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专利名称：：一种哺乳动物通用的免疫避孕靶标及其特异性抗体的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明涉及一种哺乳动物通用的免疫避孕靶标及其特异性抗体。我国作为发展中的人口大国，人口数量和质量的控制等生殖健康是关系国计民生的大事。在过去的几十年中，还没有出现可与女性口服避孕药相比的男用药品。尽管女用避孕药减缓了人口的增长，但其副作用及远期安全性还有待改进。许多妇女不愿采用荷尔蒙药物，生殖道内置器械和埋植物，因此在方法可能的条件下，男性将为减缓人口增长承担更多的责任和风险。近年以来，尽管在男性避孕方面开展了一些研究，除了传统的体外排精，避孕套和结扎手术，还没有更加通用的方法出现。最近通过荷尔蒙可逆地抑制男性精子生成的避孕方法被认为可在预期(24个月)内完全恢复精子数量，但荷尔蒙对包括心血管和前列腺等的副作用仍值得关注。|3-防御素(beta-defensin)家族是近年来发现的参与天然免疫和其它生理过程及疾病的具有多种生物学功能的多肽家族。作为抗菌肽，P-防御素具有与传统抗生素不同的广谱抗菌机理。防御素可以结合到细菌细胞膜，造成膜渗漏，导致细菌死亡。由于细菌细胞膜的复杂性，相对传统抗生物而言，细菌不容易进化出对防御素的抗性，因而在利用防御素对付抗生素耐药菌方面得到了大量的关注。最近有报道(http:〃technology.newscientist.com/channel/tech/dnl3924_manmade_defensin_rips_resistant_bacteria-即art.htmlfeedld=online-news_rss20)称第一个基于防御素的人造抗生素药物已经进入了临床研究。显然，这对于解决越来越严重的抗生素耐药菌和医院感染问题是个极好的消息，也使本发明人认识到新型天然防御素的基础研究对于新型抗生素类药物研究|3-防御素也是联系天然免疫和适应性免疫的枢纽，与趋化因子(chemokines)具有功能上的重叠，起到了调节天然免疫和适应性免疫的作用。此外，P-防御素还具有多种生物学功能，包括参与肿瘤的血管生成、抗艾滋病毒、肿瘤抑制和抗白血病，以及参与精子的运动起始和成熟、保护、获能和抗免疫识别等等。已有研究发现，小鼠P-防御素-6的高表达，可引起肌肉退行性病变，这就把机体的天然免疫系统和退行性疾病病理学研究联系了起来；而狗P_防御素_103(CBD103)可与Mclr(melanocortinrec印tors)高亲和地结合，与动物毛色的确定有关。特别是，已有研究证实，人P-防御素-l(HBDl)的低表达则与口腔鳞状细胞癌、肾癌和前列腺癌的发生、发展过程有关。同时，令人感兴趣的是，附睾组织中有丰富的P-防御素，而临床上也极少发现附睾原发性的腺癌发生，而且转移到附睾的癌也极为罕见，提示其不仅具有抗菌作用，也可能有抗恶性肿瘤作用。在大鼠、小鼠、犬、大猩猩和人类，迄今分别发现了43、52、43、37和39个P_防御素基因，其中绝大多数都是功能未知的基因。几乎所有的P_防御素都优先在雄性生殖系统表达，尤其是在睾丸和附睾组织中表达，只有较少数量的P-防御素在其它部位表达。附
背景技术：
：意义重大。睾组织中包含了几乎所有的P-防御素家族成员，并呈现多样化的e-防御素区段特异的表达模式，且大鼠和小鼠的13-防御素家族附睾表达模式具有一定的保守性。由于附睾是雄性生殖系统一个重要的附属性器官，它与精子成熟、储存和保护等有密切的关系，本发明人早先根据e-防御素在体内的表达特征，可以将P-防御素分为三类即雄性生殖系统特异表达的P-防御素、附睾特异表达的e-防御素和非特异广泛表达的P-防御素。Binlb(又被称作spagll)基因是本发明人在大鼠附睾中克隆到的一个附睾特异表达的天然抗菌肽(LiP，C.H.，HeB，SoSC，ChungYW，ShangQ，ZhangYD，ZhangYL.，Anantimicrobialpeptidegenefoundinthemaler印roductivesystemofrats.Science,2001.291(5509):p.1783-5.)，论文发表在Science杂志上并获得了专利(中国专利ZL01105283.X，美国专利US6，887，981，B2)。后来的研究又发现Binb除具有抗菌肽的功能以外，还与起始精子运动相关，论文发表在NatureCellBiology(ZhouCX，ZhangYL，XiaoLetal.，An印ididymis—specificbeta—defensinisimportantfortheinitiationofspermmaturation.NatCellBiol.，2004.6(5):p.458—64.)，其能与附睾头部的精子结合，通过L-型钙通道启动精子的运动，抑制binb表达可以使精子失去起始运动的能力，因而binb可以作为潜在的抗生殖道感染和男性避孕的靶标。因此，本领域还有必要基于此进行进一步的研究以期开发出有应用价值的药物。
发明内容本发明的目的在于提供一种哺乳动物通用的免疫避孕靶标及其特异性抗体。在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，所述的多肽具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列；并且，所述的多肽来源于哺乳动物Binlb(或称为SPAG11)蛋白，且由7_30个(较佳地7-20个；更佳地7-15个)氨基酸组成。在另一优选例中，所述的多肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在本发明的第二方面，提供所述的多肽的用途，用于制备特异性结合Binlb蛋白的抗体(包括单克隆抗体或多克隆抗体)。在本发明的第三方面，提供一种特异性结合Binlb蛋白的抗体，所述的抗体特异性识别Binlb蛋白上具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的位点。在另一优选例中，所述的抗体由保藏号为CCTCC-C200847(rBinlblOA5，简称10A5)的杂交瘤细胞株产生。在本发明的第四方面，提供所述的抗体的用途，用于制备抑制哺乳动物精子运动的组合物。在另一优选例中，所述的组合物是避孕药。在另一优选例中，所述的哺乳动物选自(但不限于)人、鼠、狗、猫、牛、猪、蝙蝠、猴、树駒、马、大象、松鼠、豚鼠、犰狳。在本发明的第五方面，提供一种用于抑制哺乳动物精子运动的组合物，所述的组合物包括(1)有效量的所述的抗体；禾口(2)药学上可接受的载体。在本发明的第六方面，提供一种杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C200847。在本发明的第七方面，提供一种所述的抗体的用途，用于制备定性或定量检测样品中Binlb蛋白存在情况的试剂。在本发明的第八方面，提供一种非治疗目的地抑制哺乳动物精子运动(如非治疗目的的避孕)的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的所述的抗体。在另一优选例中，所述的给予为外用涂抹。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1.免疫后的11只小鼠的抗体滴度水平用间接ELISA检测。纵坐标为滴度，横坐标为免疫小鼠的编号。只有一只小鼠(9号)到达较高滴度水平，用来进行细胞融合。图2.用WesternBlot(左图)和DotBlot(右图)进行单克隆抗体的特异性检验。所用抗原为重组表达的双拷贝串联蛋白rBD14、rBD15、rBD42、rBD1、mBD15、mBD30;rBD14单和rBD15单分别为rBD14、rBD15的单体活性重组多肽。每泳道上样量在2ng的蛋白水平，进行Westernblot(2ng/孔)，ECL显色。把蛋白量提高到1Pg，进行Dotblot(liig/dot)试验，单克隆抗体特异的识别rBinlb。所用单抗为10B4，一抗1:5000稀释，二抗山羊抗鼠IgG-HRP1:1000稀释。图3.单抗10B4为例，Westernblot结果表明单抗特异识别附睾头部精子上的rBinlb，而不识别精子上其它蛋白。rC即Sperm，rCorSperm，rCauSperm分别为等量的附睾头部、体部和尾部精子蛋白。图4.附睾头部、体部和尾部精子免疫荧光实验表明单抗比多抗血清更特异地识别附睾头部精子上的rbinlb。单克隆抗体10B4只与附睾头部的精子rBinlb有反应，而不与体部和尾部的精子蛋白反应，与rBinlb在附睾头部特异表达是一致的。图5.粗筛抗原表位融合蛋白的重组表达和多抗血清的Westernblot鉴定。小鼠多抗血清与粗筛抗原表位Segl-Seg6表达菌裂解物进行westernblot，ECL显色。多抗血清与seg2、3、4、5片段有免疫反应，表明抗原表位集中在这几个片段内。C为载体对照，pre为诱导表达前的菌液，po为诱导后的菌液。图6.四个单克隆抗体(3A1(图C)、10A5(图A)、10B4(图B)、14F6(图D))与粗筛表位序列1-6进行westernblot，ECL显色。四个单克隆抗体(3A1，10A5，10B4，14F6)分别识别表位肽seg4&5、5、3、4&5。pre为诱导表达前的菌液，po为诱导后的菌液。pre为诱导表达前的菌液，po为诱导后的菌液，Control为载体对照。图7.单克隆抗体10A5识别精细8肽表位的WesternBlot结果及8肽表位序列比对表明单克隆抗体10A5识别多肽表位DPWNRCC和SDPWNRCC，pre为诱导表达前的菌液，po为诱导后的菌液，C为空白载体对照。图8.单克隆抗体3A1识别精细8肽表位的WesternBlot结果及8肽表位序列比对，结果3A1可识别SDPWNRCC和DPWNRCCV。pre为诱导表达前的菌液，po为诱导后的菌液。图9.单克抗体10B4识别精细8肽表位的WesternBlot结果及8肽表位序列比对，表明单克隆抗体10B4识别表位序列RSGERKGD;pre为诱导表达前的菌液，post为诱导后的菌液。图10.哺乳动物的spagll基因编码的多肽成熟肽的序列比对。框图表示单抗识别的共有多肽序列。左列为各哺乳类动物的縮写。Hum为人类、Mou为小鼠、Rat为大鼠、Dog为狗、Cat为猫、Bul1为牛、Pig为猪、Bat为蝙蝠、Mac为猴、Shr为树駒、Equ为马、Ele为大象、Sqr为松鼠、GuiP为豚鼠、Arm为犰狳。单抗10A5和单抗3A1识别的表位序列SDPWNRCC在哺乳动物的spagll基因编码的多肽(包括人类)中保守地存在。单抗10B4识别的表位序列只在大鼠和小鼠spagll基因编码的多肽中保守地存在。具体实施例方式本发明人经过广泛地研究，首次定位到了Binlb蛋白序列上一特定的抗原性表位，所述的抗原性表位在哺乳动物Binlb蛋白中保守地存在。因此，利用含有该表位的多肽(本发明中还称为短肽)，可以制备出特异性抗Binlb蛋白的抗体，该抗体可识别多种哺乳动物体内的Binlb蛋白。并且，本发明人还筛选到了特异性结合该特定的抗原表位的单克隆抗体，所述的抗体结合特异性好，与其它蛋白没有交叉反应，可非常显著地抑制哺乳动物的精子活动，是一种哺乳动物通用型的抗Binlb蛋白抗体。如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，"SPAGll"蛋白、"Binlb"蛋白可互换使用，均是指存在于哺乳动物体内的、具有抗菌功能的一种蛋白，所述的蛋白与中国专利ZL01105283.X中所述的Binlb蛋白序列具有60%以上的同源性，较佳地具有70%以上的同源性，更佳地具有80%以上(如85%或90%或95%)的同源性。根据所提供的蛋白，可以方便地得知蛋白对于的基因序列。如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......构成"、"基本上由......构成"、和"由......构成"；"主要由......构成"、"基本上由......构成"和"由......构成"属于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。如本文所用，抗体的"特异性"是指抗体能结合于哺乳动物Binlb蛋白或片段。特别指那些能与哺乳动物Binlb蛋白结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中，所述的"哺乳动物"是任何具有Binlb蛋白(或称为SPAG11蛋白)，且其Binlb蛋白中具有SEQIDN0:1或SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的哺乳动物。例如，所述的哺乳动物选自(但不限于)人、鼠、狗、猫、牛、猪、蝙蝠、猴、树駒、马、大象、松鼠、豚鼠、犰狳。抗原表位已知Binlb蛋白能与附睾头部的精子结合，通过L-型钙通道启动精子的运动，用抗体或RNAi等手段抑制Binlb表达可以使精子失去起始运动的能力(Zhou，C.X.等，An印ididymis—specificbeta—defensinisimportantfortheinitiationofspermmaturation.NatCellBiol，2004.6(5):p.458-64.)，因而Binlb可以作为抗生殖道感染和男性避孕的靶标。Binlb的表达是附睾特异的，有别于其它P-防御素。基于以上论述，可以利用合适的抗Binlb抗体来与Binlb蛋白结合，抑制其与精子的结合，从而达到抑制精子运动的目的。—种抗原通�：�有多个抗原表位(抗原决定簇)，因此，针对同一个抗原可以获得不止一个抗体，这些抗体对抗原的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。针对同一个抗原，本领域人员需要进行大量的反复比较、筛选和鉴定，才能找到适合于特异性结合的单抗。而找到抗原上合适的抗原表位，针对性地制备抗体，则可大大简化该过程。此外，在基于一些抗原蛋白制备抗体的过程中，由于全长蛋白一般序列较长，制备特异性抗体的效率并不高，获得的抗体经常存在结合能力差、结合位点不确定等问题。因此需要针对一些抗原蛋白找到其特异性的抗原表位(抗原决定簇)，以含有该抗原表位的短肽来制备特异性抗体，以获得结合能力良好，且结合位点确定的抗体。本发明通过制备特异性抗Binlb蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体，并利用抗原表位扫描方法，进行抗原表位扫描分析，确认了各个单抗识别的抗原表位。从中发现了一个抗原表位序列是哺乳动物SPAGll(Binlb)的共有多肽序列，可以作为哺乳动通用的免疫避孕靶标，具有潜在的应用价值。基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种分离的多肽，所述的多肽具有SEQIDN0:1或SEQIDN0:2所示的氨基酸序列；并且，所述的多肽来源于Binlb蛋白，且由7-30个氨基酸组成；较佳地由7-20个氨基酸组成；更佳地由7-15个(如10个)氨基酸组成。—旦获得了所述多肽的序列，就可以用重组法来大批量地获得该多肽。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，对比本发明的短肽而言，优选的是采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列，人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的多肽。本发明还提供了所述的多肽的用途，其作为Binlb蛋白的一种有效的抗原性的片段，用于制备特异性结合Binlb蛋白的抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体。所述的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明的多肽可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达本发明的多肽的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256;495，1975;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976;Ha騰rling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.，1981)。多克隆抗体的生产可用本发明的多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。抗体基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种特异性结合Binlb蛋白的抗体，所述的抗体特异性识别Binlb蛋白上具有SEQIDNO:1(即DPWNRCC)，或SEQIDN0:2(即SDPWNRCC)所示的氨基酸序列的位点。所述的抗体是一种哺乳动物通用型的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段，抗体重链，抗体轻链，遗传工程改造的单链Fv分子，或嵌合抗体(如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体)。7本发明中的抗体可用于通过与Binlb蛋白相结合而抑制Binlb蛋白与哺乳动物精子的相互作用，抑制精子运动，从而可达到哺乳动物避孕的效果。本发明的抗体还可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的Binlb蛋白存在情况或存在的量。作为本发明的优选方式，所述的抗体是一种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC-C200847的杂交瘤细胞株rBinlblOA5(也可称为10A5)产生的。该单克隆抗体结合能力强，与其它蛋白不发生交叉反应，对于精子活动的抑制效果非�：谩！�种杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C200847，所述的杂交瘤细胞株可用于生长本发明的单克隆抗体。在获得了所述的杂交瘤细胞后，可以利用该杂交瘤细胞大量地生产单克隆抗体，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法所制备，所述方法包括步骤[oose](1)提供佐剂预处理的动物(如小鼠)；(2)在动物腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。从腹水中分离单克隆抗体也是已知的。作为一种方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用ProteinG预装层析柱纯化，获得高纯度的单克隆抗体。此外，也可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。本发明还提供了所述的抗体的用途，用于制备检测样品中是否存在Binlb蛋白。在获得了本发明的抗体后，本领域人员可通过多种途径来灵敏地检测样品中Binlb蛋白的存在与否以及存在浓度，采用的技术可以是免疫学领域中常用的技术。组合物本发明还提供了一种抑制哺乳动物精子运动的组合物，它含有有效量(如0.0001wt%-50wt%;更佳的0.001wt%-30wt%)的上述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。"有效量"或"有效剂量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。"药学上可接受的"的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如泰性、剌激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中或凝胶介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)局部给药、静脉内、或腹膜内。优选的，所述的单克隆抗体被用于局部给药，如附睾内给药，或局部用于雄性哺乳动物生殖器部位，或用于雌性哺乳动物生殖道部位，以及其它精子储藏或精子活动的部位。本发明的组合物含有安全有效量的本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成液体剂型，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备；考虑外用的目的，优选的剂型是凝胶剂、搽剂、膏剂、栓剂等。药物组合物如溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约l微克-约5毫克。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明还提供了一种抑制哺乳动物精子运动的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的本发明所述的抗体，优选的是给予由保藏号为CCTCC-C200847的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。所述的方法尽管是直接用于哺乳动物的，但其使用目的是抑制精子的运动以达到避孕的效果，属于非治疗性的目的。本发明的主要优点在于(1)本发明人首次定位了Binlb蛋白序列上特定的抗原性表位，所述的抗原性表位在哺乳动物Binlb蛋白中保守地存在，从而可基于此抗原性表位来制备特异性结合Binlb蛋白的哺乳动物通用型抗体。(2)本发明人还筛选到了特异性结合本发明所述的抗原表位的单克隆抗体，所述的抗体结合特异性好，与其它蛋白没有交叉反应。(3)本发明以Binlb蛋白作为避孕的靶标，该蛋白在附睾中特异性表达，而附睾作为精子成熟和贮藏的器官，仅影响精子的活动能力，不影响精子的生成，因此把附睾作为研究避孕和不育的靶器官具有明显的优势。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1.单克隆抗体的制备材料克隆载体pGEM-TEasy载体购自Promega公司，原核表达质粒pET28a(+)购自Novagen公司。DH5a和宿主菌E.coliBL21codonplus(RP)菌为常规菌株。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞购自ATCC。细胞培养用DMEM购自GibcoBRL公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶和T4DNA连接酶购自MBI公司。小量质粒制备试剂盒、匪V逆转录酶、Oligo(dT)15Primer、RNA酶抑制剂、X-gal均购自Promega公司。Nde1、BglII、BamHI和Sail等限制性内切酶购自NEB公司。PCR产物切胶回收试剂盒购自TaKaRa公司。HisTr即kitNi亲和柱购自美国安玛西亚公司。IPTG购自MERCK公司。His-tagmAb购自北京天为时代公司。HRP和FITC标记的羊抗鼠IgG均购自上海普飞公司。Westernblot的ECL化学发光试剂盒购自Amersham公司。PVDF膜购自MILLIP0RE公司。福氏完全、不完全佐剂、PEG4000、小鼠Ig亚型鉴定试剂盒均购自Sigma公司。HAT、HT、EMEM等培液购自Invitrogen。BALB/c近交系小鼠(6周龄，雌性)，购自中科院实验动物中心。方法1、大鼠Binlb双拷贝串连蛋白的表达及纯化以大鼠Binlb全长cDNA克隆质粒(rBinlb-pGEM-T，pGEM-T购自Promega公司，制备方法见文献LiP，C.H.，HeB，SoSC，ChungYW，ShangQ，ZhangYD，ZhangYL.，Anantimicrobialpeptidegenefoundinthemaler印roductivesystemofrats.Science,2001.291(5509):p.1783-5)为模板，分别用4个大鼠Binlb基因特异性引物扩增出两个rBinlb的片段。片段l由以下引物扩增PI:5，-CATATG(NdeI)GGAATCAGAAACACC-3'(SEQIDNO:61);P2:5，—AGATCT(BglII)TCTGTTTTTAATGGA-3，(SEQIDNO:62)。片段2由以下引物扩增P3:5，-AGATCT(BamHI)GGAATCAGAAACACC—3'(SEQIDNO:63);P4:5，-GTCGAC(salI)CTATCTGTTTTTAATGGA-3，(SEQIDNO:64)。将片段1和2分别连入pGEM-TEasy载体的相关酶切位点，利用BglII，BamHI为同尾酶的特点，将两个片段串联起来。用Ndel和Sail将串联片段切割回收，连入pET28a(参考Xiao，L.Q.等，ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)，2004.36(8):p.571-6)。将pET28a-串联rbinlb转化表达菌BL21codonplus(RP)。从平板挑单克隆于3mlLB37。C培养过夜，接种500毫升LB，培养至0D600nm为0.6左右，加入IPTG至lmM，37。C诱导6小时，收菌。包涵体纯化以lml/mg菌体的比例加入裂解缓冲液(50mMTris-HC1PH8.0，25%蔗糖w/v，lmMEDTA)，超声破菌，加入脱氧胆酸钠至终浓度2%(w/v)，室温搅拌1小时。混合物15000g离心15分钟，取沉淀。洗涤液(1%TritonX-lOO(V/V)，lmMEDTA，1M尿素)洗涤4次，每次均充分混匀10000g离心10分钟。经洗涤的包涵体用2X上样缓冲液(4%SDS，125iiMTris-HCl，PH6.8)溶解。将蛋白进行SDS-PAGE电泳，切下目的条带，电洗脱(Bio-Radelectro-eluterModel422)。回收的rBinlb蛋白通过和标准BSA比较进行定量。2、杂交瘤细胞的建立用0.5mL前述纯化的rBinlb蛋白(0.8mg/ml)与等量福氏完全佐剂混合并完全乳化后，经腹腔注射免疫BALB/c小鼠(0.2mL/只)。加强免疫时，用福氏不完全佐剂充分乳化抗原，注射剂量和部位同前，共免疫4次，每次间隔2周。最后1次直接用抗原溶液进行免疫。末次免疫后3天，取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0在PEG4000作用下融合。用间接ELISA法筛选mcAb分泌阳性的杂交瘤细胞。经34次有限稀释法克隆化后，选择mcAb分泌持续阳性的杂交瘤细胞扩大培养，并按常规制备腹水。3、mcAb的特性鉴定(1)效价测定采用间接ELISA法。用rBinlb(lmg/L)包酶标板。一抗为适当稀释的杂交瘤细胞培养上清或腹水样本，二抗为1:3000的HRP标记羊抗鼠IgG，经TMB底物显色后，于波长450nm测定0D值。(2)Ig亚类(型)的鉴定间接ELISA法。用纯化的rBinlb包被酶标板，4。C过夜。其余操作详见Sigma公司单抗亚类鉴定试剂盒操作手册。参照试剂盒中的说明书进行。(3)特异性鉴定采用Westernblot检测，对rBinlb诱导表达全菌的裂解产物经15%浓度的胶SDS-PAGE电泳分离，进行Westernblot检测。转印后将PVDF膜置5%的脱脂奶粉4t:封闭过夜，然后置于按1:10000封闭液稀释的mcAb室温轻轻摇晃作用lh，用PBST摇晃洗涤，10HRP标记的羊抗鼠IgG工作浓度为1:1000，ECL显色。4、mcAb的初步应用(l)Westernblot检测应用Westernblot检测大鼠睾丸、附睾、输精管与精子中rBinlb蛋白的表达分别提取成年大鼠睾丸、附睾头部、附睾体部、附睾尾部、输精管蛋白，以及附睾头部精子、附睾体部精子和附睾尾部精子蛋白。蛋白定量后，取等量蛋白进行SDS-PAGE和Westernblot分析。重组表达的双拷贝串联蛋白(抗原)rBD14、rBD15、rBD42、rBDl、mBD15、mBD30的GenBank登录号分别为AY621346、AY621347、AY621369、NM_031810、NM_139222、DQ012040;双拷贝串联蛋白的制备方法参见文献XiaoLQ，LiuAH，ZhangYL.Aneffectivemethodforraisingantiseraagainstbeta—defensins:double_copyproteinexpressionofmBinlbinE.coli.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)2004;36(8):571—576.的方f去)。rBD14单和rBD15单(抗原)分别为rBD14、rBD15的单体活性重组多肽，制备方法参见DiaoH，GuoC，LinD，ZhangY.Intein-mediatedexpressionisaneffectiveapproachinthestudyofbeta_defensins.BiochemBiophysResComm皿2007;357(4):840-846。rCapSperm，rCorSperm，rCauSperm分别为等量的附睾头部、体部和尾部精子蛋白(分别将附睾头部、体部和尾部精子与2XSDSPAGE电泳上样缓冲液混匀，共同沸水浴5-10分钟，冷却至室温即可)。(2)免疫组化染色法解剖大鼠取附睾，依次经甲醛固定、石蜡包埋、切片及脱蜡后，3%11202孵育10min，再于微波炉中煮沸10min。加10%羊血清PBS封闭60min，用PBS洗3次。滴加1:1000的抗rBinlb抗体(以免疫前小鼠的血清为阴性对照)，于4t:孵育过夜，PBS洗3次，再滴加l:200的HRP标记羊抗鼠IgG(37t:孵育lh，漂洗3次)，滴加DAB显色10min后，再以苏木素复染lmin。经脱水、透明及封片后，镜下观察结果并照像。结果1、杂交瘤细胞株的建立按上述方法免疫BALB/c小鼠后，用间接ELISA法进行滴度检测，只有一只动物达到〉160000滴度水平，见图1。挑选滴度最高的第9号鼠进行杂交瘤制备。细胞融合后，从挑选的387个单克隆杂交瘤细胞株中，第一轮初筛选出可能的32个阳性克隆细胞株，从中选出10株抗体效价高的阳性细胞单克�。�用有限稀释法再进行第2次和第3次克�。�最终得到4株抗体效价高、能稳定分泌抗rBinlb单抗(rBinlbmcAb)的杂交瘤细胞株(3A1，10A5，10B4和14F6)，将其放入液氮中冻存6个月，复苏后仍能稳定分泌rBinlbmcAb。2、mcAb的特性鉴定(1)效价测定杂交瘤细胞3Al，10A5，10B4和14F6培养上清中mcAb的ELISA效价分别为l:32，1:64，1:64，1:128;腹水mcAb的效价分别为l:1X105，2X105，2X105，5X105。(2)Ig亚类(型)鉴定11采用Sigma公司单抗亚类鉴定试剂盒对3A1，10A5，10B4和14F6细胞株分泌的抗体的Ig亚类(型)进行鉴定的结果表明，它们的亚型分别为IgGl，IgGl，IgGl，IgG2a。(3)特异性鉴定经Westernblot检测，4株细胞分泌抗体只与重组表达的rBinlb起反应，与大肠杆菌中的其它蛋白无交叉反应，与P-防御素家族的其它成员也无交叉反应，见图2;与精子上其它蛋白和附睾其它部位的精子蛋白无交叉反应，见图3。[Cm5]3、mcAb的初步应用Westernblot检测结果在成年大鼠的睾丸、附睾头部、附睾体部、附睾尾部、输精管以及附睾头部精子、附睾体部精子和附睾尾部精子蛋白中，仅在附睾头部组织抽提蛋白和附睾头部精子抽提蛋白中检测到rBinlb的表达，其他部位均检测不到阳性信号。免疫组化结果rBinlb在成年大鼠附睾中表达与定位在成年大鼠附睾中仅在附睾头部靠近附睾体部的部位有rBinlb蛋白的表达，并且大部分阳性信号集中在该部位的附睾管腔内。在Westernblot和精子免疫荧光化学水平，抗rBinlb单抗特异识别附睾头部精子上的rBinlb而不识别其它蛋白，见图4。实施例2.单抗的抗原表位扫描实验材料载体pSY621-GST(徐万祥等，截短GST蛋白热诱导融合表达质粒及其制备方法，专利申请号200710173305.2)。宿主菌E.coliBL21。DNA片段合成上海赛百盛基因技术有限公司。方法1、抗原片段合成粗扫描将rbinlb多肽拆分成有79个氨基酸重叠的16肽(seglseg6)，如下seglDIPPGIRNTVCFMQRGseg2NTVCFMQRGHCRLFMCRSeg3HCRLFMCRSGERKGDIseg4SGERKGDICSDPWNRCseg5CSDPWNRCCVSSSIKNVSSSIKNRseg6基于将上述肽段合成相应的编码DNA片段，并在5'和3'端分别加上BamHI和Sail酶切位点序列，如表1所示。其中，rBinlb蛋白的16肽抗原表位Seg16正负链及其合成的DNA编码序列，用于16肽表位粗筛；s表示正义链，r表示反义链。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>精细表位扫描将16肽按1个氨基酸的位移拆分成不同的8肽片段，合成相应的DNA片段，在5'和3'端分别加上BamHI和Sail酶切位点序列，见表2，其中s表示正义链，r表示反义链。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>序列SEQIDNO:Seg3-3r5'-tcg3cttectcccc3g朋cggc3C3tg朋g3gg-3'20Seg3-4s5'-gatccttcatgtgccgttctggggagcgctaag-3'21Seg3-4r5'-tcgacttagcgctccccagaacggcacatgaag-3'22Seg3-5s5'-gatccatgtgccgttctggggagcgcaagtaag-3'23Seg3-5r5'-tcgacttacttgcgctccccagaacggcacatg-3'24Seg3-6s5，-gatcctgccgttctggggagcgcaaggggtaag-3，25Seg3-6r5'_tcgacttaccccttgcgctccccagaacggcag_3'26Seg3-7s5，-gatcccgttctggggagcgcaagggggattaag-3，27Seg3-7r5'_tcgacttaatcccccttgcgctccccagaacgg_3'28Seg4-ls5，-gatccggggagcgcaagggggatatttgctaag-3，29Seg4-lr5'_tcgacttagcaaatatcccccttgcgctccccg_3，30Seg4-2s5'-gatccgagcgcaagggggatatttgctcttaag-3'31Seg4-2r5'-tcgacttaagagcaaatatcccccttgcgctcg-3'32Seg4-3s5'-g3tcccgc朋ggggg3tetttgctctg3ct朋g-3'33Seg4-3r5'-tcgacttagtcagagcaaatatcccccttgcgg-3'34Seg4-4s5'-g3tcc朋ggggg3tetttgctctg3cccgt朋g-3'35Seg4-4r5'-tcgacttacgggtcagagcaaatatcccccttg-3'36Seg4-5s5'-gatccggggatatttgctctgacecgtggtaag-3'37Seg4-5r5'_tcgacttaccacgggtcagagcaaatatccccg_3'3814<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、表达质粒构建和重组蛋白表达DNA退火合成的DNA单链用无菌水溶解到100yM，正义链和反义链各取5yL，加入到90iiL无菌水，94t:水浴变性5分钟，自然降温退火。将pSY621-GST用BamHI和Sail酶切并割胶回收，与退火后的DNA片段连接(TAKARADNA连接试剂盒)。连接好的产物转化E.coliBL21感受态细菌，加入500iiLLB培养基37。C振摇1小时200转/分。12000g离心2分钟，涂含100iig/ml的氨苄西林钠的LB平板，37。C培养过夜。挑选转化子接入3ml含100iig/ml氨苄西林钠的LB培养液，3(TC培养过夜。取100yL过夜菌接入lml含100iig/ml氨苄西林钠的LB培养液，42。C培养5小时，收菌。取100yL菌液加入20iiL6X上样缓冲液混匀，IO(TC沸水浴5分钟，冷却后取1yL进行SDS-PAGE电泳。3、WesternBlot蛋白电泳完后电转至PVDF膜，1XNET封闭37。Cl-2小时，抗体稀释到1XNET4°C杂交过夜。PBST洗膜三次，15分钟/次。膜与HRP-标记的二抗37t:杂交1小时，PBST洗膜三次，ECL显色。结果1、抗体的识别特性制备抗Binlb多抗血清，用O.5mL纯化的rBinlb蛋白(0.8mg/mL)与等量福氏完全佐剂混合并完全乳化后，经腹腔注射免疫BALB/c小鼠(0.2mL/只)。加强免疫时，用福氏不完全佐剂充分乳化抗原，注射剂量和部位同前，共免疫4次，每次间隔2周。最后1次直接用抗原溶液进行免疫，常规方法从小鼠获取抗血清。粗筛抗原表位融合蛋白的重组表达和抗Binlb多抗血清的Westernblot鉴定如图5所示，多抗血清与seg2、3、4、5片段有免疫反应，表明抗原表位集中在这几个片段内。因此，16肽表位融合蛋白与多抗血清的westernblot结果表明，其表位序列分布在seg2-seg5内部。四个单克隆抗体(3A1、10A5、10B4、14F6)与粗筛表位序列seg1-6的Westernblot结果如图6。由结果可见，四个单克隆抗体(3A1，10A5，10B4，14F6)分别识别表位肽seg4&5、5、3、4&5。pre为诱导表达前的菌液，po为诱导后的菌液。用seg2-seg5的相应8肽表位融合蛋白进行Westernblot，表明单克隆抗体10A5特异性识别多肽表位序列DPWNRCC(SEQIDNO:1)，SDPWNRCC(SEQIDNO:2)或DPWNRCCV，见图7。单克隆抗体3A1特异性识别表位序列SDPWNRC、SDPWNRCC、DPWNRCCV、PWNRCCVS，见图8。单克隆抗体10B4特异性识别表位序列RSGERKGD等，见图9。用多抗血清也可以得到同样的表位识别序列。2、表位序列的物种间分析对包括人类、小鼠大鼠在内的哺乳动物spagll基因的成熟肽序列比对表明，单抗10A5和单抗3A1识别的表位序列SDPWNRCC在哺乳动物的spagll基因编码的多肽(包括人类)中保守地存在，如图10所示。这意味着该抗体和表位序列可以应用到包括人类的其它哺乳动物的spagll的鉴别和免疫避孕等方面。实施例3.单克隆抗体抑制精子运动起始3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠购自中科院实验动物中心。大鼠断颈处死后立即解剖，剥离附睾。剪取附睾组织，用(WONG，P.Y.D.(1988a).Mechanismofadrenergicstimulationofanionsecretioninculturedrat印ididymalepithelium.AmericanJournalofPhysiology254，F121133)的方法酶解分散细胞，接种到半透膜(HAWP，045um;Millipore，Bedford,MA，USA)，于32°C和5%二氧化碳及保湿的培养箱培养。培养基为Eagle，sminimumessentialmedium(EMEM)(购自INVITR0GEN)加5%月台牛血清(Gibco)，lOOmM非必需氨基酸，4mM谷胺酰胺，1mm丙酮酸钠，100i.u.ml—1青霉素，100ug.m"链霉素。培养至细胞铺满平皿底部。3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠购自中科院实验动物中心。其它化学试剂购自Sigma公司。大鼠断颈处死后立即解剖，剥离附睾。剪取附睾起始部(initialsegment)组织，轻轻剪碎，放入0.4ml预热到37。C的精子培养液(123mMNaCl，4mMKCl，2mMCaCl2，0.4mMMgS04，0.3mMNa2HP04，25mMNaHC03，5mM葡萄糖，12.5mM乳酸钠和0.5mM丙酮酸钠，8iig酚红，4mgm"牛血清白蛋白;pH7.4，渗量(osmolarity)310m0smkg—"，培养5分钟，游离出未成熟精子。调节精子浓度至6.0X107ml。取上述长满附睾细胞的培养皿，于精子和附睾上皮细胞的共孵育前2小时，弃去上清，加入150iiL新鲜培养基。作为对照，在培养皿中加入10iiL无关抗体如抗6XHistag单克隆抗体，实验组加入lOiiL抗rBinlb的单克隆抗体10A5。精子和附睾上皮细胞的共孵育时，加入3iiL6.0X107/mL的上述精子。于37°C，5%C02和饱和湿度条件下共孵育4小时，倒置相差显微镜(Olympus)40倍物镜，10倍目镜观察。在显微镜视野下可见对照组精子获得运动能力，精子运动明显；而实验组精子不运动。生物材料保藏本发明制备的杂交瘤细胞rBinlblOA5保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏号为CCTCCNO:C200847;保藏日为2008年9月17日。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表〈110〉中国科学院上海生命科学研究院；上海市计划生育科学研究所〈120〉一种哺乳动物通用的免疫避孕靶标及其特异性抗体〈130>086123〈160>64〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>7〈212>PRT〈213〉多肽〈400〉1AspProTrpAsnArgCysCys15〈210>2〈211>8〈212>PRT〈213〉多肽〈400>2SerAspProTrpAsnArgCysCys15〈210>3〈211>57〈212>DNA〈213>寡核苷酸〈400>3gatccgacattccacctggaatccgcaacaccgtgtgcttcatgcagcggggctaag57〈210>4〈211>57〈212>DNA〈213>寡核苷酸〈400〉4tcgacttagccccgctgcatgaagcacacggtgttgcggattccaggtggaatgtcg57〈210>5〈211>60〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>5gatccaacaccgtgtgcttcatgcagcggggccactgtcgcctcttcatgtgccgttaag60<210>6〈211>60〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>6tcgacttaacggcacatgaagaggcgacagtggccccgctgcatgaagcacacggtgttg6018〈210>7〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>7gatcccactgtcgcctcttcatgtgccgtt〈210>8〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>8tcgacttaaatatcccccttgcgctcccca〈210>9〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>9gatcctctggggagcgcaagggggatattt〈210>10〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>10tcgacttagcagcggttccacgggtc卿g〈210>11〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>11gatcctgctctgacccgtggaaccgctgct〈210>12〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>12tcgacttagtttttaatggaactggatecg〈210>13〈211>33〈212>DNActggggagcgc^gggggatattteag5了g^cggcacatg33g3ggcgacagtgg57gctctgacccgtggaaccgctgctaag57caaatatcccccttgcgctccccagag57gcgtatccagttccattaaaaactaag57cagcagcggttccacgggtc3gagcag5719〈213〉寡核苷酸〈400>13gatccgtatccagttccattaaaaaccgctaag〈210>14〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉14tcgacttagcggtttttaatggaactggatacg33〈210>15〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>15gatcctgtcgcctcttcatgtgccgttcttaag33〈210>16〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>16tcgactt朋g朋cggc3catg朋gaggcg3cag33〈210>17〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>17gatcccgcctcttcatgtgccgttctgggtaag33〈210>18〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>18tcgacttacccagaacggcacatgaagaggegg33〈210>19〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉19gatccctcttcatgtgccgttctggggagtaag33<210>20〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>20tcgacttactccccag朋cggcac3tg朋gagg33〈210>21〈211〉33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>21gatccttcatgtgccgttctggggagcgctaag33〈210>22<211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>22tcgacttegcgctccccagaacggcacatgaag33〈210>23〈211>33〈212〉DNA〈213〉寡核苷酸〈400>23gatccatgtgccgttctggggagcgcaagtaag33〈210>24〈211>33<212>廳〈213>寡核苷酸〈400>24tcgacttacttgcgctccccagaacggcacatg33〈210>25〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>25gatcctgccgttctggggagcgcaaggggtaag33〈210>26〈211>33〈212>DNA21〈213〉寡核苷酸〈400>26tcgacttaccccttgcgctccccagaacggcag〈210>27〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>27gatcccgttctggggagcgcaagggggattaag33〈210>28〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>28tcgactteatcccccttgcgctccccagaaegg33〈210>29〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>29gatceggggagcgcaagggggatatttgetaag33〈210>30〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>30tcgacttagcaaatatcccccttgcgctccccg33〈210>31〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>31gatccgagcgcaagggggatatttgetettaag33〈210>32〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>32tcgacttaagagcaaatatcccccttgcgctcg33〈210>33〈211>33〈212>DNA〈213>寡核苷酸〈400>33gatcccgcaagggggatatttgctctgact〈210>34〈211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400〉34tcgacttagtC3g3gca朋tatcccccttg〈210>35〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>35gatccaagggggatatttgctctgacccgt〈210>36〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>36tcgacttacgggtcagagcaaatatccccc〈210>37〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>37gatccggggatatttgctctgacccgtggt<210>38<211>33〈212〉DNA〈213〉寡核苷酸〈400>38tcgacttaccacgggtcagagcaaatatcc〈210>39〈211>33〈212>DNAaag33egg33aag33ttg33肌g33ccg33〈213〉寡核苷酸〈400>39gatccgatatttgctctgacccgtggaact朋g33〈210>40<211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400>40tcgacttagttccacgggtcagagc^atetcg33〈210>41<211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400>41gatccatttgctctgacccgtggaaccgct33〈210>42〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉42tcgacttagcggttccacgggtcagagc^Eltg33〈210>43〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉43gatcctgctctgacccgtggaaccgctgct33〈210>44〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>44tcgacttagcagcggttccacgggtc卿gCElg33〈210>45〈210>46〈211>33〈212〉DNA〈213〉寡核苷酸〈400>46tcgacttagcagcagcggttccacgggtca〈210>47〈211>33〈212>DNA〈213>寡核苷酸<400>47gatccgacccgtggaaccgctgctgcgtat〈210>48〈211〉33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸<400>48tcgacttatacgcagcagcggttccacggg〈210>49〈211〉33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>49gatccccgtggaaccgctgctgcgtatcct〈210>50〈211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400>50tcgacttaggatecgcagcagcggttccac〈210>51〈211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400>51gatcctggaaccgctgctgcgtatccagtt〈210〉52〈211>33〈212>DNAgag33aag33tcg33朋g33ggg313朋g33〈213>寡核苷酸〈400>52tcgacttaactggatacgcagcagcggttc〈210>53〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>53gatccaaccgctgctgcgtatccagttcct〈210>54〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸<400>54tcgacttaggaactggatecgcagcagcgg〈210>55〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>55gatcccgctgctgcgtatccagttccattt〈210>56〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>56tcg3ctte肪tggaactggat3CgC3gC3g〈210>57〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>57gatcctgctgcgtatccagttccattaaat〈210>58<211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>58tcgacttatttaatggaactggatacgcag26cag33aag33ttg33aag33egg'3'3肌g33cag33〈210>59〈211>33〈212>DNA〈213>寡核苷酸<400>59gatcctgcgtatccagttcc〈210>60〈211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400〉60tcgacttagtttttaatggatictggatecgcag〈210>61〈211>21〈212>DNA〈213〉引物〈400>61catetggg朋tcag朋3C3cc〈210>62〈211>21〈212>DNA〈213〉引物〈400>62agatcttctgtttttaatgg〈210>63<211>21〈212〉DNA〈213〉引物〈400>63agatctggaatcag朋3C3cc<210>64〈211〉24〈212>DNA〈213〉引物〈400>64gtcgacctatctgtttttaatgga25/25页33332121212权利要求一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列；并且，所述的多肽来源于哺乳动物Bin1b蛋白，且由7-30个氨基酸组成。2.如权利要求l所述的多肽，其特征在于，所述的多肽具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。3.权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制备特异性结合Binlb蛋白的抗体。4.一种特异性结合Binlb蛋白的抗体，其特征在于，所述的抗体特异性识别Binlb蛋白上具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列的位点。5.如权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述的抗体由保藏号为CCTCC-C200847的杂交瘤细胞株产生。6.权利要求4-5任一所述的抗体的用途，其特征在于，用于制备抑制哺乳动物精子运动的组合物；或用于制备定性或定量检测样品中Binlb蛋白存在情况的试剂。7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的哺乳动物选自人、鼠、狗、猫、牛、猪、蝙蝠、猴、树駒、马、大象、松鼠、豚鼠或犰狳。8.—种用于抑制哺乳动物精子运动的组合物，其特征在于，所述的组合物包括(1)有效量的权利要求4-5任一所述的抗体；禾口(2)药学上可接受的载体。9.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C200847。10.—种抑制哺乳动物精子运动的方法，其特征在于，所述方法包括给予哺乳动物有效量的权利要求4-5任一所述的抗体。全文摘要本发明涉及一种哺乳动物通用的免疫避孕靶标。本发明公开了一种来源于哺乳动物Bin1b蛋白的保守性抗原表位，本发明还公开了特异性与该抗原表位结合的抗Bin1b蛋白的抗体，特别是单克隆抗体，所述的抗体是一种哺乳动物通用型的抗体。文档编号G01N33/68GK101724020SQ20081020170公开日2010年6月9日申请日期2008年10月24日优先权日2008年10月24日发明者于合国,刁华,张永莲,徐万祥申请人:中国科学院上海生命科学研究院;上海市计划生育科学研究所