专利名称：一种应用于结核病快速诊断的糖芯片、其制备方法及采用其的结核病诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药体外诊断试剂领域，更具体地讲，涉及一种应用于结核病快速诊断的糖芯片，其制备方法及采用其的结核病诊断试剂盒。
背景技术：
我国是结核病的高感染，高发病率国家，结核病的患病人数在世界各国中居于第二位。目前结核分枝杆菌临床检测方法有细菌学检测、血清学检测和基因诊断。结核病患者的细菌学检测是结核病诊断、治疗及评价治疗效果的可能手段，该手段包含BACTEC检测系统、分枝杆菌生长指示系统、噬菌体报告技术。该手段的检测方法即使是在缩短了检测时间这一缺点后仍存在一些不可能推广的问题，如需要昂贵的设备、标准化的细菌等。基因诊断对肺结核病检测、结核分枝杆菌菌种鉴定、耐药性监测等具有较高的特异性且需要的时间较短，但是因其高特异性反而容易出现假阴性的结果且有部分实验手段所需仪器昂贵等因素限制了其的普及，该手段主要包含结核分枝杆菌DNA扩增法、实时荧光定量PCR技术、PCR-RFLP、DNA探针技术和生物芯片技术。血清学检查因其取样方便、操作简单、快速、不依赖病原菌的检查，是临床诊断结核病的重要辅助手段，但特异性免疫诊断依赖于特异性抗原。结核病感染进程中体液免疫动态变化规律很复杂，缺少抗原优化组合的理论基�。车难蹇固寮觳庥捎诒昙呛图觳饧际趼浜螅约觳饬槊舳炔桓摺Ｄ壳吧唐坊淖楹峡固寮觳馐约梁校嘤锰匾斓鞍字士乖胙逯械目固褰岷希薹觳獬鏊薪岷嘶颊哐逯锌菇岷丝固�。这些检测方法都存在时间、特异性等方面的问题，不能快速准确的检测出患者所携带的结核分枝杆菌，给结核病的治疗和控制带来了很大的不便。因此，寻找快速、准确的诊断结核病的新方法是控制结核病的重要手段。糖芯片是继基因芯片和蛋白芯片之后诞生的新型生物技术，具有需要的样品量少、高通量和高特异性等优点，其基本原理与基因芯片和蛋白芯片相似，都是基于物质之间的特异性作用。它是将多个不同结构的糖分子通过共价或非共价作用固定于经化学修饰的基质上，进而对蛋白质、糖蛋白等待测样品进行测试、分析的一类分析方法。优越性在于其一，生物活性稳定。糖芯片可在室温条件下长期保存生物活性不变。其二，应用范围广泛。把糖芯片技术应用于医学临床上，可对多种传染性与非传染性疾病同时进行快速诊断。因为所有的细胞表面都含有糖类物质，这些糖类分子在细胞分子的识别过程中起着重要的作用。具有种属特异性的结核分枝杆菌细胞壁成分脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)、脂甘露聚糖(lipomannan, LM)是结核感染过程中重要的免疫反应调节因子，是结核分枝杆菌与巨噬细胞和树突状细胞作用的重要配体，其作为结核分枝 杆菌的重要抗原，一直是结核病发病机制、免疫病理、诊断治疗的研究靶点。国外研究者对LAM-IgG检测用于结核病诊断做过研究，并开发出相应的诊断试剂盒。国内也有学者开展了类似研究，但多是直接购买国外的抗原或试剂盒开展应用评估。依赖进口试剂，价格较为昂贵，限制了此项诊断技术的应用推广。本发明旨在自主开发的糖芯片技术的基础上，利用肟化反应固定糖探针的方法，将纯化得到的脂多糖抗原固定在固相载体上，并运用于血清学诊断，建立一种快速，准确基于糖芯片技术的结核病快速诊断试剂盒，为结核病防控提供有效手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种特异性好、灵敏度高且适用于大规模检
测的基于二种脂多糖类抗原与抗体的结核病快速检测方法。为了解决上述问题，本发明的一个目的在于提供一种用于结核病快速诊断的糖芯片，其包括固相载体，其特征在于，所述糖芯片还包括结核分枝杆菌脂多糖类抗原探针，所述结核分枝杆菌脂多糖类抗原探针通过肟化反应被固定于所述固相载体上。在一实施方式中，所述结核分枝杆菌脂多糖提取自结核分枝杆菌H37Rv菌株。在一实施方式中，所述结核分枝杆菌脂多糖为脂多糖LAM和LM。在一实施方式中，所述固相载体是经过化学改性的硝酸纤维膜或微孔板。在一实施方式中，所述固相载体的化学改性是根据如下步骤进行(I)将固相载体用环氧硅烷/甲苯溶液浸润，形成环氧化物功能的单层膜；(2)将上述得到的固相载体用a，Co- 二胺-聚乙二醇(Mw=2000)溶液处理，使固相载体上覆盖一层带伯氨基的聚乙二醇单层分子；(3)将氨基化的固相载体置于叔丁氧羰基氨氧基乙酸、乙烯和N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸缓冲液处理，洗涤后用HCl/醋酸处理，使伯氨基通过化学改性转换成羟胺。本发明的另一目的在于提供制备所述用于结核病快速诊断的糖芯片方法，包括以下步骤(I)提取、纯化结核分枝杆菌细胞壁脂多糖类抗原；(2)利用肟化反应的方法将脂多糖类抗原探针固定于经过化学修饰的固相载体，制作成糖芯片。其中，所述固相载体的化学改性是通过如上所述的步骤进行的。本发明的再一目的在于提供一种结核病检测试剂盒，所述结核病检测试剂盒包括上述的用于结核病快速检测的糖芯片。该试剂盒是基于以结核分枝杆菌细胞壁中脂多糖类抗原——脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)和脂甘露聚糖(lipomannan, LM)为祀标的结核分枝杆菌快速检测方法。本发明提供一种基于脂多糖与抗体的结核分枝杆菌糖芯片检测方法。发明所提供的检测方法是将具有菌种、菌株特异性的结核分枝杆菌细胞壁表面的抗原性物质脂多糖经过一系列处理制作成芯片，利用其与脂多糖与抗体的特异性结合来检测血清样品中是否含有脂多糖与抗体，并对该脂多糖与抗体进行鉴定，进而确定患者所携带的结核分枝杆菌的菌株种类，为后期的治疗提供方向。包括以下步骤I、结核分枝杆菌脂多糖的提取及银染显色鉴定2、脂多糖的纯化及鉴定3、定量糖成分分析
(I)蒽酮法测定脂多糖提取物中多糖的含量(2)鉴别有无蛋白污染4、脂多糖分子量鉴定5、ELISA分析结核分枝杆菌糖抗原的抗原性6、糖芯片的制作7、芯片检测 本发明具有以下优点(I)特异性好结核分枝杆菌细胞壁的脂多糖具有很高的抗原特异性，能同血清中抗脂多糖抗体特异结合；(2)灵敏度闻具有检测样品少，通量闻等特点；(3)价格低廉不需要昂贵复杂的设备或是特殊的试剂，检测时只需添加待测样品，为用户节省大量财力物力；(4)适用于大规模检测本产品使用方法简单快速，没有特定的设备、试剂要求，故可在任何环境使用，可以大规模推广。(5)时间短所需时间不超过2个小时。本发明应用该方法设计了一个在片基上放置分别从结核分枝杆菌标准株H37Rv株胞壁中提取的两种脂多糖类的糖芯片，可以快速检测由结核分枝杆菌引起的结核�。沟媒岷瞬〉募觳馐奔渌醵滩怀�2个小时，充分显示了该方法的优越性。因此该方法有可能发展成为应用于临床快速检测的新方法，为结核病的控制起到重要作用。
图I为糖芯片模式图，图中阴参为阴性质控点，阳参为阳性质控点，H37RV-LM为结核分枝杆菌标准株H37Rv的LM抗原，H37RV-LAM为结核分枝杆菌标准株H37Rv的LAM抗原，
每种抗原点样均重复三次。
具体实施例方式下面对本发明提供的具体实施方式
做详细说明。实施例II、分枝杆菌脂多糖的粗提及银染显色鉴定培养和收集结核分枝杆菌标准株H37Rv株(菌标准株H37Rv株购自中国药品生物制品鉴定所)，100°c水浴2小时灭活细菌。用氯仿甲醇水=10 10 3的溶剂中摇动2h，将菌体脂质重复脱脂3次，用铝箔纸包好，扎洞后于真空干燥箱中干燥(< 50°C)。将干燥后的细胞用干净的玻璃棒捣碎，并且用最少量的破碎缓冲液溶解细胞，进行超声破碎(500w，60S X 90S X 12次)，超声破碎后的溶液用Triton X-114和PBS的混合溶液重复提取三次，合并有机相，加入10倍体积95%乙醇过夜，收集沉淀。加入1/10体积的链霉蛋白酶(购自上海罗氏制药有限公司)，37°C孵育24h，再用蒸馏水透析24h，得到脂多糖粗品(样品含LAM，LM, PIMs等物质)。15%SDS_PAGE 结合银染显色鉴定(Shi L, et al. Mol Biol, 2009)。2、脂多糖的纯化及鉴定
选取Sephacryl S_200HiPrep 26/60 串联 Sephacryl S-IOOHiPrep 16/60 层析柱(GE Healthcare公司),连接高效液相色谱仪(Prominenece UFLC,日本岛津公司)。使用前用含IOmM Tris-HCl1O. 2M NaCl的柱缓冲液溶解样品，上柱。调整流速为lml/min，用自动收集器收集样品，120滴/管。15%SDS-PAGE结合银染的方法确定含脂多糖管，分别合并LAM和LM样品，得到纯化后LAM和LM。3、定量糖成分分析(I)蒽酮法测定脂多糖提取物中多糖的含量以无水葡萄糖标准品为多糖标准，制作浓度范围0 100ug/ml的标准曲线，检测620nm的吸光度值，直线回归计算样品中的多糖含量。(2)鉴别有无蛋白污染 a. SDS-PAGE电泳结合考马斯亮蓝染色检查有无明显条带出现b. BCA法测定蛋白含量4、脂多糖分子量鉴定用基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)(autoFLEX，Bruker公司)测定LAM、LM分子量，并确认分子量分别在17KDa和9. OKDa左右。5、应用ELISA方法评估结核分枝杆菌糖抗原的免疫原性(I)用包被液将抗原LAM和LM稀释到工作浓度，设置复孔，包被于96孔酶标板，每孔 100iil，4°C 过夜。(2)弃去包被液，洗涤液洗涤三次，每次三分钟，在吸水纸上甩干。(3)每孔加入300 ill封闭液，37°C温育I小时。(4)弃去封闭液，洗涤液洗涤三次，每次三分钟，在吸水纸上甩干。(5)设第一孔作为对照孔，每孔加入100 U I稀释的待检血清，37°C温育小时。(6)弃去血清，洗涤液洗涤三次，每次三分钟，在吸水纸上甩干。(7)每孔加入100 U I稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，37°C温育I小时。(8)弃去液体，洗涤液洗涤三次，每次三分钟，在吸水纸上甩干。(9)每孔加入100 ill新鲜配置的底物液，37°C温育10 30分钟，避光。(10)每孔加入50 ii I终止液终止反应，450nm检测OD值。(测定反应在加终止液后15分钟以内进行。)6、糖芯片的制作I)将固相载体用IM的环氧硅烷/甲苯溶液浸润30min，以形成环氧化物功能的单
层膜；2)将上述得到的固相载体在60°C下用a，co - 二胺-聚乙二醇(Mw=2000)(上海迈瑞尔化学技术有限公司)溶液处理，使固相载体上覆盖一层带伯氨基的聚乙二醇单层分子；3)将氨基化的固相载体置于含ImM叔丁氧羰基氨氧基乙酸、乙烯和N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸缓冲液处理2. 5h，洗涤后用2M HCl/醋酸处理2h，使伯氨基通过化学改性转换成羟胺；4)用自动点样仪将从上述菌体中提取的两种脂多糖LAM和LM溶液依次点加到固相载体表面(见附图1)，利用脂多糖分子还原端的醛基与活泼的羟胺进行肟化反应从而通过共价键将脂多糖固定在固相载体上。5)于25-6CTC温育12小时得糖芯片。7.样品的检测I)将待检的血清样品直接加在糖芯片上；抗体通过与脂多糖的特异性识别结合到糖芯片上，形成特定脂多糖与抗体复合物。2) 37°C孵育 30 分钟。3)用IX洗涤缓冲液清洗，去除糖芯片上的非特异性结合物质，以消除干扰。4)糖芯片上加入酶标抗体工作液，37°C温育30分钟。
5)用IX洗涤缓冲液清洗，去除糖芯片上的非特异性结合物质，以消除干扰。6)加入显色剂A、B液(见表I下注2、注3)混匀，置37°C避光显色lOmin。7)加入终止液，判断结果。根据反应的显色结果判断该待检患者血清样品是否为结核分枝杆菌感染。无论LAM或LM处有蓝色斑点出现，均可判断为结核菌感染；反之，两点处均不显色，判定为阴性。8、糖芯片试剂盒组成见表I。表I糖芯片检测试剂盒组成
检测试剂规格数量
糖芯片(结合糖抗原的固相载体)I20
溶液I (20 X洗涤缓冲液)20ml/瓶 I
溶液2 (血清稀释液)20ml/瓶 I
溶液3 (HRP酶标二抗)5ml/瓶 I
溶液4 (显色液A、显色液B)IOml/瓶 Wl
溶液5 (终止液)20ml/瓶 I注I :每盒可检测20人；保存条件4°C保存。溶液I (20X 洗涤缓冲液)20XPBST (pH 7. 2) 500ml NaCl 80g, KCl 2g,Na2HPO4H. 4g, KH2PO4 4. 8g, Tween-20 40ml，加水定容至 500ml。溶液2 (血清稀释液):牛血清白蛋白(BSA)O. lg，加IX洗涤缓冲液定容至100ml。溶液3 (HRP酶标二抗)辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(R&D公司)。溶液4 (显色液A、显色液B): IOOml显色A液的配制乙酸钠(C2H3NaO2)2. 270g、柠檬酸(C6H8O7 *H20)0. 320g、30%H20260ul pH 为 5. 45 ； IOOml 显色 B 液的配制柠檬酸 0. 036g、EDTA-Na2O. 172g、甘油 10. Oml、DMSO I. 5ml、TMB 0. 04g溶液5 (终止液)2M H2SO4实施例2利用试剂盒检验临床结核病的诊断效果，同步与国际上常用的两种结核病抗原ESAT6和CFPlO进行对比。I、标本
分枝杆菌临床病人血清或血浆标本90例(武汉医疗救治中心)，分两组实验组活动性结核病57例，所有患者均经细菌学、影像学和临床症状动态观察而确诊。对照组为非结核病患者及正常健康人,共33例，包括肺炎、慢性支气管肺炎、哮喘、肺癌及正常健康体检者。非结核病患者均依各种检查方法检查和临床治疗的效果而确诊。2、方法用本发明专利试剂盒对上述实验组和对照组的血清检测。同步以自制的结核分枝杆菌特异性抗原ESAT6和CFPlO进行对照。 备注自制重组抗原ESAT6和CFPlO蛋白以结核分枝杆菌标准株H37Rv株基因组DNA为模板，用依照酶切位点检索和引物设计原则以及应用软件Primer 5.0设计的根据蛋白的特异性引物按常规基因工程方法构建pET21a_esat6或Pet32a_cfpl0重组质粒，转入大肠杆菌BL21 (DE3)physS表达菌株，ImM IPTG 37°C诱导3h即可获得大量的重组蛋白，镍柱亲和纯化其纯度达90%以上，将重组蛋白用20mM Tris-HCl, pH 8. 0透析后超滤浓缩，BCA法检测蛋白浓度，按Img/管分装，冻干保存。糖芯片检测结果判断无论LAM或LM处有蓝色斑点出现，可判断为阳性结果即结核分枝菌感染；反之，两点处均不显色，判定为阴性。3、结果表2基于LAM、LM抗原的糖芯片和ESAT-6、CFP-10抗原分别对健康对照血清和结核病人血清IgG反应结果(病例数90)
权利要求
1.一种用于结核病快速诊断的糖芯片，其包括固相载体，其特征在于，所述糖芯片还包括结核分枝杆菌脂多糖类抗原探针，所述结核分枝杆菌脂多糖类抗原探针通过肟化反应被固定于所述固相载体上。
2.如权利要求I所述的糖芯片，其特征在于，所述结核分枝杆菌脂多糖提取自结核分枝杆菌H37Rv菌株。
3.如权利要求I所述的糖芯片，其特征在于，所述结核分枝杆菌脂多糖为脂多糖LAM和LM。
4.如权利要求I所述的糖芯片，其特征在于，所述固相载体是经过化学改性的硝酸纤维膜或微孔板。
5.如权利要求4所述的糖芯片，其特征在于，所述固相载体的化学改性是根据如下步骤进行 (1)将固相载体用环氧硅烷/甲苯溶液浸润，形成环氧化物功能的单层膜； (2)将上述得到的固相载体用a，Co-二胺-聚乙二醇(Mw=2000)溶液处理，使固相载体上覆盖一层带伯氨基的聚乙二醇单层分子； (3)将氨基化的固相载体置于叔丁氧羰基氨氧基乙酸、乙烯和N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸缓冲液处理，洗涤后用HCl/醋酸处理，使伯氨基通过化学改性转换成羟胺。
6.一种制备权利要求I至5任一项所述的糖芯片的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)提取、纯化结核分枝杆菌细胞壁脂多糖类抗原； (2)利用肟化反应的方法将脂多糖类抗原探针固定于经过化学改性的固相载体，制作成糖芯片。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述固相载体的化学改性是通过以下步骤进行 (1)将固相载体用环氧硅烷/甲苯溶液浸润，以形成环氧化物功能的单层膜； (2)将上述得到的固相载体用a，Co-二胺-聚乙二醇(Mw=2000)溶液处理，使固相载体上覆盖一层带伯氨基的聚乙二醇单层分子； (3)将氨基化的固相载体置于叔丁氧羰基氨氧基乙酸、乙烯和N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸缓冲液处理，洗涤后用HCl/醋酸处理，使伯氨基通过化学改性转换成羟胺。
8.一种结核病检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求I至5任一项所述的糖芯片。
全文摘要
本发明涉及一种用于结核病快速诊断的糖芯片，其包括固相载体，其特征在于，所述糖芯片还包括结核分枝杆菌脂多糖类抗原探针，所述结核分枝杆菌脂多糖类抗原探针通过肟化反应被固定于所述固相载体上。本发明还涉及上述糖芯片的制备方法以及采用其的结核病诊断试剂盒。本发明通过分离提取及纯化结核分枝杆菌细胞壁中脂多糖，利用肟化反应的方法将LAM和LM糖探针固定于硝酸纤维膜或微孔板等固相载体，制作成糖芯片，通过与血清中的相应抗体结合及酶联显色反应，从而判断结核分枝杆菌的感染与否。本发明使用的具有种属特异性的细胞壁脂多糖类抗原只能与特异的结核抗体结合，从而使结核病的检测特异性和敏感性大大提高。
文档编号G01N33/543GK102707053SQ201210185439
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者余晓丽, 孙战强, 张舒林 申请人:上海交通大学
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