专利名称：一种快速检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体地，本发明涉及一种用胶体金层析捕获法检测人血清、体液或其它样本中的甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法。
背景技术：
甲型病毒性肝炎(简称甲肝，HA)是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的ー种肠道传染�。愿问抵氏赴仔运鹕宋鳎拘郧浚⒉÷矢撸菀追⑸澄镄秃鸵偷谋⒂肓餍校袢允侨澜缙毡榈墓参郎侍猓蚰攴⒉∪耸�140万，实际病例则是报告数的3至10倍。目前我国甲肝的发病率和感染率仍居其它各型病毒性肝炎首位，全国90年 代初开展的病毒性肝炎血清流行病学调查结果显示，我国抗-HAV IgG总流行率为80. 9%，表明预防控制甲肝爆发与流行仍将是艰巨长期的工作，也是重要的研究课题。我国甲型肝炎(甲肝)主要呈散发分布，但时有暴发或流行；约有9. 7亿人已感染过HAV。我国甲型肝炎流行特点有I、农村高于城市。5-15岁儿童感染率城市明显低于农村，但30岁以上感染曲线城市与农村呈平行状态。2、长江以北高于长江以南，西部地区高于中、东部地区。3、根据各省市流行率的分布状况显示，甲型肝炎发病或爆发流行仍以儿童为主。4、流行率明显与卫生习惯有夫。1988年，上海甲肝大流行，持续近I年，波及人数达31万。此事件因其发病人数多、影响深、经济损失重而震惊世界。由于甲型肝炎临床表现复杂多祥，有的甚至无症状，故给诊断带来一定困难，不但要參考接触史，所在地区甲型肝炎流行史、患者的症状和体征，而且还要作肝功能检查和血清学測定，后者尤其是确诊甲型肝炎的依据。抗-HAV IgM是诊断甲型病毒性肝炎的ー个重要指标。甲型肝炎病毒特异性抗体主要有两种，即IgM和IgG型的抗-HAV。抗-HAV IgM抗体在急性甲肝感染时出现较早(患者于发病后I 4周血清中即可检出HAV-IgM抗体)，上升较快，高峰滴度较高、滴度随时间推移而下降，但用敏感的免疫測定法，IgM可持续存在6 12个月，甚至达到18个月。所有患者发病早期体内均能查到抗-HAVIgM，而抗-HAV IgG是疾病恢复期才出现的ー个指标，是甲型病毒性肝炎的保护性抗体。因此，检测病人血清中抗-HAV IgM是目前诊断甲型肝炎最可靠最灵敏的方法，可以明确诊断该病。目前可用于抗-HAVIgM检测的方法有放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)、化学发光(CLIA)等。这些方法无ー例外均为实验室方法，需要一定的标本量与检测时间，一般用于大量标本的同时检测，需要收集一定量的标本后，统ー进行检测，在临床应用上一般需要
1-5天发出检验报告。这就不利于急诊病例与流行病的控制。
发明内容
本发明的ー个目的是提供ー种快速检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒。本发明所提供的检测试剂盒利用捕获法反应原理，并结合胶体金免疫层析技木。试剂盒包括抗人IgM、胶体金偶联的抗原抗体复合物以及支持性材料与质控反应系统。其中，所述抗人IgM可以为羊抗人IgM，也可以为鼠抗人IgM。所述胶体金偶联的抗原抗体复合物结构为[胶体金]-[抗体]-[抗原]，其中抗体为抗甲型肝炎病毒的单克隆或多克隆抗体。本发明的技术方案为采用抗人IgM包被在检测线(T)上。病毒抗原抗体复合物与胶体金偶联并干燥后置于金标垫上。其中检测线的鼠抗人IgM是固化的，金标垫的抗原抗体复合物是可流动的。测试时，样本通过层析作用向上流动，样本中的抗体会与金垫上的抗原-肢体金偶联物结合，并被检测带上的抗人IgM捕获，形成的[鼠抗人IgM]-[血清抗体]-[抗原-抗体-胶体金]复合物，从而在检测线(T)显现出一条红色条帯。如是阴性样本，则将无红色条带显现。所述支持性材料包括吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维、无纺布、聚酯纤维、底卡。 吸水纸是加强层析作用，硝酸纤维素膜是用于制备固定相，玻璃纤维、无纺布与聚酯纤维是用于制备流动相与吸收样品，底卡则是支持性背村。为了方便进行产品质控控制，试剂盒还包括ー个质控系统，由一对可以特异性反应的抗原抗体组成，其中一项与胶体金偶联后置于金标垫上，为流动相。另ー项固化于质控线(C)，为固定相。在检测时，流动相溶解后向上层析，并被结合在质控线上。所述质控系统的抗原抗体对可以选用鼠IgG-羊抗鼠，其中鼠IgG偶联胶体金后用于流动相，羊抗鼠用于固定相。本发明的另ー个目的是提供ー种如上述的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤I.固相膜制备用缓冲液将检测线划膜液(鼠抗人IgM)稀释至l_2mg/ml，将质控线划膜液(羊抗鼠)稀释至2_4mg/ml，按I μ 1/cm的浓度在硝酸纤维素膜的中部划出两条水线。硝酸纤维素膜室温或37°C干燥备用。2.胶体金偶联按5-10 μ g蛋白Iml胶体金的投料比将HAV抗体偶联在胶体金上。离心去除多余的抗体。再按I : 10-1 40的比例投入HAV抗原，室温反应后，离心去除多余的抗原，即得胶体金-抗体-抗原偶联复合物。将偶联复合物铺于金标垫上，370C干燥备用，为检测垫。3.质控流动相制备按10-20 μ g蛋白Iml胶体金的投料比将质控流动相蛋白(鼠IgG)偶联在胶体金上，离心去除多余的蛋白，37°C干燥备用，为质控垫。4.粘贴制备大板将上吸水纸、固相膜、检测垫、质控垫、样品垫依次粘贴在底板上。底板上还可以粘贴保护性或指标性的不干胶条。5.分切小条按2. 5-4mm的宽度将大板切为小条，为试纸条。6.视需要装配塑料卡座将小条放在上下两片的塑料卡座中，塑料卡座在固相膜与样品垫处有两个窗ロ，为观测窗与加样窗。加上塑料卡座后一般称为检测卡。7.单人份内包装将试纸条或检测卡封装于铝箔袋中，袋中还需要加上一片干燥齐U，视需要加入一次性滴管。在免疫检测抗体的方法上，一种是包被抗原，用酶或其它指示物标记抗人ニ抗的模式，称为间接法。ー种是包被抗人ニ抗，用酶或其它指示物标记抗原的模式，称为捕获法。本发明的模式为捕获法。本发明的试剂盒，能在2-15分钟内得到检测结果，并且能够方便地应用于单份标本的检测。其应用价值在于(I)急诊应用，可以迅速判定病因。(2)可以最快的速度判定甲肝病毒的流行，并使之得到有效控制。(3)很多报告病例量较少的基层医疗机构，原来需要将标本送往上ー级单位，因而延误诊断时间。新技术可以使基层医疗机构获得检测能力，从而能更早地诊断甲型肝炎病毒的感染。
图I检测卡的分层结构2试纸条的侧视图 其中，⑴加样孔⑵样品垫(3)质控垫(4)检测垫(5)固相膜(6)观察窗ロ(7)质控线(C)⑶底卡(9)上吸水纸(10)塑料卡上片(11)塑料卡下片(12)检测线(T)图3试纸盒结果判定方法
具体实施例方式实施例一试剂盒制备エ艺试剂盒制备过程包括以下步骤I.固相膜制备；2.胶体金偶联；3.质控流动相制备；4.粘贴制备大板；5.分切小条；6.视需要装配塑料卡座；(一)固相膜制备I.检测线划膜液用O. 02M(PH = 7. 4)PB将鼠抗人IgM稀释为l_2mg/ml，混匀，用40 μ m滤膜过滤后备用。2.质控线划膜液用O. 02M(PH = 7. 4)PB将羊抗鼠IgG稀释为2_4mg/ml，混匀，用40 μ m滤膜过滤后备用。3.用划膜仪在硝酸纤维素膜中部划线。划膜參数为划线头高度4. 8cm，划线笔间距 O. 5-lcm,划线浓度 O. 8-1 μ 1/cm,划线速度:100_150mm/s。4.在低于35%湿度下，37°C干燥3小时以上。( ニ)胶体金偶联，生产出检测垫I.使用材料I. I 40_60nm直径胶体金溶液I. 2 O. IM 硼酸缓冲液(BB) (PH8. 5-9. O)I. 3 10% BSAI. 4 洗脱液0. OlM 硼酸缓冲液(PH8. 5-9. 0),0. 5% BSAI. 5 金标稀释液0. OlM 硼酸缓冲液(PH8. 5-9. 0),0. 5% BSA, I % Tween-20, 2%糖2.使用干净专用玻璃量筒取胶体金溶液100ml，观察外观红色透明、无沉淀及变色等现象，将其全部倒入圆底烧瓶内。在圆底烧瓶中加入磁性转子，置磁力搅拌器上，开启搅拌并调节至合适转速。使用移液器取O. IMBB 10ml，观察外观透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，然后将其加入烧瓶内。3.使用移液器取用Anti-HAV O. 5_lmg。观察外观透明、无浑浊、沉淀及变色等现象,将其全部加入胶体金中。注意不要加到烧瓶内壁或溅出。持续搅拌5分钟。4.使用移液器取10% BSA 5ml，观察外观黄色透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，然后将其全部加入烧瓶内。持续搅拌5分钟。关闭搅拌，将金标溶液均分至离心管中，10000-12000rpm离心30分钟，吸弃上清。5.合并各离心管，使用移液器取HAVAg，取样量根据原料使用浓度确定。观察外观 透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，然后将其加入上述玻璃瓶内。吸头在溶液中吸打两次，以清除残液。6.加入金标洗脱液恢复至100ml，室温搅拌反应2小时。10000-12000rpm离心30
分钟,吸弃上清。7.各离心管按原体积加入金标洗脱液使沉淀复溶，再10000-12000rpm离心30分钟，吸弃上清。取金标稀释液加入离心管中，使沉淀复溶为20-30%原体积。8.将偶联物铺于玻璃纤维或聚酯膜上，置于烘箱内烘干过夜。要求在环境空气湿度低于35%的条件下干燥时间达到16小时以上。9.将干燥的检测垫切成4_5mm宽度的细条。(三)质控流动相制备，生产出质控垫I.使用材料I. I 40_60nm直径胶体金溶液I. 2 O. IM 硼酸缓冲液(BB) (PH8. 5-9. O)I. 3 10% BSAI. 4 洗脱液0. OlM 硼酸缓冲液(PH8. 5-9. 0),0. 5% BSAI. 5 金标稀释液0. OlM 硼酸缓冲液(PH8. 5-9. 0),0. 5% BSA,I % Tween-20, 2%鹿糖2.使用干净专用玻璃量筒取胶体金溶液100ml，观察外观红色透明、无沉淀及变色等现象，将其全部倒入圆底烧瓶内。在圆底烧瓶中加入磁性转子，置磁力搅拌器上，开启搅拌并调节至合适转速。使用移液器取O. IMBB 10ml，观察外观透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，然后将其加入烧瓶内。3.使用移液器取用鼠IgG l_2mg。观察外观透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，将其全部加入胶体金中。注意不要加到烧瓶内壁或溅出。持续搅拌5分钟。4.使用移液器取10% BSA 5ml，观察外观黄色透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，然后将其全部加入烧瓶内。持续搅拌5分钟。关闭搅拌，将金标溶液均分至离心管中，10000-12000rpm离心30分钟，吸弃上清。5.各离心管按原体积加入金标洗脱液使沉淀复溶，再10000-12000rpm离心30分钟，吸弃上清。取金标稀释液加入离心管中，使沉淀复溶为20-30%原体积。
6.将偶联物铺于玻璃纤维或聚酯膜上，置于烘箱内烘干过夜。要求在环境空气湿度低于35%的条件下干燥时间达到16小时以上。7.将干燥的质控垫切成4-5_宽度的细条。(四)粘贴制备大板；I.操作现场干燥间工作台，配制前应确认工作现场已清�。芽羟一肪呈鹊陀�35%。2.将吸水纸切成3cm的宽度。3.在背衬板上贴吸水纸要求吸水纸下边沿覆盖硝酸膜上边沿1mm。4.在背衬板上贴检测垫要求金纸的上沿应覆盖膜下沿I. 5-2. 0mm。
5.在背衬板上贴质控垫要求金纸的上沿应达到检测垫的1/2处并压着下沿。6.在背衬板上贴样品垫要求样品垫的上沿必须在质控垫的1/2处并压着下沿。7.视需要粘贴保护性或指示性不干胶(五)分切小条；I.对切条机进行调试，设置切条宽度为3_4mm。2.将大卡平整放于卡槽处，进行切条。3.将破损、污溃、标注不合格的小条挑出。4.装铝箔袋。要求每袋一条试纸、ー个干燥剂。5.封ロ打批号。(六)视需要装配塑料卡座；I.将小条置塑料卡底座中部，盖上上盖，压紫。2.装铝箔袋。要求每袋一条试纸、ー个干燥剂。3.封ロ打批号。实施例ニ 试纸条检测操作过程I.将样本作I : 100稀释。(取一次性试管，先加入10 μ I样本，再加入1000 μ I
生理盐水，混匀即可)。2.打开铝箔袋，取出试纸条/卡备用。3.试纸条加样区为MAX线以下。将试纸条MAX箭头所指方向浸入己I : 100稀释样本中直到标记线为止，确保浸泡时间不少于15秒，然后将试纸条平置在记录纸(可用Α4纸代替)上，同时开始计时。4.检测卡吸取100μ I己I : 100稀释的样品，加入试纸卡的加样孔中。5.可以观察到红色液体向上端流动，并在观测区沉积成红线。6.测试结果应在15分钟内判定。15分钟后判定无效。实施例三结果判定I.阳性(+):两条红色条带出现。一条位于检测线(T)，另一条位于质控线(C)。2.阴性㈠仅质控线(C)出现一条红色条带，在检测线⑴内无红色条带出现。3.无效质控线(C)未出现红色条带，表明此次试验无效。实施例四试剂盒性能评价I.最低检出量參考品的测定经国家參考品标定的内部质控盘，其中包括阳性參考品10份，编号Ρ1-Ρ10。阴性參考品10份，编号N1-N10。最低检出量參考品4份，编号L1-L4。其中LI相当于国家參考品I : 4，L2相当于国家參考品I : 8，L3相当于国家參考品I : 16，L4为阴性血清。另有精密度參考品I份。内部质控盘说明书要求阳性參考品与阴性參考品检出率为100%，最低检出量要求LI、L2应检出阳性，L3可阴可阳，L4检出阴性，精密度参考品检出阳性并显
色一致。我们使用三个批次的胶体金试纸条测定质控盘，结果如表I所示。表I :最低检出量參考品的測定结果
权利要求
1.ー种快速检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒，其特征在于，利用捕获法反应原理，并结合胶体金免疫层析技木。试剂盒包括抗人IgM、胶体金偶联的抗原抗体复合物以及支持性材料与质控反应系统。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，抗人IgM包被在检测线(T)上，所述抗人IgM可以为羊抗人IgM,也可以为鼠抗人IgM。
3.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，病毒抗原抗体复合物与胶体金偶联并干燥后置于金标垫上
4.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，质控系统，由一对可以特异性反应的抗原抗体组成，其中一项与胶体金偶联后置于金标垫上，为流动相。另ー项固化于质控线(C)，为固定相。在检测时，流动相溶解后向上层析，并被结合在质控线上。
5.ー种制备权利要求I所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤 a)固相膜制备。
b)胶体金偶联。
c)质控流动相制备。
d)粘贴制备大板。
e)分切小条。
f)视需要装配塑料卡座。
g)单人份内包装。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒，利用捕获法反应原理，并结合胶体金免疫层析技术。试剂盒包括抗人IgM、胶体金偶联的抗原抗体复合物以及支持性材料与质控反应系统。技术方案为采用抗人IgM包被在检测线(T)上。病毒抗原抗体复合物与胶体金偶联并干燥后置于金标垫上。其中检测线的鼠抗人IgM是固化的，金标垫的抗原抗体复合物是可流动的。试剂盒还包括一个质控系统，由一对可以特异性反应的抗原抗体组成，其中一项与胶体金偶联后置于金标垫上，为流动相。另一项固化于质控线(C)，为固定相。本发明的试剂盒，能在2-15分钟内得到检测结果，并且能够方便地应用于单份标本的检测。
文档编号G01N33/576GK102692502SQ20121012522
公开日2012年9月26日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者张旭东, 徐菲, 李玉彬, 潘国华, 王学前, 秦伟涛, 郑嘉庚 申请人:北京北方生物技术研究所
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