心肌细胞的电学活性，而测量心肌细胞的电学活性对于识别心肌动作潜在延长是非常重要的。因此，对包含心肌细胞的装置，优选包含人体心肌细胞的装置存在需求，所述装置能够用于体外心脏电生理学筛查并且能够以可再现的方式予以制造。类似地，对于典型的带遗传因素的人体心脏疾病，例如家族性心脏肥大和某些心脏心律不齐，并不存在足够的体外动态心脏模型系统。
发明内容
本发明致力于提供改进的用于体外心脏电生理学筛查的装置。本发明还致力于提供制造这样的改进的装置的方法。本发明又还致力于提供利用这样的改进的装置确定心肌细胞对化合物的电生理学响应的方法。根据本发明的第一方面，提供一种用于确定体外心脏电生理学的装置，包括具有腔的基板，所述基板带有在所述腔上延伸的可变形层，其中所述可变形层的一部分覆盖所述腔，所述部分具有包括凹槽图案的表面并带有电极结构以及粘合剂涂层；以及贴附到所述涂层并组装在至少一些所述凹槽中的多个心肌细胞。腔的存在确�？杀湫尾悖绲蕴宀愕闹辽僦行那颍桓阶诺交澹允沟酶们蚰芄蛔杂稍硕缬尚募∠赴氖账醵淮シⅰ４送猓门渲糜欣诳杀湫尾愕拿嫱獗湫危庥隖eng等人公开的面内变形相反。提供腔确保心肌细胞运动能够以相对简单的方式被促进，从而与现有技术中可用的装置相比，本发明的装置的成本可以降低。由于所述部分在腔上延伸的事实，因此可以通过施加外部力来触发所述部分的面外变形。这具有如下优点:所述装置还可以在可变形层的面外变形的过程中通过生理拉伸细胞而培养未成熟的心肌细胞，以使得活的心肌细胞的熟化过程被促进。而且，细胞可以被过拉伸，也就是模拟病态生理应力。此外，心肌细胞的收缩还可以因为以下事实被促进:可变形层的可拉伸的属性允许可变形层的由心肌细胞引起的面内拉伸，以使得分别在心脏舒张和心脏收缩过程中的心肌细胞的拉伸和收缩可以通过该装置以定量的方式以适当的拉伸-收缩周期频率被模拟。而且，还出人意料地发现，凹槽的提供触发沉积在可变形层的表面上的心肌细胞在凹槽中在一个方向排列，以使得并不要求生物粘合剂例如纤维连接蛋白的图案化以保证心肌细胞在可变形层上的适当排列。这是重要的优点，因为纤维连接蛋白图案基于以下事实难以重现:它们必须被冲压或者印刷到可变形层上，这是复杂且繁琐的程序。这阻碍了大规模生产。在本发明中，心肌细胞相对于可变形层的变形方向的排列易于通过提供凹槽图案而实现，心肌细胞自发地组装到可变形层的涂有粘合剂的表面上的这些凹槽中。这些凹槽可以常规地形成在可变形层，例如弹性体层中，以使得该方法更适合于大规模生产。随后，可变形层可以简单地涂覆有粘合剂分子，例如纤维连接蛋白，以形成与凹槽连接的细胞的附连涂层，从而保证在随后的细胞植入(plating)步骤中心肌细胞以图案化的方式组装。已经发现，涂有纤维连接蛋白并具有凹槽的PDMS (聚二甲硅氧烷)特别适于触发该心肌细胞排列效果，尽管可以预期的是，其它的基本憎水的弹性体，例如替代的硅树脂或者聚对二甲苯，对于心肌细胞具有类似的效果。此外，如果凹槽具有小于200微米，优选小于50微米，更优选大约20微米的深度和大约20微米的宽度的尺寸，则可以实现在PDMS凹槽中的最佳排列结果。在优选实施方式中，每个所述凹槽具有一对侧壁，每个侧壁形成与可变形层的表面大致垂直的角度。已经实验确定，在层表面和凹槽侧壁之间提供尖锐的角可以改善心肌细胞在涂有粘合剂的凹槽中的排列过程。在一实施方式中，所述部分具有圆形形状，凹槽从所述部分的中心径向延伸到覆盖基板的可变形层的至少一个区域，并且多电极结构包括至少一个螺旋电极。心肌细胞的径向排列的组件可以用于周期性地使得可变形层变形以引起心肌细胞的同步对齐拉伸和收缩。已经进一步发现，电极的形状对可变形层的实际柔性具有直接影响，一个或多个电极从所述部分的中心螺旋向外最小化了由电极引起的对可变形层的面外变形的阻力。换句话说，这样的螺旋电极提供给本发明的具有圆形部分的装置最柔性的构型。在多电极的情形下，这些电极可以以交叉(interdigitated)或者交织(interwoven)的构型布置以最大化电极布局的紧凑性。在替代实施方式中，可变形层包括相对的末端，其中，所述部分沿着在相对末端之间延伸的轴定位，所述部分将所述相对末端彼此分隔。在这个实施方式中，可变形层可以具有所谓的狗骨形状，其特征在于，由在两个末端部分之间的相对窄的中央部分互连两个末端部分。中央部分典型地安置在基板腔上。该配置具有如下优点:凹槽的排列可以有目的地被选择以有利于心肌细胞在特定方向即沿着它们的主轴或者在横向方向上拉伸。为此，排列细胞的凹槽可以在平行于所述轴或者垂直于所述轴的方向延伸。优选地，多电极配置包括在所述部分上在平行于所述轴的方向延伸的多个电极，这具有如下优点:当可变形层变形时电极在它们的长度方向并不明显被拉伸，从而提高了装置的稳固性。粘附可变形层到基板的狗骨形状的可变形层的末端部分可以具有大致半圆形形状，由于上面已经给出的原因，电极互连部从狗骨形状的中心部分螺旋向着半圆形末端部分的边缘。在一实施方式中，在基板上的可变形层的边缘包括锥形突起，所述突起在离开所述部分的方向向内渐缩；所述基板带有接合垫；以及该装置进一步包括在多电极结构和接合垫之间的互连部。所述互连部在锥形突起上从所述部分延伸到接合垫。已经发现，这提高了互连部堆叠在可变形层和基板之间的交叉点处的稳固性，这是因为这样的事实:在可变形层边界和基板之间的角度通过这些突起减�。佣档土擞纱涌杀湫尾惚咴档交宓奶ń姿碌幕チУ奈Ｏ�。本发明的装置可以被包括在一组件中，该组件包括:具有流体入口的压力腔室；其中所述部分在压力腔室上形成膜；和位于所述部分上的储存器，所述凹槽图案和多电极结构面对储存器。通过附连心肌细胞到膜的上部并用包括被考察的化合物的组合物充填储存器从而暴露心肌细胞到该组合物，以及通过记录在受控的拉伸和松弛过程中心肌细胞的电活性例如场电势而监测心肌细胞对该暴露的响应，这样的装置可以用于心脏毒性测试目的。在一实施方式中，流体是诸如空气的气体，以使得所述部分的面外变形可以通过控制在压力腔室内部的气体压力而得以控制，从而模拟心脏跳动。这具有如下优点:在引起面外变形方面不需要流体接触该部分，从而减小了污染风险或者对心肌细胞造成损伤的风险。在替代实施方式中，流体是液体，可变形层包括入口。在这个实施方式中，布置在容器中的任何流体将包封堆叠的两个表面以使得流体在堆叠上的载荷将有效地为零。在这种情况中，堆叠的面外变形可以被机械地引发。根据本发明的另一方面，提供一种制造根据本发明的装置的方法。该方法被设计为重点在对大规模生产和再现的适合性。特别地，已经认识到，电极配置在可变形层上的形成会是有问题的，因为当试图在可变形层的顶部处理其它层时，这些层趋于起皱或者甚至分层。因此，在本发明的方法中，已经利用以下事实:包括PDMS的若干弹性体层可以自发地贴附到可变形层形成到的其上的层上，这是通过在基板上形成互连堆叠，并在互连堆叠上沉积可变形层进行，从而避免上述处理问题。在第一实施方式中，本发明的方法包括:提供基板；在基板后侧上提供图案化掩膜；在基板前侧上提供蚀刻停止层；在蚀刻停止层上形成包括接合垫和电极配置的互连部结构；在电极配置之间形成牺牲部分；通过可变形层覆盖在基板的前侧上生成的结构；在可变形层上提供图案化的蚀刻保护层，所述图案在接合垫上暴露可变形层的一区域；蚀刻暴露的可变形层以暴露所述接合垫；蚀刻基板的暴露的后侧以形成腔，所述蚀刻在蚀刻停止层上停止；移除图案化的蚀刻保护层和蚀刻停止层；和通过所述腔移除牺牲部分以在可变形层的所述部分中限定凹槽。在这个实施方式中，通过利用牺牲材料，例如蚀刻掩膜材料的一部分，凹槽被限定在可变形层中。在第二实施方式中，本发明的方法包括:提供基板；在基板后侧上提供图案化掩膜；在基板前侧上提供蚀刻停止层；在蚀刻停止层上形成包括接合垫和电极配置的互连部结构；移除在电极配置之间的蚀刻停止层；蚀刻在电极配置之间的凹槽区域；给凹槽区域衬上蚀刻停止层部分；通过可变形层覆盖在基板的前侧上生成的结构；在可变形层上提供图案化的蚀刻保护层，所述图案在接合垫上暴露可变形层的区域；蚀刻暴露的可变形层以暴露所述接合垫；蚀刻暴露的基板后侧以形成腔，所述蚀刻在蚀刻停止层上停止；移除图案化的蚀刻保护层和蚀刻停止层。在这个实施方式中，凹槽通过在沉积可变形层之前将它们蚀刻到基板中而被限定。两个实施方式解决相同的技术问题，即如何在可变形材料，特别是弹性材料，甚至更特别地在PDMS层中提供轮廓分明(well-defined)的图案，正如已知的，轮廓分明的图案，尤其是具有锋利边缘的图案，仅可以利用模制技术形成。因此，通过以牺牲材料的一部分的形式，或者以蚀刻的沟或者凹槽的形式为基板提供期望的凹槽形状，可变形层材料可以简单地沉积在这些形状上而无需可变形层材料的任何图案化处理。优选地，所述方法进一步包括，在基板的后侧上提供图案化的掩膜之前，在基板的前侧上提供图案化的掩膜，所述图案化的掩膜暴露基板的电极区域；在基板的后侧上提供蚀刻保护层；在所述电极区域中蚀刻金字塔形状的凹陷；以及移除图案化的掩膜和蚀刻保护层。提供这样的金字塔形状凹陷有利于形成金字塔形状电极，其提供与上述组件中的储存器中的组合物的改进的接触。由本发明的方法的上述实施方式产生的装置可以安装在包含压力腔室的内插器上以使得可变形层的一部分在压力腔室上形成膜。此外，粘合剂涂层可以被提供到可变形层的具有凹槽的表面上，此后，心肌细胞可以在培养介质中植入到粘合剂涂层上以开始心肌细胞在凹槽中的自发排列。这具有如下优点:心肌细胞可以在使用之前立即施加到可变形层，从而保证心肌细胞在使用过程中处于良好状态。如此的使用可以延续延长的时间段，例如，数周，包含心肌细胞的培养介质可以在例如使用前48小时施加以允许完成自发排列。根据本发明的装置有利于体外读出培养的心肌细胞的电生理学特征。可以想到，该装置可以用于任何试验，其中心肌细胞的电生理学是所关心的，例如，心脏发展、遗传病的表型分析、应力情形分析等。根据本发明的另一方面，提供一种确定心肌细胞对化合物的电生理学响应，例如对化合物的心脏毒性的方法，包括:提供本发明的组件，为储存器提供包括化合物的介质以暴露心肌细胞到所述化合物；和测量心肌细胞对所述暴露的响应。以这样的方法使用本发明的组件提供在化合物例如试验药物的心脏毒性确定精度方面的提高。
现参照附图借助于非限定性的例子更详细地描述本发明的实施方式，其中:图1示意性地示出制造根据本发明的实施方式的用于电生理学筛查的装置的方法;图2和3示意性地示出通过图1的方法获得的电生理学筛查装置的两个不同的实施方式的顶视图；图4示意性地示出制造根据本发明的另一实施方式的电生理学筛查装置的方法；图5和6示意性地示出由图4的方法获得的用于电生理学筛查的装置的两种不同的实施方式的顶视图；图7示意性地示出心肌细胞的伸缩方式；图8是在具有凹槽的PDMS基板中培育和排列的E17，5老鼠心肌细胞的共焦的显微图像；图9示意性地示出根据本发明的实施方式的装置的可变形的圆形膜；图10示出图9的膜的应力试验模拟结果；图11更为详细地示出根据本发明的实施方式的装置的另一圆形膜；图12示出根据本发明的另一实施方式的装置的狗骨形状的可变形层；图13示出根据本发明的又另一实施方式的装置的狗骨形状的可变形层；以及图14示出根据本发明的又另一实施方式的装置的方面。
具体实施例方式应当理解，附图仅仅是示意性的，并且不是按比例绘制的。还应当理解，在整个附图中，用相同的附图标记表示相同或者类似的部分/部件。本发明的用于电生理学筛查的装置是基于以下一般结构原理。基于弹性体的堆叠安装在基板中的腔上。该腔有效地将基于弹性体的堆叠的一部分与基板分离，以使得该部分的弹性属性被促进以从基板的表面的平面中移动出来。可以想到这样的装置的若干实施方式，如将在下面更详细地讨论的。
在图1中，示出制造本发明的装置的第一实施方式的方法。在步骤(a)中，提供优选地具有大约300-400微米的厚度的基板10，该基板可以是硅基板，或者可以是其它适当基板材料。为了简洁，本描述的其它部分将通过仅非限定性例子的形式假定基板10是硅基板。基板10的后侧设置有适当的硬蚀刻掩模12’，例如LPCVD生长的氮化硅(Si3N4)。在硅基板10的前侧上设置另一硬蚀刻掩模12，其优选地为与硬蚀刻掩模12’是相同材料。在一个实施方式中，可以使用单一的沉积步骤，从而导致形成硬蚀刻掩模12’和另一硬蚀刻掩模12。另一硬蚀刻掩模12被图案化以限定具有作为非限定性例子的10x10微米或者20x20微米尺寸的正方形开口 14。其它的适当尺寸对于本领域技术人员来说将是明显的。在下一步骤(b)中，基板10的前侧暴露于各向异性刻蚀步骤，例如，利用KOH以在基板10中在开口 14的位置形成金字塔形状的凹陷16。该方法进行到步骤(C)，其中例如利用湿性蚀刻使得硬蚀刻掩模12和12’从基板10移除。适当的蚀刻配方本身对于本领域技术人员来说是已知的，因此为了简洁，在本说明书中省略对蚀刻配方的描述。注意到，金字塔形状的凹陷形成用于金字塔形状电极的模板，如将在后面更详细地解释的。但是，应当理解，这样的金字塔形状电极是完全可选的，并且步骤(a)-(c)可以被省略，这并不背离如图1所示的本发明的方法的实施方式。在步骤(d)中，热氧化层18和18’分别在基板10的前侧和后侧生长。热氧化层优选地具有大约I微米的厚度。热氧化层18’将用作蚀刻掩膜，热氧化层18将用作在随后工艺步骤中的蚀刻停止层(参见下文)。在步骤(e)中，热氧化层18’例如通过蚀刻被图案化，以限定形成在基板10中的腔的尺寸和形状。这同样限定了待形成的可变形层的用作覆盖基板10中的腔的膜的部分的尺寸和形状。在步骤(f) - (i)中，制造包括电极和接合垫的互连部结构(interconnectstructures)。首先，在步骤(f)中设置图案化的下隔离层22，之后在步骤(g)中在图案化的下隔离层22上增加各导体部分24，其随后在步骤(h)中被上隔离层26覆盖。作为非限定性例子，聚对二甲苯可以用于下和上隔离层22，26，TiN可以用作导体材料24。聚对二甲苯是特别适当的绝缘材料，因为它是生物相容的、不脆并且可拉伸至一定程度。TiN是特别适当的，因为它通常用作具有良好性能的电极材料，并且因为它具有与其它层的良好粘合性。但是，应当理解，还可以使用其它材料。例如，氮化硅或者氧化硅层可以用于隔离层22，26，其它金属例如金或者钼可以用作导体材料24。在一实施方式中，Ti或者Au用作导电材料，因为已经表明薄的钛和金层可以拉伸高达100%，从而允许传导图案被拉伸而不会被损坏。进一步注意到，对于用作电极的互连部结构，下隔离层在形成电极之前例如通过选择性的蚀刻步骤而予以移除。在步骤(i)中，接合层28沉积在互连部结构的限定接合垫的部分的顶部。例如，接合垫可以设置有I微米厚的Al (Si/Cu)层。当TiN用作导体材料24时，通常需要接合层28，因为TiN并不是可接合的。对于本领域技术人员而言非常明显的是，如果使用可以直接接合的导体材料24，步骤(i)可以被省略。在步骤(j)中，牺牲层30例如抗蚀层被沉积以待形成在可变形层的膜部分中的凹槽的形状图案化。牺牲层30可以具有大约10-20微米的厚度。生成的结构被覆盖在优选具有大约25微米厚度的可变形材料32的层中，如在步骤(k)中所示的。可变形材料优选地是弹性体，更优选地为PDMS。PDMS可以旋涂到在步骤(j)后生成的结构上，并随后在适当的温度例如90 ° C下被固化。在步骤(I)中，例如30_50nm厚的薄的铝层34形成在可变形层32的表面上，例如通过溅射蒸发物以在可变形层32上提供钝化层。如果可变形层32是PDMS层，这是特别有用的，因为PDMS具有易于粘附到其它表面例如在作业设备中的真空表面和静电卡盘的倾向。薄层34随后被掩膜层36覆盖。接着，在步骤(m)中，在接合垫的位置38处，掩膜层36和钝化层34被开口，在步骤(η)中，可变形层32被开口，以提供到接合垫的通路。掩膜层36还可在步骤(η)中被移除。可变形层32可以利用任何适当的蚀刻配方例如通过活性离子蚀刻来开口。在步骤(ο)中，晶片被翻转(未示出)，然后通过蚀刻掉基板10直到已经抵达蚀刻停止层18,形成腔40。在一优选实施方式中，腔40通过利用Bosch工艺形成,其中Bosch工艺为干蚀刻工艺。或者，腔40可通过利用任何适当的配方，例如作为非限定性例子的HF/HNO3/乙酸(HNA)蚀刻配方，湿性蚀刻基板10的暴露的后侧而形成，尽管对于HNA配方必须小心以免损坏蚀刻停止层，以及随后攻击晶片的前侧。之后，如在步骤(P)中所示，惰性层34被移除，然后，在步骤(q)中移除蚀刻停止层18和掩膜层18’，在步骤(r)中移除牺牲层部分30。这可以通过一系列的适当的湿性蚀刻步骤完成。通过移除牺牲层部分30，可变形层32中的凹槽44被暴露，S卩，被开口。在基板10包括多个腔42的情形下，例如，在基板10是晶片的情形下，晶片现在可以被切为单个的装置100。在步骤(s)中，装置100被翻转。作为非限定性的例子，所述装置被示出为具有被在可变形层32中的凹槽44分离的接合垫120、电极110和110’、和互连部结构110”。在步骤(t)中，可以通过安装装置100到内插器200上而形成组件，该组件可以包括密封件202，用于在内插器200和装置100之间建立流体密闭连接。该安装可以限定压力腔室220，对于该腔室，可变形层32的至少膜部分用作盖，流体例如气体例如空气或者液体可以经由入口210提供。粘合剂，优选生物粘合剂，更优选纤维连接蛋白，可以涂覆到可变形层32的凹槽表面上，此后，例如在细胞培养介质150中的心肌细胞130可以植入到可变形层32的涂覆表面上，从而使得心肌细胞130自发排列在可变形层32的凹槽44中。如果心肌细胞130需要尽可能地鲜活的话，该植入可以刚好在使用心肌细胞组件之前在装置上执行。如果可变形层32是PDMS层，则心肌细胞排列过程是最为有效的，其中，凹槽44的侧壁与可变形层32的升高部分形成尖锐的角，例如90°。优选地，凹槽44具有矩形形状，其宽度和深度各自选自5-45微米的范围。更优选地，凹槽44具有正方形形状，其宽度和深度各自为20微米。PDMS是特别适合的材料的另一个原因是由于它是生物相容的并且可以拉长高达100%。容器结构140被贴附，例如胶粘到可变形层32以在它的凹槽膜部分上限定储存器。容器结构140可例如为玻璃或者塑料环，或者任何其它适当结构。储存器可以填充有培养介质。在优选实施方式中，其心脏毒性将被测试的化合物可以在任何点被加入，例如，可以在培养介质已经布置在储存器中之后加入。接合垫120连接到导线240，该导线连接接合垫到外部线路(未示出)，例如印刷电路板。其它的适当的组件装置对于本领域技术人员来说是明显的。在操作中，也就是，在心肌细胞130通过凹槽44排列后，储存器可以填充有溶液150。覆盖心肌细胞130的溶液150可以是上述的培养介质、Tyrode溶液、用于电生理学的标准缓冲液或者用于细胞培养的标准的营养液，即所谓的培养介质，并且可以包含不同浓度的分子(例如诸如钾、钠和钙的电解液、氨基酸、蛋白质和化学制品(例如引发过度生长和/或引发氧化应力的化合物)。此外，PH和气氛情况可以变化以模拟体内已知的不同(病态)生理病情，例如由过渡锻炼所致的病情，这些病情的特征在于，例如，PH降低，钾浓度升高、O2浓度降低等。实验可以从基线测量开始，之后，所关心的化合物可以被加入到溶液150中。还可以想到，不同类型的心肌细胞，或者不同的情形被进行比较。在实验过程中，在一优选实施方式中，心肌细胞响应，也就是心肌细胞130对所关心的暴露的响应可以随着时间进行监测，药物浓度可以累积增大以测量心肌细胞130的对剂量的响应。在本发明的上下文中，应当理解，术语“化合物”并不意在限制为打算用作药品的化合物，或者被限制到仅单种化合物。总的来说，任何物质，例如化合物混合物、乳液和包括一种或多种化合物的溶液都可以利用本发明的装置进行测试。压力腔室220中的压力可以被调节，例如，通过经由入口 210抽出或者增加诸如空气的气体而降低或者增大。当降低压力腔室220中的压力时，这迫使可变形层32的凹槽部分在远离基板10的平面的方向拉伸，例如远离储存器，或者当增大压力腔室220中的压力时，则迫使可变形层32的凹槽部分靠近储存器。结果，组装到可变形层32的凹槽部分上的活的心肌细胞在该过程中也被拉伸。此外，心肌细胞的自动收缩引发可变形层32的凹槽部分的平面内变形，这包括在心肌细胞130下方的可变形层32的凹槽部分的变厚(收缩)和在心肌细胞所在区域之外的可变形层32的凹槽部分的变薄(拉伸)。如图l(t)所示的组件具有带凹槽的可变形层32的事实具有两个主要优点。第一，重复的拉伸可以施加到不成熟的心肌细胞，例如源自干细胞源的心肌细胞，以进一步熟化这些细胞为成熟心肌细胞。这保证装置包括完全成熟的心肌细胞，这提高通过该装置获得的临床数据的相关性。还提供测量在成熟过程中细胞的电生理学变化的可能。第二，可变形层32可以与心肌细胞130的收缩节奏同步地被拉伸，其频率和力可以在心脏的(病态)生理范围内进行选择，以模拟在跳动的心脏中发生的心肌细胞拉伸。这例如允许自排列的心肌细胞130被动拉伸以允许在动态心肌细胞模型系统中(通过记录场电势)进行离子通道测量，从而模拟处于休息状态和在受控(病态)生理应力下的心脏。心肌细胞收缩节奏可以是自动的，或者为具有选取频率的电诱发的。在图2中示出的是，当采用图1所示的方法时，在可变形层32中的凹槽44必须在电极110以及相关的互连部112的位置中断。这对于其中膜是圆形形状的装置是特别相关的。换言之，电极110及相关的互连部112定位在分离凹槽44的脊上。当在可变形层32的膜部分上植入心肌细胞130时，心肌细胞130会不可避免地覆盖这些脊，尽管大多数的心肌细胞130将在凹槽44中自发排列。结果，大多数的心肌细胞130将在凹槽44中处于对齐并互连的形式，以使得仍可从心肌细胞130的协调的拉伸/收缩周期获得有意义的读数。图3示出通过采用图1的方法获得的装置的替代实施方式，其中膜具有矩形形状。在这个实施方式中，凹槽44可以在可变形层32的整个长度上延伸，在此情形下，电极110的互连部112在分隔凹槽44的脊上平行于所述凹槽44延伸。图4示出本发明的方法的替代实施方式，其中电极110形成在凹槽44中。该替代实施方式可以遵循如图1所示的步骤(a)_(i)，从而提供如图4(a)所示的生成结构。需要重申的是，图1的步骤(a)-(c)是可选择的，如前面所解释的。在图4的步骤(b)中，蚀刻停止层12，其如前所述可以为LPCVD沉积Si3N4层或者可以为热氧化层，在各互连部结构之间的选取位置处开口。适当的蚀刻步骤，例如RIE步骤，随后被执行以限定分隔待形成的凹槽44的脊44’的轮廓。在步骤(c)中，脊44’的轮廓被衬有同样用于蚀刻停止层18的蚀刻停止层材料的部分18”，以使得连续的蚀刻停止层再次在基板10的前侧上形成。该方法现可以如在前面描述的图1的步骤(k)-(s)进行，包括沉积可变形层32和形成腔42，同样如图4(d)所示。图4(e)示出生成的组件。注意到，与图l(t)的组件相反，电极110，110’和互连部结构110”现形成在装置100的凹槽44中。通过图4示出的方法具有如下优点:凹槽44不必被脊44’中断，因为电极110及相关的互连部112也形成在凹槽44中，如图5所示。如图6所示，其示出通过图4的方法获得的装置的替代实施方式，当电极110和互连部112形成在凹槽44中时，脊自身也不必被中断。图7示意性地示出心肌细胞130，其可以在其主轴即沿着X轴的方向，或者在与其主轴相横向的方向即沿着y轴方向被拉伸。当培养细胞时，这些不同的拉伸模式可以用于实现不同类型的细胞区分/熟化。图8提供心肌细胞130在涂覆有纤维连接蛋白的弹性凹槽层32中自发排列的能力的试验性的证据。白色箭头表示在带凹槽的PDMS基板上排列的E17, 5老鼠心肌细胞。心肌细胞被DAP1、α -肌动蛋白和鬼笔环肽着色，以为了在用于产生如图8所示的图像的共焦显微镜下更容易探测到。可变形层32的膜部分可以具有任何适当的形状。例如，在图9的顶视图中，膜部分具有圆形形状，其带有螺旋电极110和110’。凹槽(未示出)的图案从膜部分的中心向着膜部分的边缘，即向着附着到基板10上的可变形层32的部分径向延伸。尽管螺旋电极比弯曲或者径向延伸的电极例如平行于径向延伸的凹槽延伸的电极被需要更多，但是，已经发现，弯曲或者径向延伸的电极导致可变形层32明显变硬，因为在实践中在所述电极中的拉伸容差被限制到它们长度的10-20%。此外，弯曲或者径向延伸的电极导致在可变形层32的拉伸周期过程中在互连部结构上产生明显的应变，从而通过互连疲劳加速装置失效。相反，螺旋形状的电极为可变形层32提供增强的柔性。这在图10的顶视图中被演示，其中当反压施加到膜部分时，图9的装置的机械应力试验模拟结果被示出。可以从膜部分的中心到它的边缘画出虚拟的辐射线。当沿着这些线时，它将跨过螺旋互连部结构数次，而这些交叉部自身仅连接到高度柔性的弹性体，例如PDMS，螺旋互连部结构的交叉部分主要在它们的宽度方向被拉伸。结果，膜自身是高度柔性的，而在互连部结构中的应力保持非常低，如图10的模拟结果所表明的。图11示出包括16个螺旋电极和径向排列凹槽的实际装置100。在具有圆形膜部分的装置100中，例如在如图11所示的装置中，排列的凹槽从中心径向延伸到膜的边缘，如以前解释的。结果，当施加外部压力到膜时，例如通过在例如图1⑴的组件中加压压力腔室220，其典型地将圆形膜膨胀为圆顶形状，则排列的心肌细胞同时受到各向同性的拉伸力，也就是，在它们的主轴方向以及与它们的主轴方向相横向的方向基本相同大小的力。但是，如前面解释的，使得心肌细胞130仅沿着它们的主轴或者与它们的主轴相横向的方向受到拉伸力，这会是期望的。这可以通过改变可变形层32的膜部分，即覆盖所述腔的部分的形状以及下方的腔42而实现。具有这样的适当形状的装置100的例子的顶视图示出在图12中。在此，可变形层32具有所谓的狗骨形状，其中末端部分32”附连到下方的基板10并通过覆盖下方的腔42的膜部分32’彼此分离。凹槽44平行于在两个末端部分32”之间通过膜部分32’延伸的虚拟的水平轴。当受到来自压力腔室220的压力时，膜部分32’的尺寸变化为使得其将呈现圆柱形状。因此，膜部分32’在与虚拟的水平轴相横向的方向被拉伸，结果，与凹槽44对齐以使得它们的主轴与虚拟轴对齐的心肌细胞130在与它们的主轴相横向的方向被拉伸。为了实现膜部分32’的圆柱变形，膜部分32’可具有矩形形状，它的长边平行于在两个末端部分32”之间通过膜部分32’延伸的虚拟水平轴。电极110和它们的互连部应当优选地平行于在膜部分32’上的该虚拟水平轴，要么与凹槽44相邻地要么在凹槽44内部延伸，这取决于采用本发明的哪种制造方法。这保证电极和它们的互连部在它们的长度方向不明显拉伸，因为膜部分32’的主要变形位于横向方向，如前面解释的。因此，这提高装置100的寿命，因为电极110和它们的互连部更不易于由于延长拉伸而失效。可变形层32的末端部分32”可以具有任何适当的形状。在图12中，末端部分32”具有半圆形形状，金属互连部从膜部分32’的边缘螺旋向外延伸到接合垫120。如以前解释的，在可变形层32上的金属部分的螺旋形状确保由这些金属部分经受的应力与直线或者弯曲形状相比明显降低。应当理解，在本发明的情形中，螺旋电极或者互连部可以具有根据限定螺旋形状或者螺旋线形状的数学方程式弯曲的形状。但是，显然，电极或者互连部可以包括小于单节距的螺旋形状或者螺旋线形状。如图12所示的装置促使心肌细胞130暴露到主要在与它们的主轴相横向的方向上拉伸的模式。但是，通过在大致垂直于在两个末端部分32之间通过膜部分32’延伸的虚拟水平轴的方向对齐凹槽44，心肌细胞130将经受主要在平行于它们的主轴的方向上拉伸的模式。这示出在图13中。凹槽44可以如图2所示地被中断以允许电极互连部从膜部分32’延伸到可变形层32的末端部分32”。互连部失效是装置失效的一个主要原因，尤其是在可变形层32许多个拉伸收缩周期之后。如图14的左面所示，装置设计中的一个关键点是互连部112跨过可变形层32和带有接合垫120的基板10之间的交界处的那个点。弹性可变形层32和刚性基板10的柔性之间的大的差异意味着互连部112在该边界处受到增大的应力，在那里互连部112已经更趋于由于互连部中的尖角而失效，该尖角是由从上层即可变形层32到下层即基板10的表面的台阶所致。这可以通过在可变形层32与基板10的边界处使得可变形层32变硬，例如通过在可变形层32中包含变硬结构而得以解决，但是，这要求大量的额外的工艺步骤，这增加了装置的复杂性和成本。更成本有效的解决方案示出在图14的右面，其中可变形层32成形为具有延伸到基板10上的指状件132，互连部112在指状件132上被导引到基板10上。指状件132具有远离可变形层32向内渐缩的锥形形状。换言之，指状件132在可变形层末端处具有宽度W1，其大于在基板末端处的宽度W2。这些锥形延伸部限制层32的变形，从而限制在装置100的使用过程中互连部112的台阶角度的变化。锥形延伸部132可以得以形成而无需额外的工艺步骤，因此，是提高互连部在这些边界处的稳定性的成本有效的方法。应当理解，装置100的许多变体都是可能的，这并不背离本发明。例如，指出的是，本发明的装置100的多电极配置可以用多个传感器实现而非采用电极。这样的传感器的非限制性例子包括可以测量由心肌细胞的收缩引起的力的大小的应变仪，以及可以测量由这些细胞产生的热量多少的微热量计。进一步指出的是，尽管本发明的装置100的实施方式已经被示出以仅包括无源装置，但是，包括多电极配置的互连层可额外地包含用于形成例如可以执行信号放大以及信号整形功能的电路的有源装置。应当认识到，本发明的装置使得可以测量由心肌细胞产生的场电势。场电势延长/缩短与动作电势延长/缩短直接相关，并可以用于预测化合物关于QT间期的影响，QT间期代表从QRS络合物开始到心脏节奏T波结束测量的心室除极和随后的心室复极的持续时间的间期；以及心肌细胞的电活性和节奏的其它异常。与在其中细胞在固态基板上进行培养的稳态系统中执行的电生理学测量相比，本发明的装置模拟真实心脏组织。这允许精确模拟药物性心律失常情形，例如由于长的QT综合症所致的心律不齐，其发生在体育运动过程中当心脏速率、舒张末期心室体积和充盈压力增大以引起需要增大心脏输出时。心室壁心肌细胞的拉伸程度和心肌细胞的收缩力之间的直接关系在Frank-Starling定律中予以描述。随着增强的拉伸，收缩力增大直到达到某点,在该点进一步的拉伸由于收缩丝(contractile filament)之间的失配而导致心脏输出减小。收缩力的拉伸相关的增大已经被描述为机电反馈。心肌细胞130的该(病态)生理拉伸在离子通道活动中起到作用并趋于导致心律不齐。本发明的可拉伸的装置使得可以通过记录在受控的心肌细胞拉伸和收缩的(病态)生理情形下心肌细胞的电场电势而测量离子通道活性成为可能。通过该装置，也可以在特定的基于心肌细胞的疾病模型，例如肥厚型心肌病疾病模型和充血性心力衰竭疾病模型中执行如上所述的这样的离子通道活动测量。心脏肥大疾病模型可以例如通过利用包含引起基因突变的人体干细胞衍生的心肌细胞产生。例如由心肌梗塞引起的急性心力衰竭的疾病模型可以大致由病理学地拉伸贴附到本发明的可拉伸的装置堆叠的心肌细胞而产生。离子通道活性(电场电势)和收缩力的连续记录可以用于监测疾病发展。这样的疾病模型系统因此可以用于发现药物靶标，即，识别在疾病过程中扮演肇因角色的特定生物分子，以及可以用于发现可用于治疗疾病的化合物，以及用于药物研发。显然，化合物关于特定疾病状态的潜在心脏毒性也可以在相关的疾病模型系统中进行测试。上述疾病模型的发展还会要求活的心肌细胞130暴露到包含存在于血液中的溶质，例如，电解液、O2、CO2、葡萄糖、某些蛋白质和代谢物等的溶液，其中该溶液的浓度为已知能够在模拟的疾病中扮演肇因角色的浓度。因此，心肌细胞130对这样的溶质的响应也可以用于找寻和验证药物标靶。通过本发明的装置100的实施方式执行的实验的非限定性的例子可以归纳如下。
在装置生产后，带凹槽的可变形层32，优选PDMS层，被涂覆有生物粘合剂，优选地纤维连接蛋白。然后，在带有凹槽的可变形层32上在储存器中的适当的培养介质150中培植心肌细胞130的单一细胞悬液。装置100然后被放入培育器中足够的时间段，例如48小时，以使得在采用PDMS膜的情形下使得心肌细胞130以前述的自我排列的方式粘附到膜。在这个阶段，未成熟的心肌细胞130可以被拉伸以为了熟化的目的，尽管该阶段可以被省略。装置100可以通过在仅具有介质150的情形下执行基线记录而被校准。在校准后，所关心的化合物或者刺激被加到介质150，然后开始采集数据。取决于所关心的化合物的属性，数据采集，也就是化合物响应测量，可以在从关于离子通道阻滞剂的几分钟到关于所关心的其他类型的化合物的几天的范围。在完成测量时，所关心的化合物的剂量可以被增大，然后重复测量以为了累积剂量响应曲线测试目的。对于技术人员来说明显的是，可以对上面的示例性的实验进行许多变化而不背离本发明的范围。例如，在回收和/或熟化心肌细胞130后，培养介质150的组合物可以例如通过改变离子浓度、pH、温度、低氧等而变化。对上面的示例性的实验的其它改变对于技术人员来说将是明显的。应当注意到，上述实施方式是示出而不是限制本发明，并且本领域技术人员将能够设计出许多替代实施方式而不超出所附权利要求的范围。在权利要求中，放在括号内的任何附图标记不应解释为限制权利要求。词语“包括”并不排除除了权利要求中所列的元件或者步骤之外的元件或者步骤的存在。当没有提及元件的数量时，这意味着并不排除存在多个这样的元件。事实上，在彼此不同的从属权利要求中存在的某些特征并不意味着这些特征的组合不会具有有益技术效果。
权利要求
1.用于心脏电生理学筛查的装置(100)，其包括: 包含腔(42)的基板(10)，所述基板带有在所述腔上延伸的可变形层(32)，其中所述可变形层的一部分(32’ )覆盖所述腔，所述部分具有包括凹槽(44)图案的表面，并带有电极结构(110，110’ )和粘合剂涂层；和 粘附到所述涂层并组装在至少一些所述凹槽中的多个心肌细胞(130)。
2.如权利要求1所述的装置(100)，其中，各个所述凹槽(44)具有一对侧壁，每个侧壁与所述可变形层(32)的表面形成大致垂直的角度。
3.如权利要求1所述的装置(100)，其中: 所述部分(32’ )具有圆形形状； 所述凹槽(44)从所 述部分的中心径向延伸到覆盖所述基板(10)的所述可变形层(32)的至少一个区域；以及 所述电极结构(110，110’ )包括至少一个螺旋电极。
4.如权利要求1所述的装置(100)，其中，所述可变形层(32)包括相对的末端(32”)，其中所述部分(32’ )沿着在所述相对末端之间延伸的虚拟轴定位，所述部分使所述相对末端彼此分隔。
5.如权利要求4所述的装置(100)，其中，所述凹槽(44)在平行于或者垂直于所述轴的方向延伸。
6.如权利要求4或5所述的装置(100)，其中，所述电极配置(110)包括在所述部分(32’ )上在平行于所述轴的方向延伸的多个电极。
7.如前述权利要求任一项所述的装置(100)，其中，所述可变形层(32)是PDMS层。
8.如前述权利要求任一项所述的装置(100)，其中: 在所述基板(10)上的所述可变形层(32)的边缘包括锥形突起(132)，所述突起在远离所述部分(32’ )的方向向内渐缩； 所述基板带有接合垫(120);以及 所述装置进一步包括在所述电极结构(110，110’)和所述接合垫之间的互连部(112)，所述互连部在所述锥形突起上从所述部分延伸到所述接合垫。
9.组件，其包括: 包含入口(210)的压力腔室(220)； 如权利要求1-8任一项所述的装置(100)，其中所述部分(32’ )在所述压力腔室上形成膜；以及 位于所述部分上的储存器(140)，所述凹槽(44)图案和所述电极结构(110，110’ )面对所述储存器。
10.制造如权利要求1所述的装置(100)的方法，包括: 提供基板(10)； 在所述基板的后侧上提供图案化的掩膜(18’ )； 在所述基板的前侧上提供蚀刻停止层(18)； 在所述蚀刻停止层上形成包括接合垫和电极配置的互连部结构(22，24，26，28)； 在所述电极配置之间形成牺牲部分(30)； 通过可变形层(32)覆盖在基板的前侧上生成的结构；在可变形层上提供图案化的蚀刻保护层(36)，所述图案在接合垫上暴露可变形层的一区域(38)； 蚀刻暴露的可变形层以暴露所述接合垫； 蚀刻暴露的基板的后侧以形成腔(42)，所述蚀刻在蚀刻停止层(18)上停止； 移除图案化的蚀刻保护层(18’ )和蚀刻停止层(18);以及 通过所述腔移除牺牲部分(30)以在可变形层的所述部分中限定凹槽(44)。
11.制造如权利要求1所述的装置(100)的方法，包括: 提供基板(10)； 在所述基板的后侧上提供图案化的掩膜(18’ )； 在所述基板的前侧上提供蚀刻停止层(18)； 在所述蚀刻停止层上形成包括接合垫和电极配置的互连部结构(22，24，26，28)； 移除在所述电极配置之间的蚀刻停止层； 在所述电极配置之间蚀刻凹槽分隔区域(44’ )； 将所述凹槽分隔区域衬上蚀刻停止层部分(18”)； 通过可变形层(32)覆盖在所述基板的前侧上生成的结构； 在可变形层上提供图案化的蚀刻`保护层(36)，所述图案暴露在接合垫上的可变形层的一区域(38)； 蚀刻暴露的可变形层以暴露所述接合垫； 蚀刻暴露的基板后侧以形成腔(42)，所述蚀刻在蚀刻停止层(18，18”)上停止；以及 移除图案化的蚀刻保护层(18’ )和蚀刻停止层(18，18”)。
12.如权利要求10或者11所述的方法，在基板(10)的后侧上提供图案化的掩膜(18’)之前，进一步包括: 在基板的前侧上提供另一图案化的掩膜(12)，所述图案化的掩膜暴露基板的电极区域(14)； 在基板的后侧上提供蚀刻保护层(12’ )； 在所述电极区域中蚀刻金字塔形状的凹陷(16);以及 移除所述另一图案化的掩膜(12)和蚀刻保护层(12’)。
13.如权利要求10-12任一项所述的方法，进一步包括在包含压力腔室(220)的内插器(200)上安装所获得的结构以使得可变形层(32)的一部分(32’ )在压力腔室上形成膜。
14.如权利要求10-13任一项所述的方法，进一步包括在包含凹槽的可变形层的表面上提供粘合剂，以及在所述粘合剂上植入心肌细胞。
15.确定心肌细胞对化合物的电生理学响应的方法，包括: 提供如权利要求9所述的组件； 为储存器(140)提供包含所述化合物的介质(150)以将心肌细胞(130)暴露于所述化合物；和 测量心肌细胞对所述暴露的响应。
全文摘要
本发明公开了一种用于心脏电生理学筛查的装置(100)，该装置包括包含腔(42)的基板(10)，所述基板带有在所述腔(42)上延伸的可变形层(32)，其中所述可变形层(32)的一部分覆盖所述腔并用作在所述腔(42)上的膜，所述部分具有包括凹槽(44)图案的表面，和带有多电极结构(110，110’)；所述装置还包括组装在至少一些所述凹槽(44)中的多个心肌细胞(130)。本发明还公开了制造这样的装置(100)的方法。
文档编号G01N33/50GK103201624SQ201180038579
公开日2013年7月10日 申请日期2011年7月13日 优先权日2010年8月5日
发明者R·德克尔, A·范德斯托尔佩, B·J·范梅尔, S·霍什费特拉特帕卡扎德, A·萨沃夫 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司
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