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专利名称：鉴定儿茶酚o-甲基转移酶调节剂的方法
鉴定儿茶酚O-甲基转移酶调节剂的方法本发明涉及鉴定儿茶酚O-甲基转移酶的酶活性的调节剂的方法儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)催化具有儿茶酚部分的底物的O-甲基化。被COMT甲基化中的甲基供体是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。COMT在内源性儿茶酚胺神经递质、儿茶酚雌激素和异生分子的分解代谢中起重要作用。COMT的抑制是开发帕金森症的新治疗方法的
重要途径。ff. F. Herblin(Analytical Biochemistry51,19-22,1973)描述了用于 COMT 活性的比色测定。该测定使用硝基儿茶酚作为COMT的甲基受体。在酸性pH下，硝基儿茶酚在水中以黄色溶液形式存在，最大吸收在350nm处。在微碱性pH下，对位羟基的电离使溶液变为橙色(λ max = 430nm)。在较强的碱中，间位轻基的电离导致楼桃红色溶液(λ max =520nm)。测定基于观测到硝基儿茶酚被COMT甲基化，并且甲基化的硝基儿茶酚不再表现出·由于第二次电离导致的樱桃红色。在此测定中底物(硝基儿茶酚)和SASM必须在μ M浓度范围内，所述范围处于或高于限制灵敏度的Κπ。G. Ziircher 和 Μ· Da Prada (Journal of Neurochemistry, Vol. 38, No. 1,1982)描述了 COMT活性的单步放射化学测定。在此测定中，通过将COMT与[3H]甲基SAM、Mg2+和腺苷脱氨基酶孵育，儿茶酚被转化为氚化的愈创木酚，它是具有非常低极性的化合物。用低极性介质例如甲苯提取愈创木酚，并用闪烁计数器计数。由于有限的灵敏度(比色测定)或由于测定设置(放射化学测定中的提取步骤)，上述测定不适于自动化筛选大量的化合物的COMT调节剂活性。因此，存在对适于筛选大量化合物的COMT调节活性的灵敏、均质的测定方法的需求。在第一个目的中，本发明提供鉴定儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)活性的调节剂的方法，包括以下步骤a)提供与荧光染料共价连接的COMT底物，b)将步骤a)的分子与儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和候选化合物接触，和c)测量步骤b)的混合物的荧光读数，其中在候选化合物存在下较之空白改变的荧光读数指示为儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的调节剂。在优选的实施方式中，方法是用于鉴定COMT抑制剂的方法，其中步骤c)中较之空白降低的荧光读数指示为COMT抑制剂。在另外优选的实施方式中COMT底物是4-硝基儿茶酚。在另外优选的实施方式中荧光染料是Alexa Fluor 488。在另外优选的实施方式中步骤c)中的荧光读数是动力学读数。在另外优选的实施方式中COMT是人C0MT。在另外优选的实施方式中方法是高通量筛选方法。在另外优选的实施方式中方法在微量滴定板中进行。在另外优选的实施方式中COMT的终浓度是约25nM。
在另外优选的实施方式中COMT底物的终浓度是约200nM。在另外优选的实施方式中SAM的终浓度是约500nM。在第二个目的中，本发明提供鉴定儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的底物方法，包括以下步骤a)提供包含与荧光染料共价连接的COMT底物和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的混合物，b)将步骤a)的混合物与不同浓度的候选化合物接触，c)将步骤b)的混合物与儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)接触，和d)测量步骤c)的混合物的动力学荧光读数，其中降低的荧光读数稳定水平作为增加的候选化合物浓度的函数指示为儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的底物。 在优选的实施方式中COMT底物是4-硝基儿茶酚。在另外优选的实施方式中荧光染料是Alexa Fluor 488。附图简述

图1显示了与4-硝基儿茶酚共价偶联的Alexa Fluor 488的化学结构；图2显示了硝基儿茶酚(蓝色)、2_甲氧基-5-硝基苯酚(红色)和1，2-二甲氧基-4-硝基苯(绿色)的Stern Volmer曲线；将20nM游离Alexa Fluor 488分别与高至25mM浓度的硝基儿茶酚、2-甲氧基-5-硝基苯酚和I，2-二甲氧基-4-硝基苯混合。仅对于硝基儿茶酚观察到了 Alexa488荧光强度(ItlA)的变化，甲基化产物不影响Alexa Fluor 488的荧光强度。图3显示了在本发明的荧光测定中，COMT催化的Alexa Fluor 488-硝基儿茶酚的甲基化的酶动力学；图4a显示了在多种浓度的COMT抑制剂托卡朋(Tolcapone)存在下，荧光强度的变化的动力学测量；图4b显示了从图3a的动力学测量的斜率计算的托卡朋的剂量应答曲线；图5显示了在COMT的天然底物多巴胺存在下的荧光测定。随着增加的多巴胺浓度，达到降低的稳定水平。由于多巴胺是底物，它和Alexa Fluor 488-硝基儿茶酚底物被甲基化。SAM的可获得性被限制(500nM)，使得在高多巴胺浓度下，Alexa Fluor 488-硝基儿茶酚底物不再能够被完全甲基化。图6显示了低(500nM)和高(200 μ M) SAM浓度下，以及对每个SAM浓度在加入Alexa Fluor 488-硝基儿茶酚底物前有和没有预孵育化合物和SAMl小时的底物的剂量应答曲线。与低SAM的预孵育将剂量应答曲线移动至较低的IC5tl因为化合物耗尽了 SAM。在高SAM浓度下，有和没有预孵育之间没有差别，因为SAM不限制，并且与低SAM相比，剂量应答曲线移动至较高IC5tl,因为化合物被耗尽。图7显示了低(500nM)和高(200 μ Μ) SAM浓度下，有和没有预孵育化合物与SAMl小时的SAM竞争化合物的剂量应答曲线。对于SAM竞争化合物，在每个SAM浓度，有和没有预孵育不影响IC5tl，但在高SAM浓度，IC50移动至较大值。发明详述本发明的测定基于这样的发现，即共价偶联至COMT底物的荧光染料(例如共价偶联至硝基儿茶酚的Alexa Fluor 488)由于分子内淬灭，表现出降低的荧光，以及COMT底物-荧光染料复合物中COMT底物被COMT甲基化消除了荧光的淬灭，即较之未甲基化的复合物，COMT底物-荧光染料复合物中COMT底物的甲基化导致荧光增加。术语“C0MT”在本文中用于指来自任何动物例如哺乳动物物种，包括人类的天然序列COMTjP COMT变体(在下文中进一步限定)。COMT多肽可从多种来源，包括人组织类型分离，或通过重组和/或合成方法制备。此测定中能够使用天然或重组生产的C0MT。“重组蛋白质”是依靠在异源细胞中表达，分离、纯化或鉴定的蛋白质，所述细胞已经用改造为驱动蛋白质在宿主细胞中表达的重组表达载体瞬时或稳定地转化或转染。能够在原核细胞(例如大肠杆菌)、酵母(例如粟酒裂殖酵母)或真核细胞(例如HEK293、Sf9昆虫细胞)中生产重组C0MT。优选地，Sf9昆虫细胞被用于重组COMT的高表达。用于测定的COMT可为纯化的。如本文所用的术语“纯化的”指从其天然环境或重组生产源移出的、分离的或分开的多肽，并且至少60%，更优选地至少80%不含与其天然缔合的其它组分，例如膜和微粒体。“天然序列C0MT”指与天然存在的COMT多肽具有相同氨基酸序列的多肽，无论其制备方式。天然序列COMT可从自然界分离，或通过重组和/或合成方法制备。术语“天然序列COMT”特别涵盖COMT的天然存在的截短的或分泌的形式、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位基因变体。人COMT多肽在NCBI数据库中的标识符是AAA68927 (Seq.1d. No.1)。术语“C0MT变体”指天然序列COMT的氨基酸序列变体，在天然序列中含有一个或多个氨基酸替换和/或缺失和/或插入。氨基酸序列变体通常与天然序列COMT的氨基酸序列具有至少约75 %，优选地至少约80 %，更优选地至少约85 %，甚至更优选地至少约90 %，最优选地至少约95%的序列同一性。术语“化合物”在本文中用于关于本发明的测定描述的上下文“测试化合物”或“药物候选化合物”。同样地，这些化合物包含源自合成的或从天然来源得到的有机或无机化合物。化合物包括特征为相对低分子量的无机和有机化合物，例如多核苷酸、脂类或激素类似物。其他生物聚合有机测试化合物包括包含从约2至约40个氨基酸的多肽和包含从约40至约500个氨基酸的较大的多肽，例如抗体或抗体缀合物。术语“动力学读数”指在酶促反应线性部分中的某两个时间点处测量的荧光信号的差异。一次测量在酶促反应开始时进行(起点)，并在孵育时间后进行第二次读数(终点)。然后以rfu/min计算最终信号为(rfu(终点)_rfu(起点))/孵育时间。(rfu :相对荧光单位)。本发明的方法可用于鉴定抑制酶儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的化合物。因此，由本发明的方法鉴定的COMT抑制剂可用于其中COMT钝化神经元外儿茶酚胺起作用的治疗、预防或控制疾病的方法，例如在预防或控制抑郁中。在此情况下本发明的化合物可用作单独的化合物或与其他有利地影响病程的治疗活性物质组合使用。本发明的化合物也可与其他治疗活性物质共同用药。本发明的方法可用于测定用测试化合物处理过的动物组织样品中COMT的活性。例如，测定适于测定来自动物(例如小鼠和大鼠)的脑和肝脏组织样品中的COMT活性，所述动物已经用测试化合物(C0MT调节剂)处理过。
实验部分4-硝基儿荼酪-Alexa Fluor 488的合成将含有I %三乙胺的DMSO中的氨乙基-硝基-邻苯二酚的IOmM溶液[I]与含有1%三乙胺的DMSO中的AlexaFluor 488羧酸琥拍酰亚胺酯的IOmM溶液[2] (InvitrogenCorporation, 5791Van Allen Way, Carlsbad, California92008)以1:1 的化学计量比混合。将反应混合物在室温轻轻混合过夜，在人kta ExplorerlOO反相HPLC上纯化。将产品冻干并重悬于DMS0。
权利要求
1.鉴定儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)活性的调节剂的方法，所述方法包括以下步骤a)提供与荧光染料共价连接的COMT底物，b)将步骤a)的分子与儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和候选化合物接触，和c)测量步骤b)的混合物的荧光读数，其中在候选化合物存在下较之空白改变的荧光读数指示为儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的调节剂。
2.权利要求1的方法，其中方法是用于鉴定COMT抑制剂的方法，并且步骤c)中较之空白降低的荧光读数指示为COMT抑制剂。
3.权利要求1或2的方法，其中COMT底物是4-硝基儿茶酚。
4.权利要求1至3的方法，其中荧光染料是AlexaFluor 488。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)中的荧光读数是动力学读数。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中COMT是人C0MT。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中方法是高通量筛选方法。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中方法在微量滴定板上进行。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中COMT的终浓度是约25mM。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中COMT底物的终浓度是约200nM。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中SAM的终浓度是约500nM。
12.鉴定儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的底物的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含与荧光染料共价连接的COMT底物和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的混合物，b)将步骤a)的混合物与不同浓度的候选化合物接触，c)将步骤b)的混合物与儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)接触，和d)测量步骤c)的混合物的动力学荧光读数，其中降低的荧光读数稳定水平作为增加的浓度的候选化合物的函数指示为儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的底物。
13.权利要求12的方法，其中COMT底物是4-硝基儿茶酚。
14.权利要求12或13的方法，其中荧光染料是AlexaFluor 488。
全文摘要
本发明涉及用于鉴定儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)酶活性的调节剂的方法。
文档编号G01N33/58GK103026236SQ201180036632
公开日2013年4月3日 申请日期2011年7月25日 优先权日2010年7月27日
发明者T·恩德勒, D·罗特 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司