专利名称：检测三聚氰胺残留量的薄层色谱法显色剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种检测三聚氰胺残留量的薄层色谱法显色剂及其在检测三聚氰胺残留量中的应用。
背景技术：
三聚氰胺(Melamine)是一种三嗪类含氮杂环化合物，简称三胺，又称作蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺等，是一种白色粉末，可溶解于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶、乙醇等有机溶剂及水，不溶于乙醚、苯和四氯化碳等。三聚氰胺是一种用途广泛的有机化工原料和重要中间体，但并非是人或动物的食品中允许使用的添加剂成分。近年来，在包括乳制品在内的多种食品及畜禽饲料等人和/或动物的食用品中，不断出现了以添加三聚氰胺冒充蛋白质的事件，危害了人和/或动物的身体健康，引发了食品安全性的社会公共问题。为防止食品中存在的三聚氰胺，国家标准《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》 (GB/T 22388-2008)中提出了采用高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MQ和气相色谱-质谱/质谱法(GC-MS/MQ等方法，检查原料乳与乳制品中的三聚氰胺。这些方法专属性强，灵敏度高，但所用仪器设备昂贵，对实验人员的专业技术要求高，不适合对大量样品的筛查，难以在基层检测机构中推广使用。中国专利公开号CN101458M0A中提出了一种薄层色谱法(TLC)检测三聚氰胺残留量的方法，以正丁醇-乙酸乙酯-水为硅胶薄层板的展开剂，以二苯卡巴腙和氯化汞的乙醇溶液为显色剂，检测食品中的三聚氰胺残留量。但该方法未提供其检测限。Melanie Broszat等以mister，s blue和淀粉碘试剂为显色剂检查牛奶中的三聚氰胺(A new method for quantification of melamine in milk by absorption diode-array thin-layer chromatography. Journal of Planar Chromatography, 2008, 21 (6) :469), ^ ^ illj PS 30mg · L—1，灵敏度不够高，不能满足食品中微量三聚氰胺的检测要求。
发明内容
针对上述情况，本发明首先提供一种用于检测三聚氰胺残留量的薄层色谱法的显色剂，本发明进一步还提出了以该显色剂为基础的检测三聚氰胺残留量的薄层色谱方法， 以及该薄层色谱方法在检测人或动物食品/饲料中三聚氰胺含量中的应用。本发明所说的检测三聚氰胺残留量的薄层色谱法显色剂，为分别含有重量比例为 0. 10%的对二甲氨基苯甲醛(PDAB)JPO. 2%无机酸的乙醇溶液。其中所说的无机酸为常用的浓盐酸(36. 5w% )或浓硫酸(98w% )，也可以使用以该浓盐酸或浓度硫酸作为所说显色剂乙醇溶液中无机酸含量比例计算基准的其它浓度的盐酸或硫酸。上述显色剂的优选形式是显色剂中的对二甲氨基苯甲醛的重量含量为0. 3% ；更好的是对二甲氨基苯甲醛的重量含量为 3%。在此基础上，进一步的优选是所说显色剂中的无机酸采用重量含量为0.2% 0. 5%的盐酸，更好的是采用重量含量为0. 3%的盐酸。
以采用上述显色剂的薄层色谱法进行三聚氰胺残留量的检测时，可先以沸点 ^ 100°c的三聚氰胺有机良溶剂充分溶解的含有三聚氰胺的被测样品试液，在硅胶薄层色谱板上点样，经展开剂展开，然后挥除展开剂，再以上述的显色剂显色后，即可在紫外光或自然光下检视薄层色谱板上的显色斑点，由点样量计算被测样品中的三聚氰胺含量是否超过限量。所说的展开剂，可以采用包括上述中国专利公开号CN101458M0A等目前已有报道和/或使用形式的展开剂。所说制备被测样品试液时的三聚氰胺有机良溶剂，虽然可包括前述的诸多溶剂种类，但在本发明方法中宜选择其中既有利于三聚氰胺的溶解，又沸点较低(< 100°c )而容易挥发的三聚氰胺有机良溶剂，以便试液溶剂在薄层色谱板上点样后能较快或迅速的挥发。因此，较好的溶剂选择可以为乙醇、甲醇、乙腈、丙酮，或含水重量比分别< 20%的含水乙醇、含水甲醇、含水乙腈或含水丙酮等均可以使用。其中更为优选的是毒性最小的乙醇或浓度>80%的含水乙醇。虽然三聚氰胺在水中易溶，但因水份在薄层点样时不易挥除，在保证溶解的前提下，宜尽量减少溶剂中的含水比例。但如果三聚氰胺的浓度较大，甚至用80% 乙醇等尚不能完全溶解时，也可适当增加溶剂中水的比例，或先以少量热水将三聚氰胺完全溶解后，再加入乙腈、乙醇、丙酮等有机溶剂。点样后的薄层色谱板一般可在室温下饱和并展开。试验显示，展开时的温度变化一般对展开效果并无显著影响。根据三聚氰胺的化学性质，对经展开剂展开后的薄层色谱板，本发明人分别考察和试验了包括对二甲氨基苯甲醛(PDAB)试液、碘化铋钾试液、稀铁氰化钾试液、10%磷钼酸乙醇溶液、茚三酮试液、三氯化铁试液等不同显色剂的显色效果。结果显示，PDAB可以使三聚氰胺斑点在紫外光照射下显示出明显的蓝色荧光，且灵敏度高，显色效果理想。一般情况下，显色剂中对二甲氨基苯甲醛的重量含量在0. 10%范围内都是允许的；更好的含量选择范围是1^-3 ^进一步的试验显示，酸性的显色剂对于显色是有利的。所说的酸性可以选择加入常用的盐酸、硫酸等无机酸方式实现，一般的含量比例可为0. 2w%，更好的含量范围是 0.5w%。最佳范围是的盐酸。试验显示，使用不同种类酸酸化的显色剂，薄层色谱板上三聚氰胺斑点可以分别在不同的显色检视环境下显示出理想的显色效果。例如，采用盐酸酸化的显色剂，在薄层色谱板上的三聚氰胺斑点在紫外光下可以高灵敏地显示出蓝色的荧光斑点(试验条件下的检测限为0.5 μ g)；使用硫酸酸化时，则其在紫外光下的显色灵敏度较低，但在自然光下可显示出黄色的斑点(试验条件下的检测限为 2 μ g)。由于在紫外光下能以高灵敏的方式显示蓝色的荧光，并且在盐酸浓度为0. 2% 0. 5%范围内的荧光都较强，且强度相当，因此可优选以浓度为0. 3%的盐酸进行酸化，并在紫外光灯下进行显色观察。所说的用于观察检视三聚氰胺蓝色荧光斑点的紫外光，一般可以选择通常使用的 365nm或254nm波长的紫外光灯。试验表明，三聚氰胺斑点在365nm下的荧光强度可强于在254nm波长下，故检测波长可优选为365nm的紫外光灯。目前常用的薄层检测紫外仪通常都已配置有254nm和365nm两种波长的紫外灯，因此可根据实际需要选择在其中的任一波长下进行观察检视。进一步的试验显示，对上述薄层色谱板上三聚氰胺斑点的显色，特别宜使经展开
5剂展开后的薄层色谱板在50°C 120°C的加热条件下，充分挥除展开剂(除去使用含氨成分展开剂时残留的氨水)，以减少和/或避免其产生背景干扰。以所说加热方式挥除薄层色谱板的展开剂后，立即趁热用所说的显色剂润湿，可有利于提高显色的灵敏度。例如，经展开剂展开后的薄层色谱板，在50°C 120°C条件下加热IOmin挥尽展开剂后，趁热立即以上述方式用盐酸酸性显色剂润湿后显色，均出现蓝色荧光斑点，温度降低，检测的灵敏度会相应降低。例如当温度降至ire时，检测限会相应降低为20 μ g0用所说的显色剂对薄层色谱板的润湿方式，可以选择但不限于包括常用的浸渍、 喷雾等方式实现。试验显示，薄层色谱板用显色剂的润湿程度和/均勻程度，在一定程度上会影响显色显著性的效果。例如，以采用盐酸进行酸化的显色剂为例，采用浸渍方式时，将薄层色谱板在显色剂中浸渍5 15秒钟后取出，热风吹干后置紫外灯光(365nm)下观察， 三聚氰胺斑点显色的荧光较强，重复性好，不会产生背景干扰，检测限可达0. 5 μ g。浸渍时间过短或过长，均会使检测灵敏度有所降低。如果使用喷雾方式显色，建议使用喷雾量较大的喷头迅速喷洒，并可适当提高显色剂中PDAB的浓度和/或酸性(例如可使用含3% PDAB 和盐酸乙醇溶液显色剂)，喷至薄层板微湿为宜。若显色剂喷得过多，则显色剂甚至可能会掩盖荧光斑点，使薄层板正面无法观察到斑点，但若使用玻璃载板的薄层色谱板，则从背面仍可观察到清晰的荧光斑点。进一步，改变挥除显色剂时的操作温度，也会在一定程度上影响显色效果。例如， 同样以浸渍方式将薄层色谱板在显色剂中浸渍5 15秒钟后取出，用热吹风使显色剂尽快挥尽后，立即置紫外灯光(365nm)下观察，三聚氰胺斑点的荧光较强，检测限可为0. 5 μ g。 如果采用冷风吹干或者是自然晾干方式挥尽显色剂，荧光强度会有不同程度的减弱。如上述，以薄层色谱法采用本发明上述显色剂进行三聚氰胺残留量的检测时，在硅胶薄层色谱板上点样并挥除了溶剂后，可以采用目前已有报道和/或使用的展开剂进行展开。进一步的试验表明，一种与本发明上述显色剂配合并可具有更理想检测效果的展开剂，是由丙酮-氯仿-氨水以体积比例为丙酮4 10份，氯仿0 2份，氨水0. 1 10份的组成形式。其中，上述展开剂更好组成的体积比例是丙酮4 10份，氯仿0. 5 2份，氨水 0. 1 10份。进一步优选的组成比例是丙酮4 9份，氯仿0. 5 2份，氨水0. 5 4份。 最佳组成比例建议可采用为丙酮7份，氯仿0. 5份，氨水2份。试验显示，适当改变和调整展开剂中丙酮、氯仿、氨水的比例，可使展开后薄层色谱板上三聚氰胺显示斑点的&值(比移值)产生相应的变化。例如，增大展开剂中氯仿的比例，可适当减小三聚氰胺斑点的&值；增加展开剂中氨水的比例，则三聚氰胺斑点的&值会有适当增大。结果表明，一般情况下，使用丙酮-氯仿-氨水的比例为7 0.5 2的展开剂时，三聚氰胺斑点的&值较为合适，且斑点形状对称。此外，以吡啶或三乙胺替换张开剂中的氨水的试验显示，由于展开剂的极性减小， 三聚氰胺斑点的&值过于�。焕谄浞掷�。本发明上述的检测三聚氰胺的薄层色谱法中，所说三聚氰胺被测样品试液在薄层色谱板上的点样量一般以2 5 μ g和/或点样斑点的直径< 4mm为好。试验显示，若点样量过大，有时会出现斑点拖尾的现象。
可以理解，采用本发明上述显色剂的薄层色谱法，可用于检测人或动物食品中三聚氰胺含量。其检测方法的基本过程是用沸点< 100°c的三聚氰胺有机良溶剂对所说分散态的被检测物充分提取后，即可按上述内容，用硅胶薄层色谱板进行检测，检视薄层色谱板上的三聚氰胺显色斑点，并可由点样量计算被检测物中的三聚氰胺含量是否超过限量。 此处所说的三聚氰胺有机良溶剂，同样可以选择常用的乙醇、甲醇、乙腈、丙酮，或含水重量比分别<20%的含水乙醇、含水甲醇、含水乙腈或含水丙酮等常用溶剂，其中同样也以无毒性的乙醇和/或含水乙醇为优选。本发明所说的人或动物食品被检测物，可以是包括乳制品在内的含蛋白质成分的液态和/或黏稠状食品(或饲料)，也可以是含蛋白质成分的固态食品(或饲料)。无论何种状态的食品(或饲料)，其首先均应使可能存在的三聚氰胺与其它蛋白质成分相分离的预处理后，才能采用本发明上述方法进行检测。对于如牛奶及不同形式、状态的奶制品等液态和/或黏稠状食品，检测前可以采用包括国家标准及包括前述文献的目前已有报道和/或使用的方法，对可能存在的三聚氰胺进行分离、提取的预处理。如，可采用目前已有报道和/或使用的直接沉淀蛋白的三氯乙酸法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。本发明的试验结果表明，这些分离、提取三聚氰胺的预处理方法中，三氯乙酸因沸点高，不易挥发，可造成浓缩时酸度过大而使样品被破坏；盐析法在挥干过程中有大量盐析出来，不利于浓集；有机溶剂沉淀蛋白，净化效果不好，阴性样品有干扰，且供试品成分复杂，可将三聚氰胺包裹，使其无法展开。故仅采用这些直接沉淀蛋白的方法尚难能达到检查的要求，还需对供试品进行进一步的净化。例如，可参照目前的国家标准和/或相关文献，采用固相萃取法进行净化。其中，优选的方式是采用三氯乙酸和乙酸铅溶液沉淀除去被检测物中的蛋白质成分，再经阳离子交换树脂固相萃取小柱净化处理后，用5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液并挥除溶剂后，残留物用所说的三聚氰胺有机良溶剂完全溶解，作为薄层色谱点样用的被检测物样品试液，进行三聚氰胺的含量检测。该分离、提取方法在CN101458M0A等文献中都已有报道，可以参照。对于如饼干、蛋糕及禽畜饲料等含蛋白质成分的固态被检测物，将被检测物充分粉碎(可以参照目前对这类食品/饲料质量检测中已有报道和/或使用的方式处理)，再按上述液态和/或黏稠状食品的同样方式提取和净化处理，制备作为薄层色谱点样用的被检测物样品试液，进行三聚氰胺的含量检测。本发明提出的检测三聚氰胺残留量的薄层色谱法显色剂和相应的三聚氰胺残留量薄层色谱检测方法，及其在检测人或动物食品中三聚氰胺含量的应用，简便易行，操作简单，特别是采用对二甲氨基苯甲醛(PDAB)作为显色剂，三聚氰胺斑点清晰，检测灵敏度高， 三聚氰胺的最低检出量可以达到0. 5mg · kg—1，能快速筛选出人或动物食品中含有三聚氰胺，特别适用于基层的推广使用。以下结合由附图所示实施例的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
图1是本发明显色剂检测方法的专属性试验薄层色谱图。图2是本发明显色剂检测方法的检测限试验薄层色谱图。图3是本发明显色剂检测方法的回收试验薄层色谱图。图4是本发明显色剂检测方法检测牛奶中三聚氰胺的薄层色谱图。
具体实施例方式实施例1本发明显色剂及其检测方法的专属性试验供试品溶液的制备称取含适量三聚氰胺的牛奶5. 0g(或相当于牛奶5. Og的奶制品)，置具塞锥形瓶中，加入三氯乙酸溶液10mL，边加边振�。偌尤�2. 2%乙酸铅溶液 ImL及三氯甲烷4mL，充分振摇2min，转移至离心管中，以3000r · mirT1离心2min，取上清液，置于原锥形瓶中，再加入三氯乙酸溶液10mL，充分振摇混合2min，将溶液转移至离心管中，用少量三氯乙酸溶液洗涤锥形瓶，洗液合并至离心管中，以3000r · mirT1离心 2min，取上清液备用。将上清液转移至已活化的阳离子交换固相萃取柱中，依次用6mL水和 6mL甲醇洗涤，抽至近干，用5%氨化甲醇6mL洗脱，洗脱过程流速不超过ImL IirT1t5收集洗脱液于IOmL梨形瓶中，用旋转蒸发仪于50°C下挥干，残留物用少量80%乙醇溶解并稀释至0. 5mL，摇勻，作为供试品溶液。对照品溶液的制备取三聚氰胺对照品适量，加80%乙醇制成每ImL中含0. 5mg 的溶液，即得。检查方法分别吸取试剂空白溶液(由配制供试品溶液所用的试剂配制)50 μ L、 对照品溶液10yL(5yg)及供试品溶液50 μ L，分别点样于同一硅胶G薄层板上(斑点直径彡4mm)。以丙酮-氯仿-氨水(7 0. 5 2，V/V/V)为展开剂，饱和5min，展开，取出， 晾干，在105°C加热lOmin，取出，趁热浸渍于1 %对二甲氨基苯甲醛盐酸乙醇溶液(含盐酸 0.3%)中5至15秒，取出，立即用热风吹干，置紫外灯光(365nm)下检视。结果如图1所示。图1中第1号点为空白溶液，第2号为对照品溶液，第3号为供试品溶液。由图1可以看出，空白溶液的色谱中，在与对照品色谱相应的位置上无斑点；供试品溶液中的其他组分对三聚氰胺斑点无干扰。表明本法的专属性良好。实施例2本发明显色剂及其检测方法的检测限试验分别吸取上述实施例1同样的对照品溶液(0. 05mg · ml/1) 5、10 μ L及对照品溶液 (0. 5mg .mr1) 2、4、10 μ L，分别点于同一预制硅胶G薄层板上，按照实施例1 “检查方法”的操作，以丙酮-氯仿-氨水(7 0.5 2，V/V/V)为展开剂，饱和5min，展开，取出，晾干，在 105°C加热lOmin，取出，趁热浸渍于对二甲氨基苯甲醛盐酸乙醇溶液(含盐酸0.3% ) 中5至15秒，取出，立即用热风吹干，置紫外灯光(365nm)下检视。结果如图2所示。图中第1 5号的点样量依次为0. 25、0. 5、1.0、2.0和5.0^8。 可以看出，在紫外灯光下，可检视的点样量为0. 5μ g的三聚氰胺(第2号点)，表明本法的检测限为0. 5 μ g，在样品中的最低检出量为0. 5mg · kg—1。实施例3本发明显色剂及其检测方法的回收率试验称取3份不含三聚氰胺的牛奶5. Og，分别加入不同量的三聚氰胺对照品溶液，使其三聚氰胺含量分别为2、5、10mg · kg—1，编号为供试液①、供试液②、供试液③。按照实施例1 “供试品溶液的制备”的同样方式制样，供试液①、供试液②和供试液③中三聚氰胺的浓度分别为0. 02,0. 05,0. IOmg · mL—1。分别吸取对照品溶液(0. 5mg · mL-1) 2、4 μ L及供试液①50、100 μ L，供试液②25、50 μ L，供试液③25 μ L，分别点于同一预制硅胶G薄层板上， 按实施例1 “检查方法”项同样操作。结果如图3所示，图中的第1 2号为对照品溶液，点样量分别为1.0和 2. 0 μ g ；第3 7号均为供试品溶液，依次为①50 μ L (1. 0 μ g)、①100 μ U2. 0 μ g)、 ②25μ L(l. 25μ g)、②50μ U2. 5μ g)和③25μ U2. 5μ g)。由图3可以看出，供试液 ①100 yL(2.0yg)、供试液②50yL(2. 5μ g)和供试液③25yL(2. 5μ g)检出的三聚氰胺斑点的荧光强度与对照品2. 0μ g相当，表明本法可检查出牛奶中微量的三聚氰胺，回收率在80%以上。实施例4对奶制品中三聚氰胺残留量的检测试验称取含适量三聚氰胺的牛奶5. Og (或相当于牛奶5. Og的奶制品)，按照实施例 1 “供试品溶液的制备”的同样方式制样，对照品溶液的制备取三聚氰胺对照品适量，加80%乙醇制成每ImL中含0. 5mg 的溶液，即得。检查方法吸取对照品溶液4 μ U2 μ g)及供试品溶液100 μ L，分别点于同一预制硅胶G薄层板上(斑点直径彡4mm)，以丙酮-氯仿-氨水(7 0.5 2，V/V/V)为展开剂， 饱和5min，展开，取出，晾干，在105°C加热lOmin，取出，趁热浸渍于对二甲氨基苯甲醛盐酸乙醇溶液(含盐酸0.3%)中5至15秒，取出，立即用热风吹干，置紫外灯光(365nm) 下检视。结果见图4。图中所示的斑点即为三聚氰胺的蓝色荧光斑点。图中第1、2号点为对照品溶液，点样量分别为1 μ g和2. 5μ g ；第3、4、5号点均为供试品溶液，供试品溶液的色谱中在与对照品溶液中三聚氰胺相同的位置上显示蓝色荧光斑点，斑点的颜色和面积均未超过对照品溶液2中三聚氰胺的斑点，说明其中三聚氰胺的含量均未超过2. 5mg -kg"1的限度。实施例5对奶制品中三聚氰胺残留量的检测试验供试品溶液和对照品溶液的制备方法同实施例1。检查方法吸取对照品溶液4 μ U2 μ g)及供试品溶液100 μ L，分别点于同一预制硅胶G薄层预制板上(斑点直径彡4mm)，以丙酮-氯仿-氨水(7 0.5 2，V/V/V)为展开剂，饱和5min，展开，取出，晾干，在105°C加热lOmin，取出，趁热迅速喷洒3%对二甲氨基苯甲醛盐酸乙醇溶液(含盐酸)，喷至薄层板微湿，立即用热风吹干，置紫外灯光(365nm) 下检视。通过比较供试品色谱与对照品色谱中三聚氰胺斑点的大�。膳卸涎分腥矍璋肥欠癯蘖俊Ｊ匝榻峁砻鳎捎门缥硐陨姆绞揭材芗觳槿矍璋返牟辛袅�。薄层板被喷至微湿为宜，若显色剂喷得过多，则显色剂可能掩盖荧光斑点，使从薄层板正面无法观察到三聚氰胺的斑点，若使用以玻璃为载板的薄层板，从背面仍可观察到清晰的荧光斑点。实施例6对液态奶中三聚氰胺残留量的检测试验分别称取三个不同公司来源的各一批次液态奶5. Og,按照实施例1的方式制备供试品溶液，并进行薄层色谱分析。经试验，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上无斑点，表明其三聚氰胺含量均低于0. 5mg · kg—1，符合要求。实施例7对奶粉中三聚氰胺残留量的检测试验称取奶粉5. 0g，置具塞锥形瓶中，加入三氯乙酸溶液25mL，边加边振�。偌尤�2. 2%乙酸铅溶液3mL及三氯甲烷10mL，充分振摇2min，转移至离心管中，以3000rpm离心2min，取上清液，置于原锥形瓶中，再加入1 %三氯乙酸溶液25mL，充分振摇混合2min， 将溶液转移至离心管中，用少量三氯乙酸溶液洗涤锥形瓶，洗液合并至离心管中，以 3000rpm离心2min，取上清液，转移至已活化的阳离子交换固相萃取柱中，依次用6mL水和 6mL甲醇洗涤，抽至近干，用5%氨化甲醇6mL洗脱，洗脱过程流速不超过ImL ^inA收集洗脱液于IOmL梨形瓶中，用旋转蒸发仪于50°C下挥干，残留物用少量80%乙醇溶解并稀释至0. 5mL，摇勻，作为供试品溶液。检查方法吸取对照品溶液(0. 5mg/ml) 2、4、6 μ L及供试品溶液100 μ L，分别点于同一预制硅胶G薄层预制板上(斑点直径彡4mm)，以丙酮-氨水(10 2，V/V)为展开剂， 饱和5min，展开，取出，晾干，在105°C加热lOmin，取出，趁热迅速喷洒3 %对二甲氨基苯甲醛盐酸乙醇溶液(含盐酸1%)，喷至薄层板微湿，立即用热风吹干，置紫外灯光(365nm)下检视。通过比较供试品色谱与对照品色谱中三聚氰胺斑点的大�。卸涎分腥矍璋肥欠癯蘖�。实施例8对奶糖中三聚氰胺残留量的检测试验称取奶糖5. Og于研钵中，加入适量海砂研磨成粉状，转入具塞锥形瓶中，加入三氯乙酸溶液80mL，边加边振�。偌尤�2. 2%乙酸铅溶液5mL及三氯甲烷25mL，充分振摇 2min,转移至离心管中，以3000rpm离心2min，取上清液，置于原锥形瓶中，再加入1 %三氯乙酸溶液80mL，充分振摇混合2min，将溶液转移至离心管中，用少量三氯乙酸溶液洗涤锥形瓶，洗液合并至离心管中，以3000 rpm离心aiiin，取上清液，加于已活化的阳离子交换固相萃取柱中，依次用6mL水和6mL甲醇洗涤，抽至近干，用5%氨化甲醇6mL洗脱，洗脱过程流速不超过ImL · mirT1。收集洗脱液于IOmL梨形瓶中，用旋转蒸发仪于50°C下挥干，残留物用少量80%乙醇溶解并稀释至0. 5mL，摇勻，作为供试品溶液。检查方法吸取对照品溶液(0. 5mg/ml) 5、10 μ L及供试品溶液200 μ L，分别点于同一预制硅胶G薄层预制板上，以丙酮-氯仿-氨水(5 0.5 1，V/V/V)为展开剂，饱和5min，展开，取出，晾干，在105°C加热lOmin，取出，趁热迅速喷洒3%对二甲氨基苯甲醛盐酸乙醇溶液(含硫酸1%)，喷至薄层板微湿，立即用热风吹干，置自然光下检视。通过比较供试品色谱与对照品色谱中三聚氰胺黄色斑点的大�。卸涎分腥矍璋肥欠癯蘖�。实施例9对饲料中三聚氰胺残留量的检测试验称取饲料5. Og，粉碎后置具塞锥形瓶中，加入三氯乙酸溶液50mL，边加边振�。偌尤�2. 2%乙酸铅溶液2mL，充分振摇2min，转移至离心管中，以3000rpm离心2min， 取上清液，置于原锥形瓶中，再加入1 %三氯乙酸溶液50mL，充分振摇混合2min，将溶液转移至离心管中，用少量三氯乙酸溶液洗涤锥形瓶，洗液合并至离心管中，以3000rpm离心2min，取上清液加于已活化的阳离子交换固相萃取柱中，依次用6mL水和6mL甲醇洗涤， 抽至近干，用5%氨化甲醇6mL洗脱，洗脱过程流速不超过ImL mirT1。收集洗脱液于IOmL 梨形瓶中，用旋转蒸发仪于50°C下挥干，残留物用少量80%乙醇溶解并稀释至0. 5mL，摇勻，作为供试品溶液。 检查方法吸取对照品溶液(0. 5mg/ml) 5、10 μ L及供试品溶液200 μ L，分别点于同一预制硅胶G薄层预制板上，以丙酮-氯仿-氨水(8 1 2, V/V/V)为展开剂，饱和 5min，展开，取出，晾干，在105°C加热lOmin，取出，趁热迅速喷洒3%对二甲氨基苯甲醛盐酸乙醇溶液(含硫酸1%)，喷至薄层板微湿，立即用热风吹干，置日光下检视。通过比较供试品色谱与对照品色谱中三聚氰胺黄色斑点的大�。卸涎分腥矍璋肥欠癯蘖�。
权利要求
1.检测三聚氰胺残留量的薄层色谱法显色剂，为分别含有重量比例为0. 10%的对二甲氨基苯甲醛和0. 2%无机酸的乙醇溶液，所说的无机酸为盐酸或硫酸。
2.如权利要求1所述的显色剂，其特征是所说显色剂中的对二甲氨基苯甲醛的重量含量为0. 3%。
3.如权利要求2所述的显色剂，其特征是所说显色剂中的对二甲氨基苯甲醛的重量含量为 3%。
4.如权利要求1至3之一所述的显色剂，其特征是所说显色剂中的无机酸是重量含量为0.2% 0.5%的盐酸。
5.如权利要求4所述的显色剂，其特征是所说显色剂中的无机酸是重量含量为0.3% 的盐酸。
6.以权利要求1至5的显色剂检测三聚氰胺残留量的薄层色谱法，其特征是以沸点 ^ 100°c的三聚氰胺有机良溶剂充分溶解的含有三聚氰胺的被测样品试液，在硅胶薄层色谱板上点样，经展开剂展开后，挥除展开剂，以权利要求1至5之一的显色剂显色后，在紫外光或自然光下检视薄层色谱板上的显色斑点，由点样量计算被测样品中的三聚氰胺含量是否超过限量。
7.如权利要求6所述的薄层色谱法，其特征是所说的三聚氰胺有机良溶剂为乙醇、甲醇、乙腈、丙酮，或含水重量比分别< 20%的含水乙醇、含水甲醇、含水乙腈或含水丙酮。
8.如权利要求6所述的薄层色谱法，其特征是所说的展开剂体积份数组成为丙酮 4 10份，氯仿0 2份，氨水0. 1 10份。
9.如权利要求8所述的薄层色谱法，其特征是所说的展开剂体积份数组成为丙酮 4 10份，氯仿0. 5 2份，氨水0. 1 10份。
10.如权利要求9所述的薄层色谱法，其特征是所说的展开剂体积份数组成为丙酮 4 9份，氯仿0. 5 2份，氨水0. 5 4份。
11.如权利要求10所述的薄层色谱法，其特征是所说的展开剂体积份数组成为丙酮7 份，氯仿0.5份，氨水2份。
12.如权利要求6至11之一所述的薄层色谱法，其特征是经所说展开剂展开后的薄层色谱板在50°C 120°C的加热条件下挥除展开剂。
13.如权利要求12所述的薄层色谱法，其特征是以所说加热方式挥除薄层色谱板中的展开剂后，立即趁热用所说的显色剂润湿。
14.如权利要求6至11之一所述的薄层色谱法，其特征是所说挥除展开剂后的薄层色谱板以浸渍方式用所说的显色剂润湿。
15.如权利要求6至11之一所述的薄层色谱法，其特征是所说挥除展开剂后的薄层色谱板以喷雾方式用所说的显色剂润湿。
16.如权利要求6至11之一所述的薄层色谱法，其特征是所说显色剂中的无机酸是盐酸，将热吹风吹干后的薄层色谱板置紫外光下检视三聚氰胺的蓝色荧光斑点。
17.如权利要求16所述的薄层色谱法，其特征是所说用热吹风吹干后的薄层色谱板在 365nm或254nm波长的紫外光下检视三聚氰胺的蓝色荧光斑点。
18.如权利要求6至11之一所述的薄层色谱法，其特征是所说显色剂中的无机酸是硫酸，经显色剂显色后的薄层色谱板在自然光下检视三聚氰胺的黄色斑点。
19.如权利要求18所述的薄层色谱法，其特征是所说挥除显色剂后的薄层色谱板在阳光下检视三聚氰胺的黄色斑点。
20.薄层色谱法检测人或动物食品中三聚氰胺含量的方法，其特征是用沸点<100°C 的三聚氰胺有机良溶剂对所说分散态的被检测物充分提取后，按权利要求5至18的方法， 用硅胶薄层色谱板进行检测，检视薄层色谱板上的三聚氰胺显色斑点，并由点样量计算被检测物中的三聚氰胺含量是否超过限量。所说的三聚氰胺有机良溶剂为乙醇、甲醇、乙腈， 或含水重量比分别< 20%的含水乙醇、含水甲醇或含水乙腈。
21.如权利要求20的检测方法，其特征是所说的被检测物为包括乳制品在内的含蛋白质成分的液态和/或黏稠状食品，用三氯乙酸和乙酸铅溶液沉淀除去被检测物中的蛋白质成分，再经阳离子交换树脂固相萃取小柱净化处理后，用5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液并挥除溶剂后，残留物用所说的三聚氰胺有机良溶剂完全溶解，作为薄层色谱点样用的被检测物样品试液，进行三聚氰胺的含量检测。
22.如权利要求20的检测方法，其特征是所说的被检测物为含蛋白质成分的固态食品，将被检测物充分粉碎后，用三氯乙酸和乙酸铅溶液沉淀除去被检测物中的蛋白质成分， 再经阳离子交换树脂固相萃取小柱净化处理后，用5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液并挥除溶剂后，残留物用所说的三聚氰胺有机良溶剂完全溶解，作为薄层色谱点样用的被检测物样品试液，进行三聚氰胺的含量检测。
全文摘要
检测三聚氰胺残留量的薄层色谱法显色剂及其应用。该显色剂为分别含有重量比例为0.1％～10％的对二甲氨基苯甲醛和0.1％～2％的盐酸或硫酸等无机酸的乙醇溶液。检测时，以沸点≤100℃的三聚氰胺有机良溶剂充分溶解的含有三聚氰胺的被测样品试液，在硅胶薄层色谱板上点样，以常规方式经展开剂展开后，挥除展开剂，以该显色剂显色后，在紫外光或自然光下检视薄层色谱板上的显色斑点，由点样量计算被测样品中的三聚氰胺含量是否超过限量。该方法的三聚氰胺斑点清晰，检测灵敏度高，三聚氰胺的最低检出量可达到0.5mg·kg-1，适用于对包括乳制品在内的人和/或动物食品中三聚氰胺含量的检测。
文档编号G01N30/90GK102175812SQ20111000904
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者晁若冰, 王雪彦 申请人:四川大学
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