专利名称：一种面向空间的螺旋式微流控pcr实时荧光检测系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微流控生物芯片荧光微光谱检测系统，是一种“功能集成结构缩微”型的PCR扩增反应装置，主要用于微流体荧光光谱检测，属于生物学、分析化学及医学检测领域。
背景技术：
分析测试是人类最频繁的科学技术活动之一，创新分析测试技术及相应的创新分析测试仪器在很大程度上代表了一个国家的科技水平，在以生命科学为主导的21世纪，新一代的分析测试仪器应该更加微型化、自动化、快速化与便携化。微型全分析系统(Miniaturized Total Analysis System, μ TAS)又称芯片实验室(lab on a chip, LOC)。μ TAS的目标是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度地把分析实验室的功能集成到便携设备上，甚至是方寸大小的芯片上，即实现生化分析实验室的“功能集成结构缩微”。随着我国载人航天技术的日趋成熟，航天任务周期的逐渐延长，对航天员健康保障的要求也会越来越高。航天器中处于非监控状态的微生物严重威胁航天员的健康。同时，航天飞行器上携带有能在太空环境下生存的微生物，有可能通过人类或航天器带到空间站、其他星球表面，会对人类研究太空生命形式造成不利影响。因此，航天器上装备生物�：κ凳弊远ň低呈鞘直匾�。·生物�：Ρň鞯墓丶际跏锹恪肮δ芗山峁顾跷ⅰ钡奈⑿陀饧觳庾爸茫允迪种亓壳�、体积小、全自动检测为目标，而目前的生物芯片荧光检测系统也有同样的要求，此外都需要对微量的样品首先进行PCR扩增反应，使目标DNA实现体外复制达到一定检测量后进行检测分析。因此，微型荧光检测装置的研究可以移植在PCR微流控生物芯片上进行，然后对检测系统在失重条件下的计算进行修正研究，以达到空间应用要求。PCR微流控生物芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它是将采样、稀释、加试剂、反应、分离和检测等功能集成于一个芯片里，其科学性和先进性集中体现在结构缩微和功能集成这两个方面。其工作原理是PCR反应混合物在精密注射泵的作用下按设定的流速进入生物芯片上的微通道，流经三个不同温度的恒温区(94°C、56°C >72°C )，经过PCR的变性、复性和延伸，实现一次扩增循环，从而使DNA总量增加一倍。在合适条件下，这种循环不断重复，η次循环后使产物DNA的量按2η方式扩增。最后待测微流体由激发光源照射发出荧光，由光敏元件采集荧光信号并经过光电转换后输出荧光值的电信号。传统的PCR微流控生物芯片若要实现在空间进行实时荧光检测工作，主要存在如下缺点1、温度控制系统采用铜块或铝块进行加热和风扇冷却相配合，整个装置耗能多，体积大难以缩�。薹ㄊ迪直阈裕�2、目前荧光检测器都是使用传统的封装光电管，如光电倍增管(PMT)或电荷耦合元件(CCD)。由于元件自身体积大，而且又是分体使用，需要有配套的光路装置，致使整个荧光检测装置的体积庞大，根本不可能嵌入到生物芯片中；3、由于在激发光传导和反射光采集时需要各类光学器件和光纤组成的光路进行光路传输，不仅结构复杂难以实现集成化，并且影响实时荧光检测的稳定性；4、生物芯片的进样控制系统、温度控制系统、荧光检测系统一般采用各部分单独控制，不仅体积庞大且无法对微通道内温度的变化、微流体的流速和荧光信号之间进行实时监测和反�。灰虼耍兄铺寤�、重量轻且高度集成自动化的微型微流控PCR荧光检测系统是主要目标，其中研制体积小、灵敏度高到能达到生物技术要求的微型荧光检测装置是其关键技术。
发明内容为了很好地解决上述问题，本发明涉及一种微型微流控实时荧光PCR检测系统，主要由进样测控速模块、恒温加热�？橐约坝饧觳饽？樽槌桑康脑谟谑迪指霉ぷ飨低车募勺远刂朴胛⑿捅阈�。本发明是采取以下技术手段实现的一种螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统，其包括有呈空心圆柱式的基底1、微通道5、进样测控速装置2、单片机控制系统9。作为生物芯片的载体，基底I表面周向依次设有三个恒温加热区4，即温度为94°C的高温变性区、温度为72°C的适温延伸区、温度为56 °C的低温退火区，相邻的两个恒温加热区4之间为隔热区，在隔热区设有隔热风门8，同时在三个加热区表面分别设置三个温度传感器6，对温度进行实时监测；由聚四氟乙烯毛细管呈螺旋状直接缠绕在基底表面构成微通道5，聚四氟乙烯毛细管一圈缠绕中依次经过高温变性区、低温退火区、适温延伸区后实现DNA扩增，为了达到检测所需量要求，需要循环25至30次上述的反应过程，因此微通道5的螺旋数目为25至30个；进样测控速装置2包括步进电机和由步进电机驱动的注射泵，注射泵直接插入微通道5的入口 ；微型风扇3与隔热风门8实现对不同温区间的隔热作用，隔热风门8为基底I上的穿孔，排布在上述的隔热区上，微型风扇3处于基底I的空心内部；在适温延伸区与高温变性区之间的隔热区设置有微型荧光检测装置7，微型荧光检测装置7沿基底1径向嵌在基底内部；所述的微型荧光检测装置7包括激发光源单元与荧光检测单元；进样测控速装置2、恒温加热区4、温度传感器6以及微型荧光检测装置7的控制端由单片机控制系统9集成控制，控制界面可由键盘输入，由IXD12864显示输出。其工作过程为由键盘输入设定的温度值、微流体流速后，单片机开启恒温加热区4上的加热膜，由温度传感器6监控实时温度并反馈给单片机9由LCD显示；待稳定达到设定温度值后，单片机9控制进样测控速装置2即步进电机按预先设定的流速实现进样；同时开启微型荧光检测装置7，当微流体流微型荧光检测装置7所在位置时，进行荧光检测，获得的荧光信号值反馈回单片机经D\A转换并放大后由LCD显示。每个循环的同一位置都设有微型荧光检测装置7。所述的恒温加热区4采用贴片式加热薄膜，将贴片式加热薄膜直接粘贴在基底I表面，温度传感器6采用钼电阻温度传感器直接粘贴在贴片式加热薄膜表面。[0018]所述的微型荧光检测装置7由激发光源单元10与荧光检测单元11以及检测装置的电输入层18组成。其中激发光源单元10为管状，由依次放置的光源13、激发光滤光片
15、光学微透镜12和将光源13、激发光滤光片15包围起来多层光学薄膜17组成,光学薄膜17起到对管内光波高反射和对管外光波完全阻隔的作用。光源13的出射光经过激发光率光片15从光学微透镜12出射；荧光检测单元11同样为管状，由依次放置的光学微透镜
12、检测光滤光片16、光电转换器件14和将检测光滤光片16、光电转换器件14包围起来的多层光学薄膜17组成；光学微透镜12收集的光经过检测光滤光片16，再由光电转换器件14收集。电输入层18位于基底I的内部空心处。所述的激发光源单元10的结构是将激发光源13与激发光滤光片15用多层光学薄膜17包围成管状，然后在激发光滤光片14上采用原位成型法制作光学微透镜12，即将紫外光学固化胶液滴从高处垂直释放，滴落到激发光滤光片15上，并由上而下向四周扩散流淌，然后用紫外激光对液滴进行照射，使其固化后形成微光学透镜12 ;前述的光源13为导体发光二极管(LED)或半导体激光二极管(LD)，所发光的峰值波长为475nm，激发光滤光片15的透射峰值波长为475nm ；所述的荧光检测单元11的结构与激发光源单元10的相似，是将光电转换器件14与检测光滤光片16用多层光学薄膜17包围成管状，然后在滤光片16上制作光学微透镜
12。光电转换器件14为光电二极管或硅兰光电池，光电转换的峰值波长为525nm，检测光滤光片16的透射峰值波长也为525nm ；如图3所示，微型荧光检测装置7与基底I的连接方式是沿径向嵌在基底I的内部，检测装置底端的电源13与光电转换器件14的控制端与处于基底内部空心处的电输入层18相连，前端的光学微透镜12沿径向直接与微通道5接触。所图2所示微型荧光检测装置7包括有并排布置的两个 激发光源单元10和荧光检测单元11，沿微流体在微通道5的流动方向线性排列在基底I的圆柱切线方向。为了实现对扩增结果的实时检测，待测微流体每经过一个反应循环进行一次荧光检测，因此在每个循环的同一位置都设有微型荧光检测装置7，如图1所示在基底I表面沿轴向呈线性排布。所述的聚四氟乙烯毛细管的直径为O. 5mm。所述的注射泵为精密注射泵。本发明的工作过程如下如图1所示，进样测控速装置2由注射泵和步进电机组成，由单片机控制系统9给予步进电机不同的指令实现对微流体流速的控制；待测微流体进入微通道5后依次流经94°C、56°C和72°C的恒温加热区4，使DNA经高温变性、低温退火及适温延伸后完成一次循环实现扩增，可通过设定不同温区的宽度来确定微流体在不同温区所需的反应时间，贴片式温度传感器6直接粘贴在恒温加热区4表面，采集实时温度值后反馈到单片机控制系统9进行实时监控；如图2所示在72°C与94°C温区之间的隔温区设有微型荧光检测装置7，该装置包括两个激发光源单元10和一个荧光检测单元11，其位置是沿基底I径向嵌在基底I内部，前端的光学微透镜12与微通道直接接触。为了实现对每次扩增结果进行荧光检测，因此在微通道每个循环的同一位置都设有微型荧光检测检测装置7，同时还可对微流体的流速进行实时监测；[0027]如图3所示荧光检测的工作过程是激发光源单元13所发光的峰值波长为475nm，通过透射峰值波长也为475nm的激发光滤光片15后经光学微透镜12聚焦到微流体上。微流体由激发光激发出荧光，被荧光检测单元11前端的光学微透镜12采集，通过检测光滤波片16后,滤出525nm的突光被半导体光电转换器件14接收,变成电信号后经检测装置的电输入层18输出；微流体实时测控速的工作过程是如图1所示每相邻的两个荧光检测点在微流体流动方向上的长度为一个循环长度，微流体按预先设定好的流速在微通道内流动，当微流体前端流至微型荧光检测装置7时，单片机控制系统9会记录流经一个循环长度的时间，因此得到微流体在该通道内的实际的工作流速和实际流速需调整量，从而反馈给单片机控制系统9后再将实际流速调整量反馈到步进电机完成下一个循环。本发明的工作系统与现有技术相比，具有以下明显的优势和有益效果本发明采用单片机微处理器集成控制系统，既减少了多余的外围设备，使系统更加自动微型化，又使不同�？橹浼笆狈蠢〔⒆龅髡笏醵塘苏鱿低车墓ぷ髦芷�。本发明采用空心圆柱式基底作为生物芯片的载体，根据其不同方向的放置时微流体不同方向的流动，可分析重力作用对微流体流动的影响，对失重条件下的计算分析结果加以修正研究，以满足空间要求；本发明中的微通道采用聚四氟乙烯毛细管，直接排布在贴有加热薄膜的基底上，不仅制作工艺简单、性价比高、可一次性使用，而且毛细管内壁光滑，可避免由粗糙度引起的层流效应等。用固化胶或黑漆对毛细管表面进行处理，即可满足荧光检测时所需的避光环境； 本发明中的微型荧光检测装置7，集成了全部非电要素，如激发光源、光的聚集、传输、光勻束、光米集、光检测等。由于取代了无法嵌入芯片的光电倍增管PMT或电荷稱合兀件CCD，使得整个装置的特征尺寸缩小到只有毫米数量级。由于微型荧光检测装置7设置在微通道每个反应循环的同一位置，还可根据微流体的前端是否流至当前检测位置对微流体的流速进行实时调整。
图1为螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统总结构图；图2为螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统的径向截面图；图3为微型荧光检测装置7的局部示意图；图中1基底；2进样测控速装置；3微型风扇；4恒温加热区；5微通道；6温度传感器；7微型荧光检测装置；8隔热风门；9单片机控制系统；10激发光光源单元；11荧光检测单兀；12光学微透镜；13激发光源；14光电转换器件；15激发光滤光片；16检测光滤光片；17光学薄膜；18检测装置的电输入层。具体实施案例
以下结合附图1 3详细说明本实施例本专利的结构示意图如图1所示，待测微流体按预先设定的流速由进样测控速装置2注入微通道5，微流体测控速的工作过程为每相邻的两个荧光检测装置7沿流动方向的通道长度为一个循环长度，微流体按预先设定好的流速在微通道5内流动，当微流体前端流至微型荧光检测装置7时，单片机控制系统9会记录流经一个循环长度的时间，因此得到微流体在该通道内的实际的工作流速和实际流速需调整量，从而反馈给单片机控制系统9后再将实际流速调整量反馈到步进电机完成下一个循环；当微流体依次流经94°C、56°C和72°C的恒温加热区4后，使DNA经高温变性、低温退火以及适温延伸完成一次循环实现扩增，可通过设定不同温区的宽度确定微流体在不同温区所需的反应时间。其中温度传感器6直接粘贴在恒温加热区4表面，采集实时温度值后反馈到单片机控制系统9进行实时监控，加热区的制作方式是将加热薄膜直接粘贴在基底I上，温度传感器6可采用钼电阻温度传感器；当待测微流体经过适温延伸后流至微型荧光检测装7后，如图3所示激发光源单元13发出峰值波长为475nm的激发光，通过透射峰值波长也为475nm的激发光滤光片15后经光学微透镜12聚焦到微流体上，微流体由激发光激发出荧光，被荧光检测单元11前端的光学微透镜12米集,通过检测光滤波片16后,滤出525nm的突光被半导体光电转换器件14接收，变成电信号后由检测装置的电输入层18输出。其中如图2所示微型荧光检测装置7的位置为沿基底I径向嵌在72°C与94°C温区之间的隔温区，由两个激发光源单元10和一个荧光检测单元11组成，激发光源13可使用半导体发光二极管(LE D)或半导体激光二极管(LD)，光电转换器件14可以是光电二极管(PIN)或硅兰光电池。
权利要求1.一种面向空间的螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统，其特征在于其包括有呈空心圆柱式的基底(I)、微通道(5)、进样测控速装置(2)、单片机控制系统(9); 作为生物芯片的载体，基底(I)表面沿周向依次设有三个恒温加热区(4)，即温度为94°C的高温变性区、温度为72°C的适温延伸区和温度为56°C的低温退火区，相邻加热区之间为隔热区，在隔热区设有隔热风门(8)，同时在每个加热区表面分别设置一个温度传感器(6)，对温度进行实时监测；由聚四氟乙烯毛细管呈螺旋状直接缠绕在基底表面构成微通道(5)，聚四氟乙烯毛细管一圈缠绕中依次经过高温变性区、低温退火区、适温延伸区后实现DNA扩增，为了达到检测所需量要求，需要循环25至30次上述的反应过程，因此微通道(5)的螺旋数目为25至30个；进样测控速装置(2)包括步进电机和由步进电机驱动的注射泵，注射泵直接插入微通道(5)的入口 ；微型风扇(3)与隔热风门(8)实现对不同温区间的隔热作用，隔热风门(8)为基底(I)上的穿孔，排布在上述的隔热区上，微型风扇(3)处于基底Cl)的空心内部；在适温延伸区与高温变性区之间的隔热区设置有微型荧光检测装置(7)，微型荧光检测装置(7)沿基底(I)径向嵌在基底内部；所述的微型荧光检测装置(7)包括激发光源单元与荧光检测单元；进样测控速装置(2)、恒温加热区(4)、温度传感器(6)以及微型荧光检测装置(7 )的控制端由单片机控制系统(9 )集成控制，控制界面可由键盘输入，由LCD12864显示输出，其工作过程为由键盘输入设定的温度值、微流体流速后，单片机开启恒温加热区(4)上的加热膜，由温度传感器(6)监控实时温度并反馈给单片机(9)由LCD显示；待稳定达到设定温度值后，单片机(9)控制进样测控速装置(2)即步进电机按预先设定的流速实现进样；同时开启微型荧光检测装置(7)，当微流体流微型荧光检测装置(7)所在位置时，进行荧光检测，获得的荧光信号值反馈回单片机经D\A转换并放大后由LCD显示。
2.根据权利要求1所述的一种螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统，其特征在于每个循环的同一位置都设有微型荧光检测装置(J)。
3.根据权利要求1所述的一种螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统，其特征在于所述的恒温加热区(4)采用贴片式加热薄膜，将贴片式加热薄膜直接粘贴在基底(I)表面，温度传感器(6)采用钼电阻温度传感器直接粘贴在贴片式加热薄膜表面。
4.根据权利要求1所述的一种螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统，其特征在于所述的微型荧光检测装置(7)由激发光源单元(10)与荧光检测单元(11)以及检测装置的电输入层(18)组成；其中激发光源单元(10)为管状，由依次放置的光源(13)、激发光滤光片(15)、光学微透镜(12)和将光源(13)、激发光滤光片(15)包围起来多层光学薄膜(17)组成，光学薄膜(17)起到对管内光波高反射和对管外光波完全阻隔的作用；光源(13)的出射光经过激发光率光片(15)从光学微透镜(12)出射；突光检测单兀(11)同样为管状，由依次放置的光学微透镜(12)、检测光滤光片(16)、光电转换器件(14)和将检测光滤光片(16)、光电转换器件(14)包围起来的多层光学薄膜(17)组成；光学微透镜(12)收集的光经过检测光滤光片(16)，再由光电转换器件(14)收集；电输入层(18)位于基底(I)的内部空心处。
5.根据权利要求4所述的一种螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统，其特征在于前述的光源(13)为导体发光二极管或半导体激光二极管，所发光的峰值波长为475nm，激发光滤光片(15)的透射峰值波长为475nm。
6.根据权利要求4所述的一种螺旋式微流控PCR实时突光检测系统,其特征在于光电转换器件(14)为光电二极管或硅兰光电池，光电转换的峰值波长为525nm，检测光滤光片(16)的透射峰值波长也为525nm。
7.根据权利要求1所述的一种螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统，其特征在于微型荧光检测装置(7 )与基底(I)的连接方式是沿径向嵌在基底(I)的内部，检测装置底端的电源(13)与光电转换器件(14)的控制端与处于基底内部空心处的电输入层(18)相连，前端的光学微透镜(12)沿径向直接与微通道(5)接触；所述的微型荧光检测装置(7)包括有并排布置的两个激发光源单元(10 )和一个荧光检测单元(11)，沿微流体在微通道(5 )的流动方向线性排列在基底(I)的圆柱切线方向；为了实现对扩增结果的实时检测，待测微流体每经过一个反应循环进行一次荧光检测，在每个循环的同一位置都设有微型荧光检测装置(7)，在基底(I)表面沿轴向呈线性排布。
8.根据权利要求1所述的一种螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统，其特征在于所述的聚四氟乙烯毛细管的直径为O. 5mm。
9.根据权利要求1所述的一种螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统，其特征在于所述的注射泵为精密注射泵。
专利摘要一种面向空间的螺旋式微流控PCR实时荧光检测系统，属于生物学、分析化学及医学检测领域。包括呈空心圆柱式的基底、微通道、进样测控速装置以及单片机控制系统。作为生物芯片的载体，基底表面沿周向依次设有三个恒温加热区，在三个加热区表面分别设置三个温度传感器，由聚四氟乙烯毛细管呈螺旋状缠绕在基底表面构成微通道，聚四氟乙烯毛细管一圈缠绕中依次经过三个恒温加热区。进样测控速装置包括步进电机和由步进电机驱动的注射泵，注射泵直接插入微通道的入口。微型荧光检测装置沿基底径向嵌在基底内部。进样测控速装置、恒温加热区、温度传感器以及微型荧光检测装置的控制端由单片机集成控制。本实用新型减少了外围设备，更自动微型化，缩短了系统的工作周期。
文档编号G01N21/64GK202898426SQ20122033837
公开日2013年4月24日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者吴坚, 杨洋, 陈涛, 刘世炳 申请人:北京工业大学
专业数控铣床产品供应商
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