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专利名称：用于制备组织芯片的点样仪的制作方法
技术领域：
本发明属于高密度组织芯片制作技术领域，尤其是高密度组织芯片点样仪的制备技术。
背景技术：
疾病的诊断和治疗均与组织细胞的基因及其相关的分子变化密切相关，这一分子变化带有普遍性时才具有临床价值。实际上，对于一个分子标志物的评价需要数百至数千个不同发展阶段的组织标本。然而传统的病理学方法以及建立在其基础之上的免疫组织化学，原位杂交和原位PCR等所检测的组织标本在大多数情况下都是单个的、散在的、偶然的、孤立的。若要对一个分子标志进行正确的评价则需要花费很多的人力、物力和财力，而且是一个十分漫长和复杂的过程。为了解决这一难题，许多科学家进行了大量的研究。1998年美国国家卫生研究院NIH的Kononen〔Kononen J，Bubendorf L等，《用于肿瘤样品高通量分子表征的组织微检测》(Tissue microarrays for high-throughputmolecular profiling of tumor specimens)，Nat Med.，1998年7月；4(7)844-7〕报道了一种组织微阵技术，并成为生物芯片研究领域新的热点。运用这一技术，Schraml等〔Schraml P，Kononen J，Bubendorf L等，《用于许多不同肿瘤类型的基因扩增研究的组织微检测》(Tissue microarrays for gene amplification surveys in many differenttumor types)，Clin Cancer Res，1999；5(5)1966-1975〕在一周内检测了17种肿瘤397例组织样本中CCND1、CMYC和ERBB2三种癌基因的表达；Richter等〔RichterJ，Wagner U，Kononen J等，《膀胱癌中cyclin E基因扩增和超表达的高通量组织微检测分析》(High-throughout tissue microarray analysis ofcyclin E gene amplification andoverexprssion in urinary bladder cancer)，Am Society Invest Pathol，2000，157(3)787-794〕在两周内检测了1842例膀胱癌患者中2317份样本中cyclin E基因和CCNE的表达。显而易见，这一方法大大提高了检测的效率、加速了研究的进展、缩短了研究的周期、同时也节约了研究经费。
组织芯片技术是将大量组织标本集成并固定到特殊处理的玻片上然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子在特定组织中数量、分布、表达的信息。组织芯片的制备需要各种不同疾病组织以及相关临床资料和病理资料，技术的发展受资源限制较大，所以较之DNA芯片、蛋白芯片等生物芯片技术，发展缓慢。但DNA芯片和组织芯片技术是相辅相成的。DNA芯片的作用可概括为使生物信息的高度集约化，如可检测成千上万种基因在一个肿瘤组织中的表达状况，而组织芯片的作用可概括为使生物信息的高度放大化，如可检测近千种肿瘤中一种或一组基因的表达状况。这种检测可在一张玻片上完成，其高效性，科学性和经济性是传统方法所无法比拟的。
自从组织芯片技术1998年诞生以来，近年来国内外多篇专利和文章都有报道，技术不断进步，新型芯片不断涌现。
现有组织芯片技术主要采取的技术方案是采用机械化制备仪器或自动化制备仪器从供体石蜡组织标本中取出圆柱状组织核心(组织来源于各种恶性肿瘤、各种良性肿瘤、各种癌前突变、各种非肿瘤性疾病、各种正常组织、各种胚胎组织、各种血液和造血组织、各总细胞提取物、各种活检组织或细胞、各种胸水、腹水、痰液、渗出液中的细胞、各种体外培养的组织细胞及细胞系、各种细菌及酵母菌、各种转基因动物组织或各种转基因器官等)，将每一个圆柱状组织核心按设计顺序放置在另一块空白蜡块(受体块)中，形成组织微阵列蜡块，从这个组织微阵列蜡块上可获得大量组织微阵列切片，将切片放置在硅化和胶化的玻片上即形成组织微阵列生物芯片，每一个组织微阵列生物芯片上包括大量有序的各种不同的供体石蜡组织标本。
机械化组织芯片点样技术发展到今天，已有多家公司如ALPHELYS、CHEMICON、Genxpress、Alpha Metrix等开发出多种不同的点样仪器。我们在研究这些点样仪优缺点的基础上，率先采用96孔板点样法，在磁性固定平面制作凹槽进行样品固定，定位装置前置等技术，提高了点样的速度、准确性，具有很高的使用价值。

发明内容
本发明涉及一种组织芯片点样仪，该点样仪包括固定架10、固定板3、固定装置1、容器2、冲压装置5、导向盘6、定位板7、冲压底座8、受体针11和供体针12、水平计量仪4、垂直计量仪13等装置，其中，该固定装置1略大于所述容器2，且其上具有凹槽。
本发明还涉及一种组织芯片点样仪，该点样仪包括固定架10、固定板3、固定装置1、容器2、冲压装置5、导向盘6、定位板7、冲压底座8、受体针11和供体针12、水平计量仪4、垂直计量仪13等装置，其中，所述水平计量仪4被前置，从而有利于技术人员进行操作。
本发明还涉及一种组织芯片点样仪，该点样仪包括固定架10、固定板3、固定装置1、容器2、冲压装置5、导向盘6、定位板7、冲压底座8、受体针11和供体针12、水平计量仪4、垂直计量仪13等装置，其中，所述固定装置1略大于所述容器2，且其上具有凹槽，所述水平计量仪4被前置。
本发明还涉及采用本发明的组织芯片点样仪制造96孔板，并进行96孔板点样。


图1是本发明优选的组织芯片点样仪的示意图。
图2是组织芯片点样针示意图。
图3是组织芯片点样仪定位板示意图。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明作详细的描述。本发明并不受到这些具体实施方式
的限制，任何不偏离本发明精神的修改和变动都在本发明的保护范围之内。
图1示出了本发明优选的组织芯片点样仪的示意图。图中，在固定架10上放置了固定装置1、固定板3。固定装置1为上面有凹槽的磁性固定平台，它连着前置的水平计量仪4，其上放置了容器2。固定装置1的凹槽可任选地为各种合适的形状，例如为方形、圆形等等。凹槽的宽度可约为3-10mm，一般约为5mm。凹槽的深度可约为3-5mm，通常约为3mm。各凹槽之间的相对位置并不限定，但较佳是各凹槽之间的距离相同。对相邻的凹槽其相邻的边之间的距离并无具体限制，但是，该距离一般约为3-10mm，通常为5mm左右。同传统的装置相比，在固定装置上划有凹槽可减少磁性材料的使用量，从而使磁力减少，在保证固定质量的同时，更便于移动和取放容器2。此外，取样点样操作也没有受到影响，反而由于容器2的取放更易操作、其在该固定装置1上的安放更准确而大大提高了点样和取样的准确性。凹槽条孔的位置也对容器2起到辅助定位作用。
容器2略小于该固定装置1。通常，所述“略小于”或“略大于”在本文中指所述容器2的四边与所述固定装置1的四边的距离大约为1-5cm，通常为约1-3cm，较佳约为2cm。采用这样的结构，不仅大大节省了用于制备该固定装置1的材料，从而大大降低了生产成本，而且容器2的取放操作也大为容易。此外，固定装置1所占用的固定架的面积缩小。
图1中，水平计量仪4被前置。前置的水平计量仪4也给技术人员实施操作带来极大的方便，如定位操作时不再需要一只手臂绕过整台仪器从背面进行定位操作，定位操作更简单，也减少了对样品的污染；同时，前置后可以用肉眼检测容器2在取样和点样时定位是否存在偏移，提高了点样的速度、准确性。
供体块放置在容器2的位置中。冲压装置5安装在固定板3上，包括一个垂直向上的导向盘6和水平方向上的定位板7，定位板7安装在水平计量仪4上，这样可以精确的进行微米水平的测量和调节。垂直导向盘6，提供了精确的导向平面，在平面上冲压底座8可沿着伸缩轨道滑动。伸缩轨道靠弹性绷带协助冲压底座8沿轨道复位，受体针11和供体针12安装在底座8上，可沿平板3向容器2伸出或缩回，受体针11和供体针12的运动幅度通过垂直计量仪13的旋进和旋出调节，内孔延至底座8上，开口位于唇状缘9上。
通常，制备组织芯片所需要的材料有(1)常规病理学方法制备的包括人和动物所有部位不同病灶以及不同发育时期的组织蜡块或细胞蜡块(简称供体块)，其中来源于人或其他动物的所有供体组织标本均伴有相应的临床信息，包括年龄、性别、临床症状、病变部位以及病理诊断结果包括肿瘤或其他疾病的分期、分级、分化、细胞起源、组织类型及其免疫组织化学染色结果等；(2)用于接受从供体块获取的微小圆柱状组织或细胞的空白蜡块(简称受体块)；(3)用于诊断和定位来源于同一供体块的苏木精-伊红(HE)染色切片；(4)普通玻片和用特殊粘胶处理的硅化玻片、相应的盖玻片和封片胶；(5)特殊处理的胶带；(6)相应的脱胶及脱蜡剂；(7)点样仪。
经过HE染色或其他方法染色的组织切片可以从供体块得到，并放置到玻片上，进行诊断并对所需要的病变部位或其他所要研究的部位进行不同颜色的标记，如黑色表示癌组织、兰色表示癌旁组织、黄色表示肿瘤转移组织、绿色表示正常组织等等。如图3所示玻片被具有关节结构的臂架26抓持并置于供体上，臂架26上的夹钳24抓持着透明的载玻片23的边缘，臂架24可以在关节25处改变角度，第一位置将载玻片23固定于容器2上，第二位置使载玻片23水平方向移开以显露供体针。结合图1，具体操作如下容器2放置在平台1上并使容器2固定在指定的位置，供体块中的组织已经过石蜡包埋常规切片(3μm-5μm)并将样品固定于玻片上进行HE染色，然后放置于载玻片23上，并定位于供体块上，玻片可以在载玻片23上移动，直至样品16和供体块中的组织样品15完全重合，将臂架26固定于第一位置，按病理诊断所标记的选定病变部位17(如当组织样品为乳腺癌时，病变部位17就是具有乳腺癌特征结构的组织)，其下面的供体块有相同结构的组织标本同时被定位。如图4所示，定位板1可以在千分尺和操作杆控制下在X-Y轴方向移动。将供体针对供体块中选定的组织部位，移开载玻片23，将供体针打入供体块中选定的组织部位，冲压装置5沿着轨道向下移动直至平板7，供体针向下挖取组织块中的组织，回缩后即可获得组织样品，用探针伸入开口即可得到圆柱形的组织样品。将其放入形状和大小完全相同的受体块中，受体块可在取样之前准备，操作方法是将空白蜡块放在容器2中，用受体针打出圆柱形孔，孔的阵列以设计好的进行排列，其中优选96孔板样设计。采用96孔板，可与目前使用的排枪相适应，一次给多个孔加样，从而大大提高了效率。
获得常规空白阵列蜡块排列的方法是首先将受体针放置在起始位置(如空白蜡块左上角)，用受体针打孔，再在X-Y轴方向移动冲压装置或受体块，重复以上的步骤，就可制成不同矩阵的空白阵列(例如96孔板)蜡块(受体块)。图3中的空白受体块孔径为0.6mm，孔与孔的中心距离为0.7mm，相邻孔距为0.1mm。取样时，在一般情况下，圆柱形组织挖取高度为2-6mm，半径为0.3-1.0mm。从供体块的标志区域取样，并排列至新的空白受体块，取样半径可以在0.1-2.0mm之间任意调节，一般情况下取样半径在0.3-1.0mm之间较为合适，不但可供分析之用，同时不至于对原供体块中的组织结构造成损坏。
已经点好样的组织蜡块放入37℃温箱15分钟，以增加圆柱形组织样本与空白蜡块之间的黏性和微阵列组织蜡块的柔韧性，并使其表面光滑平整，再用黏性膜覆盖，当黏性膜放置好以后，沿总轴方向切取4-8μm厚的组织微阵列切片，放置于玻片(需用特殊粘胶处理表面)上，平整之后除去黏性膜，玻片的一端用于识别和标记方向。
已经点样、孵育后的受体块经过切片、固定、脱胶、脱蜡和HE染色或其他染色，用于各种不同的生物学研究、定性和医学诊断等。
权利要求
1.一种组织芯片点样仪，该点样仪包括固定架(10)、固定板(3)、固定装置(1)、容器(2)、冲压装置(5)、导向盘(6)、定位板(7)、冲压底座(8)、受体针(11)和供体针(12)、水平计量仪(4)、垂直计量仪(13)，其特征在于，所述固定装置(1)的四边与所述容器(2)的四边的距离为1-5cm，该固定装置(1)上具有凹槽。
2.如权利要求1所述的组织芯片点样仪，其特征在于，所述水平计量仪(4)被前置。
3.如权利要求1所述的组织芯片点样仪，其特征在于，所述距离为1-3cm。
4.如权利要求3所述的组织芯片点样仪，其特征在于，所述距离为2cm。
5.如权利要求1所述的组织芯片点样仪，其特征在于，所述凹槽宽3-10mm、深3-5mm。
6.一种组织芯片点样仪，该点样仪包括固定架(10)、固定板(3)、固定装置(1)、容器(2)、冲压装置(5)、导向盘(6)、定位板(7)、冲压底座(8)、受体针(11)和供体针(12)、水平计量仪(4)、垂直计量仪(13)，其特征在于，所述水平计量仪(4)被前置。
7.权利要求1或6所述的组织芯片点样仪的用途，其特征在于，用于制备96孔板样芯片。
全文摘要
本发明公开了一种高密度组织芯片的制备装置，具体是高密度组织芯片制作中的核心装置——高密度芯片点样仪的设计和制作，及用其制备高密度组织芯片的技术，点样仪包括固定架、固定板、定位架、受体针和供体针、定位装置等。本装置独特的设计保证了取样和点样的准确性，提高了点样速度和芯片密度。
文档编号G01N35/10GK1657945SQ20041001640
公开日2005年8月24日 申请日期2004年2月18日 优先权日2004年2月18日
发明者倪健, 焦炳华, 杨子义, 罗鹏, 吕军 申请人:上海富纯中南生物技术有限公司