专利名称：酶联免疫层析试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物检测技术领域，特别涉及一种酶联免疫层析试剂盒。
背景技术：
免疫学检测技术在医学和生物学领域被广泛应用。其中目前应用最为广泛的免疫学检测技术是免疫标记技术，即用胶体金、荧光素、酶或放射性核素等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应。标记物与抗体或抗原连接后并不改变后者的免疫特性，具有灵敏度高、 快速、可定性、定量、定位等优点。传统上多用荧光免疫法、化学发光法、酶联免疫吸附法(ELISA)及胶体金免疫层析法等。但荧光免疫法和化学发光法对技术要求高，而且必须配以昂贵的专有设备使用，因此只适用于一些大型医院及检疫部门等，不易进行常规开展；酶联免疫吸附法操作复杂，使用过程反应时间较长，需要对样品进行酶消化、震荡等处理，使用不是很方便；胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样本中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。
发明内容针对上述现有技术存在的缺陷，本实用新型要解决的技术问题为提供一种酶联免疫层析试剂盒，与现有方法相比，本实用新型试剂盒检测灵敏度高、分辨率好、特异性强。具体地，本实用新型提供了一种酶联免疫层析试剂盒，包括盒体和盒内的酶联免疫层析试纸条、试剂瓶和放试剂瓶的下凹瓶位；所述试纸条包括样品垫(I)、结合垫(2)、层析膜(3)、吸水垫(4)和背衬垫(7)，其中样品垫(I)、结合垫(2)、层析膜(3)和吸水垫(4)搭载于背衬垫(7)之上，样品垫(I)连接于结合垫(2)，结合垫(2)连接于层析膜(3)，层析膜(3 )上设置有质控带(5 )和检测带(6 )，层析膜(3 )连接于吸水垫(4);所述试剂瓶中分别装有系列浓度的待测物标准品、样品稀释液、底物显色液、洗涤液。上述试剂盒中，所述结合垫上固定有酶标记或生物素标记的特异性抗体，所述特异性抗体为可特异性结合待测物的抗体；所述质控带上包被有抗所述酶标记或生物素标记的特异性抗体的二抗；所述检测带上固定有可与待测物竞争性结合特异性抗体的抗原。所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或β -半乳糖苷酶。所述可与待测物竞争性结合特异性抗体的抗原为待测物分子半抗原-BSA偶联物。上述试剂盒中，所述层析膜(3)为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素膜与醋酸纤维素膜组成的混合膜。所述样品稀释液为磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。所述底物显色液由A液和B液组成，所述A液为H2O2溶液，所述B液包含沉淀型的供氢体，所述供氢体为OPD、TMB、DAB、联苯胺、5-氨基水杨酸或4-氯-I-萘酚，所述A液与B液分别装于两个试剂瓶中。本实用新型试剂盒的定性检测原理检测带包被待检物-BSA偶联物，质控带包被抗酶标或生物素标记的抗体的二抗。结合垫上结合生物素标记的单抗。检测过程中，取一定量样品溶液加入样品垫，样本和被溶解的酶标抗体一起在过滤片上移动。如果样品溶液含有相应待检物，则待检物将和抗体先 行反应，因此当扩散至检测带时，抗体的活性位点将因被样品溶液中的待检物占据而无法与检测带上的待检物抗原结合；之后加入HRP标记的亲和素，与通过单抗而固定在膜上的生物素结合；加入洗涤液，洗掉没有结合的过氧化物酶，最后加入底物使用液，当样品中的待检物含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测带将较质控带显色淡或甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中待检物含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测带显色与质控带相近或偏深，判定为阴性。当将本实用新型试剂盒与配套的定量分析仪结合使用时，可以得出待检物的具体含量，实现定量检测的目的。本实用新型试剂盒的主要优点如下I)与现有方法相比检测灵敏度高、分辨率好、特异性强；2)操作简便，无需专用仪器设备，结果直观，安全廉价，适合现场快速检测。3)与读数仪结合时，可以准确测定待测物的含量。
图I为酶联免疫层析试纸条组装示意图，其中I为样品垫，2为结合垫，3为层析膜，4为吸水垫，5为质控带，6为检测带，7为背衬垫。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本实用新型的技术方案，下面结合具体实施例对本实用新型作进一步的详细说明。实施例I本实用新型有机磷免疫层析试剂盒的制备( I)改良过碘酸钠法制备酶标抗体取HRP 5mg溶于O. 2mol/L, pH5. 6醋酸盐缓冲液Iml中，加入1%DNFB无水乙醇溶液O. Iml,室温下轻微搅拌Ih ;加入新鲜配置的O. lmol/L NaIO4O. 5ml,置4°C放置30min,加入2. 5%乙二醇1ml，室温下轻微搅拌lh，终止反应；加入待标记的抗有机磷单抗5 10mg，用
I.Omol/L, ρΗ9· 5CBS，调节pH值至9. O ;混匀，置4°C过夜;加入硼氢化钠溶液O. 1ml，混匀，4°C放置 3h ;对 O. 01mol/L，pH7. 4PBS，4°C透析过夜，换液 3 次；3000r/min 离心 30min，去除沉淀物；收集上清液即为酶标记抗体。(2)试纸条组装酶标记抗体用稀释液进行稀释，其中稀释液含109Γ20%蔗糖、19Γ5%海藻糖、
O.5°/Γ %牛血清白蛋白(BSA)、0. 5°/Γ %吐温-20，然后用BIO-DOT喷金划线仪将酶标记抗体喷涂在玻璃纤维膜上，得到结合垫，37°C干燥4h后密封，4°C下保存。用BIO-DOT喷金划线仪在硝酸纤维素膜上划两条条平行带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。其中第一条为质控带，第二条为定量带。质控带上喷涂羊抗鼠免疫球蛋白(IgG)，浓度为O. 5 lmg/ml ;第二条带喷涂有机磷包被原，浓度为O. 2 lmg/ml。得层析膜，37 0C干燥4h后密封，4 V下保存。在PVC板上，依次粘贴上层析膜(长30cm，宽2. 5cm)、结合垫(长30cm，宽8mm)、样品垫(长30cm,宽17mm)和吸水垫(长30cm，宽17mm)。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成
3.8mm宽的试纸条，放入扣卡中组装成免疫层析试剂盒，干燥后密封，4°C避光保存。(3)试剂配制样品稀释液0. 2mol/L的四硼酸钠溶液，不用调pH (约为9. 2)，含3%的丙酮及
O.5%的甲醇；标准品闻纯待检物；底物显色液IOOmL B液+20 μ L A液，其中A液为33%的H2O2溶液，B液为用底物缓冲液配制的40% (质量体积百分比)的TMB溶液；所述底物缓冲液为ρΗ5. O的磷酸-柠檬酸盐缓冲液，其具体配制如下O. lmol/L 柠檬酸(I9· 2g/L)24. 3mLO. 2mol/L Na2HPO4 (28. 4g/L) 25. 7mL超纯水定容至IOOmL洗涤液0.01mol/L, ρΗ7· 4 的 PBS+0. 05% (v/v)的 Tween-20实施例2本实用新型有机磷免疫层析试剂盒的制备( I)制备生物素标记的抗体。用50mM碳酸盐缓冲液(pH9. 6)4°C透析抗体，出去叠氮化钠(NaN3)，并将待生物素化的抗有机磷单抗用该碳酸盐缓冲液稀释到lmg/ml。将生物素酯(BNHS)溶于二甲基甲酰胺(DMF)，浓度为20mg/mL。按100 μ gBNHS每Img抗体的比例加入BNHS，混匀，室温下反应4小时。4°C下用磷酸盐缓冲液透析三天除去游离物，得到生物素化的单抗，4°C下保存备用，长期保存需在_20°C保存。(2)试纸条的组装根据实施例I的方法组装试纸条。(3)试剂的配制同实施例I实施例3本实用新型试剂盒的定性检测有机磷残留取一定量样品溶液加入样品垫，样本和被溶解的酶标抗体一起在过滤片上移动。如果样品溶液含有相应药物的残留，药物将和抗体先行反应，因此当扩散至检测带时，抗体的活性位点将因被样品溶液中的药物占据而无法与检测带上药物抗原结合；之后加入底物使用液。当样品中的待检物含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测带将较质控带显色淡或甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中的待检物含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测带显色与质控带相近或偏深，判定为阴性；如果检测带与质控带都不显色，说明检测无效。实施例4本实用新型试剂盒定量检测有机磷标准曲线的绘制用实施例I或2所述样本稀释液稀释待检物标准品，配置系列浓度标准品如下10 μ g/mL、I μ g/mL、0. I μ g/mL、50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、lng/mL、0ng/mLo检测时将阴性样本稀释液或上述系列浓度标准品70 μ L垂直滴到样品垫上，层析，I分钟后，将2飞μ L实施例I或实施例2所述底物显色液滴到层析膜上，2min后待定量带和质控带均已明显显示，将5 10 μ L样品洗涤液滴到层析膜上，Imin后观察背景区、质控带和定量带信号强度( 每个样本分别用3个试纸条测定3次，取平均值)，定量带扣除背景区信号后，绘制标准曲线。其中质控带用于对定量带信号受环境影响，而作相应的校正。以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。
权利要求1.一种酶联免疫层析试剂盒，包括盒体和盒内的酶联免疫层析试纸条、试剂瓶和放试剂瓶的下凹瓶位；所述试纸条包括样品垫(I)、结合垫(2)、层析膜(3)、吸水垫(4)和背衬垫(7)，其中样品垫(I)、结合垫(2)、层析膜(3)和吸水垫(4)搭载于背衬垫(7)之上，样品垫(I)连接于结合垫(2)，结合垫(2)连接于层析膜(3)，层析膜(3)上设置有质控带(5)和检测带(6)，层析膜(3)连接于吸水垫(4);所述试剂瓶中分别装有系列浓度的待测物标准品、样品稀释液、底物显色液、洗涤液。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述结合垫上固定有酶标记或生物素标记的特异性抗体，所述特异性抗体为可特异性结合待测物的抗体；所述质控带上包被有抗所述酶标记或生物素标记的特异性抗体的二抗；所述检测带上固定有可与待测物竞争性结合特异性抗体的抗原。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或半乳糖苷酶。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述可与待测物竞争性结合特异性抗体的抗原为待测物分子半抗原-BSA偶联物。
5.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述层析膜(3)为硝酸纤维素膜。
6.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。
专利摘要本实用新型公开了一种酶联免疫层析试剂盒，包括盒体和盒内的酶联免疫层析试纸条、试剂瓶和放试剂瓶的下凹瓶位；所述试纸条包括样品垫(1)、结合垫(2)、层析膜(3)、吸水垫(4)和背衬垫(7)，其中样品垫(1)、结合垫(2)、层析膜(3)和吸水垫(4)搭载于背衬垫(7)之上，样品垫(1)连接于结合垫(2)，结合垫(2)连接于层析膜(3)，层析膜(3)上设置有质控带(5)和检测带(6)，层析膜(3)连接于吸水垫(4)；所述试剂瓶中分别装有系列浓度的待测物标准品、样品稀释液、底物显色液、洗涤液。本实用新型试剂盒具有灵敏度高、特异性强、结合读数仪可准确定量等优点。
文档编号G01N33/558GK202794177SQ20122029963
公开日2013年3月13日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者王金爱 申请人:北京康美天鸿生物科技有限公司
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