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专利名称：热休克凋亡脑胶质瘤细胞的制备与检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种热休克凋亡脑胶质瘤細胞的制备与检测方法，其应用于热休克凋亡脑胶质瘤负载树突状細胞肿瘤疫苗的制备エ艺。
背景技术：
脑恶性胶质瘤是中枢神经系统原发性恶性肿瘤中最常见的肿瘤。因生长速度快且沿神经纤维浸润性生长，致使手术难以完全切除；同时对化疗和放疗仅为中度敏感。因此，目前现有的国际公认的常规手术、放疗、化疗的序贯治疗方案，难以根治脑恶性胶质瘤。 免疫治疗是通过调整、提高机体免疫系统功能，清除残留的肿瘤細胞，达到真正的治愈的目的。目前，以DC为基础的细胞疫苗治疗是ー种主动免疫治疗，正成为研究的热点。DC是体内最强大的抗原提呈細胞(antigen presenting cell APC)，其抗原提呈能力可为其他提呈细胞的数百倍，能有效刺激静息的T細胞诱发初次免疫应答，其在T細胞对肿瘤抗原的识别过程中起着重要的作用，DC能通过血脑屏障进入靶向区，从而发挥特异性抗肿瘤效应。DC 的体外培养在目前已经是ー项常用的生物治疗技木，国内外动物和临床试验研究的常用方法可分为四类1)特异性肿瘤抗原肽负载DC。肿瘤抗原肽可以通过人工合成、弱酸洗脱肿瘤表面的MHC-I类抗原肽获得；2)肿瘤細胞抗原负载DC。利用超声波破碎、反复冻融或放射线辐照肿瘤細胞等方法获取肿瘤細胞性抗原，然后致敏DC制备的疫苗；幻肿瘤細胞-DC 融合体疫苗。DC与肿瘤細胞融合后的杂交细胞可获得双亲本細胞的表型特性；4)肿瘤細胞 RNA或cDNA负载DC。如何选择ー种高效、安全的DC疫苗制备法是主动细胞免疫治疗成败的关键，对于临床推广价值意义重大。本方法属于第二类，先将肿瘤細胞处于热休克状态， 诱导細胞高表达热休克蛋白(heat shock proteins HSP)，再用化学药物诱导细胞凋亡进而制备成富含热休克蛋白的凋亡細胞抗原，制备好的抗原与未成熟的DC細胞混合培养制备成熟的DC疫苗。

发明内容
为实现本发明的目的，本发明提出一种热休克凋亡脑胶质瘤細胞的制备与检测方法，其应用于热休克凋亡脑胶质瘤负载树突状細胞肿瘤疫苗的制备エ艺，所述的制备エ艺采用先将肿瘤細胞处于热休克状态，诱导細胞高表达热休克蛋白(HSP)，再用化学药物诱导細胞凋亡进而制备成富含热休克蛋白的凋亡細胞抗原，制备好的抗原与未成熟的DC細胞混合培养获得成熟的DC疫苗。热休克脑胶质瘤細胞负载的DC疫苗具有较好的凋亡率。且采用热休克法负载制备得到的DC疫苗成熟度高，可用于诱导免疫应答。具体的，所述的制备エ艺包括如下步骤Si.热休克凋亡脑胶质瘤細胞的制备和检测人脑胶质瘤細胞株U251引自美国ATCC，按常规方法传代培养。用RPMI1640培养基调整细胞浓度至106/ml，将细胞置于40°C，5% CO2培养箱中池，取出細胞培养瓶，加入白桦酯酸至终浓度为10yg/ml，将细胞培养瓶移至37°C，5% CO2培养箱继续培养诱导細胞凋亡。收获凋亡细胞，加入无菌PBS洗涤4次，获得凋亡肿瘤细胞抗原。肿瘤细胞经40°C处理汕后用FITC-Armexin-V和PI双标细胞后进行流式检测计
算凋亡率结果。软琼脂克隆法检测细胞抗原体外成瘤能力，结果显示凋亡细胞中无肿瘤细胞克隆生长；内毒素检测按《中华人民共和国药典》2005版第三部规定的方法进行；取制备抗原进行内毒素检测。S2. DC肿瘤疫苗的制备和检测采集3个自愿者外周血，采用人工肝素抗凝采集的外周血，置于冰上运输至实验室，2，0001~/1^11，101^11，201获得血细胞，稀释2倍后，Ficoll分离法分离血细胞获取一次新鲜的外周血单个核细胞。用培养基重悬新鲜制备的PBMC后铺于六孔细胞培养板中，放置于37°C，5% CO2培养箱中90min后，洗去未贴壁细胞，于培养板内加入含lOOng/mL GM-CSF,50ng/mL IL-4的RPMI 1640完全培养基，第3d进行换液，第5d收获未成熟DC (imDC)，加入凋亡肿瘤细胞抗原(DC与靶细胞抗原的比例为3 1)，至371，5%0)2培养箱共同培育48h，收获DC细胞，苔盼蓝染色进行细胞计数与表型检测。


通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1所示为本发明的热休克凋亡脑胶质瘤负载树突状细胞肿瘤疫苗的制备工艺的步骤流程示意图。
具体实施例方式如图1所示的本发明的热休克凋亡脑胶质瘤负载树突状细胞肿瘤疫苗的制备工艺的步骤流程示意图，所述实施例的具体步骤如下Si.热休克凋亡脑胶质瘤细胞的制备和检测人脑胶质瘤细胞株U251引自美国ATCC，按常规方法传代培养。用RPMI1640培养基调整细胞浓度至106/ml，将细胞置于40°C，5% CO2培养箱中池，取出细胞培养瓶，加入白桦酯酸至终浓度为10yg/ml，将细胞培养瓶移至37°C，5% CO2培养箱继续培养诱导细胞凋亡。收获凋亡细胞，加入无菌PBS洗涤4次，获得凋亡肿瘤细胞抗原。肿瘤细胞经40°C处理汕后用FITC-Armexin-V和PI双标细胞后进行流式检测计算凋亡率结果显示，凋亡率平均值为66. 23%。软琼脂克隆法检测细胞抗原体外成瘤能力，结果显示凋亡细胞中无肿瘤细胞克隆生长。内毒素检测按《中华人民共和国药典》2005版第三部规定的方法进行。取制备抗原进行内毒素检测。S2. DC肿瘤疫苗的制备和检测采集3个自愿者外周血，采用人工肝素抗凝采集的外周血，置于冰上运输至实验室，2，0001~/1^11，101^11，201获得血细胞，稀释2倍后，Ficoll分离法分离血细胞获取一次新鲜的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)。用 RPMI 1640 培养基重悬新鲜制备的PBMC后铺于六孔细胞培养板中，放置于37°C，5% CO2培养箱中90min后，洗去未贴壁细胞，于培养板内加入含100ng/mL GM-CSF，50ng/mL IL-4的RPMI 1640完全培养基，第3d进行换液，第5d收获未成熟DC(imDC)，加入凋亡肿瘤细胞抗原(DC与靶细胞抗原的比例为3 1)，至37°0，5%0)2培养箱共同培育48h，收获DC细胞，苔盼蓝染色进行细胞计数与表型检测。进行流式检测HLA-DR+CDllc+、⑶llc+CD86+、⑶Ilc+⑶83+。经流式细胞仪FACS分析显示，DC的公认标志HLA-DR+⑶Ilc+的平均值凋亡组为90. 90%, DC的成熟标志⑶Ilc+⑶83+的平均值凋亡组为73. 03%,DC的成熟标志⑶Ilc+⑶86+的平均值凋亡组为 86. 04%。本研究方法采用先将肿瘤细胞处于热休克状态，诱导细胞高表达热休克蛋白(HSP)，再用化学药物诱导细胞凋亡进而制备成富含热休克蛋白的凋亡细胞抗原，制备好的抗原与未成熟的DC细胞混合培养获得成熟的DC疫苗。热休克脑胶质瘤细胞负载的DC疫苗具有较好的凋亡率，经流式细胞术检测，DC疫苗具有成熟DC的表型特征，DC的公认标志HLA-DR+CDlIc+的平均值为90. 90%, DC的成熟标志CDllc+CD86+的平均值为73. 03%,⑶llc+CD83+的平均值为86. 04%，高表达⑶83、⑶86。显示采用热休克法负载制备得到的DC疫苗成熟度高，可用于诱导免疫应答。本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
权利要求
1. 一种热休克凋亡脑胶质瘤細胞的制备与检测方法，其应用于热休克凋亡脑胶质瘤负载树突状細胞肿瘤疫苗的制备エ艺，所述制备エ艺包括步骤热休克凋亡脑胶质瘤細胞的制备和检测以及DC肿瘤疫苗的制备和检测；其中，所述热休克凋亡脑胶质瘤細胞的制备和检测方法包括采用的人脑胶质瘤細胞株U251引自美国ATCC，按常规方法传代培养；用RPMI1640培养基调整细胞浓度至106/ml，将细胞置于40°C，5% CO2培养箱中池，取出細胞培养瓶，加入白桦酯酸至终浓度为10yg/ml，将细胞培养瓶移至37°C，5% CO2培养箱继续培养诱导細胞凋亡；收获凋亡細胞，加入无菌PBS洗涤4次，获得凋亡肿瘤細胞抗原；肿瘤细胞经40°C处理池后用FITC-Armexin-V和PI双标细胞后进行流式检测计算凋亡率結果；软琼脂克隆法检测細胞抗原体外成瘤能力；以及取制备抗原进行内毒素检测。
全文摘要
本发明提出一种热休克凋亡脑胶质瘤细胞的制备与检测方法，其应用于热休克凋亡脑胶质瘤负载树突状细胞肿瘤疫苗的制备工艺，所述制备工艺采用先将肿瘤细胞处于热休克状态，诱导细胞高表达热休克蛋白(HSP)，再用化学药物诱导细胞凋亡进而制备成富含热休克蛋白的凋亡细胞抗原，制备好的抗原与未成熟的DC细胞混合培养获得成熟的DC疫苗。本发明采用热休克法负载制备得到的DC疫苗成熟度高，可用于诱导免疫应答。
文档编号G01N15/10GK102559598SQ20111044812
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者陆华 申请人:陆华