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专利名称：胰腺癌遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体胰腺癌遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与胰腺癌密切相关的5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、着色性干皮病互补组C基 因乂XPC)、 X射线交错互补修复基因1 (XRCC1)和胸腺嘧锭合成酶基因(TS)上的单核苷酸多态性位点基 因型来评估个体胰腺癌遗传易感性。
背景技术：
胰腺癌恶性程度高，不易早期发现，转移早而快、预后差。据统计，在确诊后只有12% 15%的病例可 进行手术根治，术后5年生存率仅0 2%,而90%以上的病人在确诊后1年内死亡，平均存活期少于6个 月。过去，人们常说，肝癌是"癌中之王"，而胰腺癌则是"王中之王"。胰腺癌早期无明显症状，或仅仅 有上腹部不适和食欲减退。癌肿发展到一定程度后开始出现症状，有上腹痛、黄疽和体重减轻。另外，由 于消化功能紊乱，还可出现恶心、呕吐、腹胀、腹泻或便秘等消化道症状。
MTHFR的主要作用是在叶酸代谢通路中将5， 10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢 叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接地为DNA甲基化和蛋白质甲 基化提供甲基，并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。MTHFR基因第5号外显子上的 一个C/T多态位点(C677T)突变，导致所编码的蛋白第222个氨基酸由Ala(A)变为Val(V)。该多态位点 的基因型有CC、 CT、 TT,其中CT、 TT被确定为胰腺癌的风险基因型。当携带风险基因型时，MTHFR耐热 性下降，酶活性减弱[l]，从而导致甲基供体S-腺苷甲硫氨酸的产量下降，DNA甲基化受阻，削弱DNA损 伤修复能力，进一步增加了胰腺癌的发病风险。
XPC基因编码的蛋白存在于细胞核中，是核苷酸切除修复系统的重要成分。有证据显示，XPC蛋白可 与冊23B基因的表达产物紧密结合形成一个异二聚体,在切除修复初始阶段发挥识别DNA损伤部位的功能。 PAT多态是XPC基因第9号内含子的多个AT双核苷酸的插入缺失多态(78bp)。该多态位点有三种基因型 PAT(+/+)、 PAT(+/-)、 PAT(-/-),现已确认PAT(-/-)基因型是胰腺癌发病的风险i因型。XPC-服2犯复合 物对DNA损伤位置的识别，是核苷酸切除修复的重要步骤。XPC基因PAT多态可能影响了 XPC-HR23B复合 物对DNA损伤位置的识别能力，从而使得DNA损伤修复能力降低，DNA损伤积累，导致多种肿瘤的发病风 险增加。研究结果显示，携带PAT -/-基因型者，胰腺癌的发病风险明显增加。
人类X射线交错互补修复基因l(XRCCl)是第一个分离到的影响细胞对电离辐射敏感性的哺乳动物基 因，该基因广泛参与DNA损伤的修复。XRCC1基因Argl94Trp是该基因第6号外显子上的一个C/T多态位 点，引起XRCCl基因编码蛋白的第194个氨基酸由Arg变为Trp。该位点有三种基因型，分别为CC(Arg/Arg〉、 CT(Arg/Trp)、 TT(Trp/Trp)，其中CT(Arg/Trp) 、 TT(Trp/Trp)被确定为胰腺癌的风险基因型。研究显示， 当个体携带风险基因型时XRCC1蛋白的活性降低，碱基切除修复能力降低，DNA损伤增多，胰腺癌患者的. 总生存期的变短。
TS基因编码的胸腺嘧啶合成酶参与叶酸代谢通路。叶酸代谢在从叶酸转变生成5-甲基四氢叶酸的 过程中涉及四个基本的生化步骤。TS基因的启动子区存在一个28bp的串联重复多态(2R/3R)。最近有研 究发现，当该位点的串联重复为3R的时，第2个重复片段会出现一个G/C多态，因此形成双重多态。以 上两种多态组成六种基因型3Rg/3Rg、 3Rg/3Rc、 3Rg/2R、 3Rc/2R、 2R/2R、 3Rc/3Rc,',其中现己确定3Rc/3Rc 为胰腺癌的风险基因型。研究显示，TS基因2R/3R多态可以调节TS基因表达，其中3R等位基因的第2 个重复片段的G/C多态与TS表达水平下降有关，而TS酶活性下降将减少dUMP甲基化生成dTMP，破坏dNTP 池(即dATP， dTTP， dCTP， dGTP的比例)的平衡，增加尿嘧啶错误渗入DNA的机会，尿嘧啶经切除修复 导致DNA双链断裂，引起染色体损伤和脆性位点的产生。有研究表明，携带3Rc/3Rc基因型者患胰腺癌的 风险明显增加。

发明内容
基于5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、着色性干皮病互补组C基因(XPC) 、 X射线交错互补
3修复基因1 (XRCC1)和胸腺嘧啶合成酶基因(TS)的4个SNP位点多态性可用来评估个体胰腺癌遗传易感 性的基础上，本发明提供一种检测个体胰腺癌遗传易感性的试剂盒。 该试剂盒包括
检测MTHFR基因上C677T SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测XPC基因上SNP多态性基因型的电泳检测引物对；
检测XRCC1基因上Argl94Trp SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测TS基因上SNP多态性基因型的电泳检测引物对； .PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、去离子水等)； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常规的合成技术进行合成。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对可用常规的探针合成 技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括
1. 荧光定量PCR反应套装
10 X荧光定量PCR反应缓冲液2nl， 25mM dNTP混合液0.2^1， 25mM MgC12溶液1. 2^1, 5unitsAi1 Taq DNA聚合酶0. 05pl， 20HM特异性引物对每条引物各0.225^, 10HM特异性荧光探针对每条探针各0.25pl， 去离子水10.65(^1。
2. 电泳检测套装
10X PCR反应缓冲液2.5^1， 25mM dNTP混合液0. 2(il， 25mM MgCl2溶液1.5^1, 5units/nl Taq DNA聚合酶0. 125^1， 20nM电泳检测引物对每条引物各0.25^1， 去离子水18. 675jil， 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2:电泳检测分型
使用检测试剂盒中的电泳检测套装，反应的体系为总体积25pl，包含浓度为.〗2.5ngAi1的DNA模板 lnl、 IOXPCR反应缓冲液2.5^1, 25mMdNTP混合液0.2^1， 25mMMgC12溶液1.5jil, 5units/pl Taq DNA 聚合酶0.125fil, 20nM电泳检测引物对每条引物各0.25^1，去离子水18.675^1。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94'C、 12分钟，进行30个循环的94°C、 30秒，60°C、 30秒， 72。C、 30秒，然后进行72'C、 IO分钟。
然后利用电泳技术，进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带数量。步骤3:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行2次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为 总体积lOnl,包含浓度为20ng/nl的DNA模板2^1、 1^1 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1^1 25mM dNTP 混合液、0.6jil 25mM MgCl2溶液、0.025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20|aM的有义引物和反义引物 各0.225jxl、 10nM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25nl，去离子水5. 325^1。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50。C、 2分钟，95'C、 IO分钟，进行60个循环的95°C、 30秒， 60°C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4:基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉电泳检测技术的本领域技术人员能够通过辨识电泳图上DNA条带的位置和数量来确定所检测的 SNP位点的基因型。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型-'.
实施例2.应用检测试剂盒进行个体胰腺癌遗传易感性检测的服务 步骤1: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的XPC基因和TS基因上的SNP位点进行PCR扩增 和电泳检测，对MTHFR基因上C677T SNP位点、XRCC1基因上Argl94Trp SNP位点进行荧光定量PCR检测，. 确定这4个SNP位点的基因型。
步骤3:个体胰腺癌遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体胰腺癌遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被 检测者胰腺癌遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体胰腺癌遗传易感性分析报告单。
权利要求
1.一种检测个体胰腺癌遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上C677T SNP位点、着色性干皮病互补组C基因(XPC)上SNP位点、X射线交错互补修复基因1(XRCC1)上Arg194Trp SNP位点、胸腺嘧啶合成酶基因(TS)上SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括1)荧光定量PCR反应套装10 X荧光定量PCR反应缓冲液2W, 25mM dNTP混合液0. 2W, 25mM MgC12 溶液Dl， 5unitsM Taq DNA聚合酶0.05W, 20幽特异性引物对每条引物各0.225W， IO幽特异性 荧光探针对每条探针各0.25Pl，去离子水10.65W。2) PCR反应套装IOXPCR反应缓冲液2.5ri， 25mM dNTP混合液0.2W, 25mMMgC12溶液1.5W， 5unitsA4 Taq DNA聚合酶0. 20幽特异性引物对每条引物各0.25W，考声子水18.675W。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC。 "
全文摘要
本发明公开了一种检测胰腺癌遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、着色性干皮病互补组C基因(XPC)、X射线交错互补修复基因1(XRCC1)和胸腺嘧啶合成酶基因(TS)上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与胰腺癌遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体胰腺癌遗传风险。
文档编号G01N21/64GK101608220SQ20081003926
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司