专利名称：电化学传感器及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于测定葡萄糖的电化学传感器及其制备方法。
背景技术：
利用酶反应的特异性，酶电极(在下文中也被称为生物传感器)被广泛用作专门监测各种生理活性物质的传感器。作为这种酶电极的例子，可以通过电化学方法或光学方法分析样品组成的酶电极被广泛使用。通过电化学方法分析样品的酶电极通常指的是其中酶被固定在电极(例如金电极、钼电极或碳电极)表面的电极。特别地，酶电极被广泛用作葡萄糖传感器，用于测定作为糖尿病重要标志的血液中葡萄糖浓度。虽然葡萄糖传感器的基本结构及其制备方法是众所周知的，专利文献1公开了一种制备具体的葡萄糖传感器的方法。即专利文献1公开了下列技术通过在载体(例如电极基材)上形成仿细胞膜结构(磷脂2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC))而使电极基材的表面改性。载体结构的形状并未限制，其例子包括膜、毛细管的内壁、流道沟槽和颗粒。通过以自组织方式使膜结合蛋白(酶或抗体)在MPC改性表面的仿细胞膜结构层上稳定化，可以使蛋白质(酶或抗体)被固定在基材、通道壁或载体的表面上，从而使蛋白质具有方向性。专利文献1中描述的这种方法与各种用于固定蛋白质的传统方法相比，不同之处在于能模仿体内行为，并且新的固定方法属于新类型，这是一种通过蛋白质自组织(使用任意一种具有膜结合性的蛋白质)的固定方法。通过这种方法可以实现多种应用(产品) 的性能增强。在本发明上述的现有专利文献1中，从酶的定向固定的视角来看，蛋白质中的电子转移是一种非常有效的技术。但是，在其中酶电极是通过膜结合的氧化还原酶的固定而构建的情况下，描述了为了从膜结合的氧化还原酶到电极“仅通过酶的固定”获得高效率的电子转移通道的尝试，并且在实施例中仅提到将通用的碳作为基材，并没有谈到用于改善作为基材的电极材料的给予和接受电子的能力的方法。因为基材电极的制备方法或电极形状对酶电极传感器性能的影响非常大，传感器可以最优化为制备效率高、稳定性高和可用性高的传感器，所以酶电极仍具有改善的空间。现有技术文献专利文献专利文献1 特开2006-322889号公报
发明内容
本发明的目的是提供一种制备效率高、响应性高、长期稳定性好且可用性高的传感器。为了实现该目的，本发明提供一种电化学传感器，包括基材；配置在基材上的由碳粒子制成的导电层；
配置在导电层上的包含酶的仿细胞膜结构层，所述酶存在于仿细胞膜结构层内和仿细胞膜结构层界面上两者中的至少一个位置。通过使用本发明，可以使蛋白质(例如氧化还原酶)高定向固定，因此没有出现少量酶的活性波动，适当地且成本上有利地表达出期望的活性，并且由于酶和电极之间电子转移效率的增加，酶电极的信号也进一步增大。此外，通过酶的固定使酶电极具有膜结合性，能在其中模拟体内行为，从而使酶可以更牢固地固定在电极表面，因而令人惊讶地改善了传感器的长期稳定性。通过使用本发明，电化学传感器的制备效率可以明显改善通过使用碳粒子(炭黑)作为含有粘结剂和溶剂的丝网印刷油墨，以丝网印刷法在基材(例如树脂)上进行图案印刷并形成电极，其中传感器之间的差异可以变得很小。此外，因为通过丝网印刷方法的传感器图案化是可能的，便可以制备出更微小的电化学传感器；因为不使用对生物有毒的附加介体而改善了体内安全性；因为传感器具有长期稳定性；所以预计本发明的电化学传感器可能非常适用于植入式连续测量传感器。对该电化学传感器，可以通过填充碳粒子来制备导电层，并且可以简单地估算对葡萄糖的响应灵敏度。如果电化学传感器是用本发明的方法通过使膜结合的氧化还原酶固定在电极上来构建，可以得到膜结合酶的高效电子转移通道，同时能模拟膜结合酶的体内行为。
图1是显示本发明的电化学传感器在被用于进行葡萄糖的定量分析时的响应灵敏度的图，其中BLACK PEARLS 2000被用作碳粒子，而含有碳的导电层是通过丝网印刷制备的。图2是本发明的电化学传感器被用于连续测定时的稳定性的图，其中BLACK PEARLS 2000被用作碳粒子，而含有碳的导电层是通过丝网印刷制备的。图3是显示本发明的电化学传感器在被用于进行葡萄糖的定量分析时的响应灵敏度的图，其中Ketjen Black被用作碳粒子，而含有碳的导电层是通过丝网印刷制备的。图4是本发明的电化学传感器被用于连续测定时的稳定性的图，其中Ketjen Black被用作碳粒子，而含有碳的导电层是通过填充碳粒子制备的。本发明优选的实施方式本发明的主要部分是炭黑的使用和通过使用仿细胞膜结构使酶固定化。其详细说明如下本发明的电化学传感器的上述仿细胞膜结构层优选是磷脂膜。仿细胞膜结构层是用于固定酶同时模拟体内行为。所述酶存在于仿细胞膜结构层内和仿细胞膜结构层界面上的至少一个位置。作为上述仿细胞膜结构层的本发明的电化学传感器的磷脂膜优选是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)聚合物。其中MPC单独聚合的那些或其中MPC与疏水性单体(例如甲基丙烯酸酯，诸如甲基丙烯酸丁酯)共聚的那些可以被用作MPC聚合物。MPC聚合物还可以是其中MPC与阴离子单体或阳离子单体共聚的那些。可以通过将一滴包含上述磷脂聚合物的溶液分配到基材(例如工作电极或对电极)的任意部分(例如绝缘膜围住的外露部分)然后进行干燥而配置这种仿细胞膜结构层。在本发明中，仿细胞膜结构层的配置包括仿细胞膜结构层的形成。本发明的电化学传感器的酶优选是葡萄糖脱氢酶。和葡萄糖氧化酶不同，葡萄糖脱氢酶在反应期间不受氧介导，其优点是不受例如测试样品中氧分压的影响。本发明的电化学传感器的葡萄糖脱氢酶优选是具有细胞色素作为亚基的葡萄糖脱氢酶(在下文中也被称为“Cy-GDH”)。当使用具有细胞色素作为亚基的葡萄糖脱氢酶时，不必额外使用介体(例如碱金属铁氰化物)。此处，本发明所用的Cy-GDH指的是包含至少一个具有葡萄糖脱氢酶活性的α-亚基和一个具有电子传递功能的细胞色素C的那些，也涵盖进一步含有不同于α-亚基或细胞色素C的亚基的那些。W002/36779中公开了这些Cy-GDH的例子。该国际申请中所描述的Cy-GDH来自属于Burkholderia c印acia (洋葱伯克霍尔德菌)的微生物；其分子量通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在还原条件下测定为约60kDa ；其中包含FAD作为辅因子并且包含具有葡萄糖脱氢酶活性的α _亚基(其分子量通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在还原条件下测定为约43kDa)并且包含具有电子传递功能的细胞色素C。本发明的Cy-GDH还包括通过利用转化子得到的那些，其中编码从属于 Burkholderia cepacia的微生物中得到Cy-GDH的基因被转移到该转化子中。本发明的电化学传感器的上述酶优选在上述仿细胞膜结构层上以酶相对于仿细胞膜结构层自组织的状态形成。例如，因为来自属于Burldiolderia cepacia的微生物的 Cy-GDH是膜结合蛋白质，其原本存在于细胞膜上，当这种Cy-GDH被用在膜上时，可以通过以如下状态使Cy-GDH被固定在膜上而形成仿细胞膜结构层=Cy-GDH相对于仿细胞膜结构层是自组织的并且Cy-GDH具有与Cy-GDH在细胞膜中相同方式的取向。酶的这种自组织固定化并不限于来自属于Burldiolderia cepacia的微生物的Cy-GDH，当使用存在于细胞膜中的膜结合酶时都可以得到。除了碳粒子，本发明的电化学传感器的上述导电层还可以包含粘结剂。通过采用这种构造成，碳粒子(炭黑)可以在生产过程中被制成含有粘结剂和溶剂的丝网印刷油墨。 为此，通过使用丝网印刷法在基材(例如树脂)上进行图案印刷形成电极，可以显著改善酶电极的制备效率，其中不同传感器之间的差异可以变得很小。制备过程中所含的溶剂通过干燥而蒸发，因此不包含在酶电极的构造中。作为用于配置上述导电层与碳粒子的粘结剂，可以在制备过程中溶解或分散在溶剂中的各种粘结剂都可以使用，特别地可优选使用丁缩醛树脂粘结剂和聚酯树脂粘结剂。 优选地，卡必醇乙酸酯(二甘醇一乙醚乙酸酯)、异佛尔酮和环己烷可以被用作溶剂。在本发明中，导电层的配置包括导电层的形成。在本发明的电化学传感器中，上述导电层和上述仿细胞膜结构层可以组合。即，其中上述导电层和上述仿细胞膜结构层结合杂一起的一层可以通过如下形成预先制备并混合包含碳粒子的丝网印刷油墨(用于形成导电层)和包含磷脂聚合物的溶液(用于形成仿细胞膜结构层)，并将一滴混合溶液分配到基材(诸如工作电极和对电极)上，然后干燥。 以这种方式组合的层在制备中非常有用。此外，最终的酶电极可以在一步中制备通过预先使膜结合酶混入上述丝网印刷油墨和磷脂聚合物的混合物并通过丝网印刷法在基材上进行图案印刷。一种用于制备本发明的电化学传感器的方法，其包括
将由碳粒子制成的导电层配置在基材上；将仿细胞膜结构层配置在导电层上；使酶固定在仿细胞膜结构层上。膜结合酶在仿细胞膜结构层上的固定(即自组织固定)可以在例如其外露部分上形成有仿细胞膜结构层的基材上进行，将所述基材浸入含有膜结合酶的溶液中，然后干燥; 或者将上述酶溶液喷在仿细胞膜结构层，然后干燥。当膜结合酶通过自组织方式被固定在仿细胞膜结构层上时，膜结合酶在仿细胞膜结构层内和/或仿细胞膜结构层的界面上定向形成。当酶是Cy-GDH(即具有细胞色素作为亚基的葡萄糖脱氢酶)时，酶被固定在仿细胞膜结构层上，从而使具有葡萄糖脱氢酶活性的α-亚基的活性部位被固定在最接近测试样品的酶电极的表层上，同时细胞色素最接近电极或与电极接触。来自属于Burkholderia c印acia的微生物的Cy-GDH是膜结合蛋白质。因为上述来自微生物的Cy-GDH原本存在于细胞膜上，当使用这种Cy-GDH时，Cy-GDH可以以如下状态被固定=Cy-GDH相对于仿细胞膜结构层是自组织的并且Cy-GDH具有与Cy-GDH在细胞膜中相同方式的取向。酶的这种自组织固定化并不限于来自属于Burldiolderia cepacia的微生物的Cy-GDH，当使用存在于细胞膜中的膜结合酶时都可以得到。在制备本发明的电化学传感器的方法中，其中引入硅烷偶联剂的那些聚合物也可以被用作磷脂聚合物。如果其中硅烷偶联剂以这种方式被引入仿细胞膜物质，仿细胞膜结构层可以在仿细胞膜结构层的配置步骤中通过与导电层上的OH基反应而在导电层上形成，这同时可以增强磷脂聚合物对导电层的外露部分的亲和性。在制备本发明的电化学传感器的方法中，当其中引入硅烷偶联剂的那些被用作磷脂聚合物时，通过预先在导电层上进行亲水处理并在亲水部位形成引入硅烷偶联剂的仿细胞膜结构层，该亲水基被连接在硅烷偶联剂上，而磷脂聚合物可以更牢固地固定在外露部分。通过在导电层表面的VUV处理而进行的亲水处理之后再形成仿细胞膜结构层，可以使磷脂聚合物更牢固地被固定。在本文中，磷脂聚合物中硅烷偶联剂的用量例如为基于100份重量的聚合物组分10到500份重量。硅烷偶联剂的例子包括四乙氧基硅烷、乙烯基三氯硅烷、三O-甲氧基乙氧基)乙烯基硅烷、Y -甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、Y -甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷、β-(3，4_环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、Y-缩水甘油基丙基三乙氧基硅烷、Y -氨丙基三乙氧基硅烷、N-苯基-Y -氨基丙基三甲氧基硅烷、Y -氯丙基三甲氧基硅烷和Y-硫醇基丙基三甲氧基硅烷，这些硅烷偶联剂可以单独使用或者可以其中多个组合使用。(导电层材料的选择)本发明人寻找用于改善电子从酶到电极的交换效率的优选材料，并发现考虑到导电粒子的颗粒尺寸和比表面积，如下的组合是优选的由一次粒径和处于结合状态的二次粒径都很小、密度小且比表面积非常大的材料(碳粒子)制成的导电层和仿细胞膜结构层的组合。特别地，已发现一级粒径为30nm-100nm、比表面积为200m2/g-1400m7g的碳粒子优选用于制备生物传感器。碳粒子的例子包括炭黑，易于得到的炭黑的代表性例子包括 BLACK PEARLS (商标；由 Cabot Corporation 制造)和 Ketjen Black (商标；由 AkzoNobelChemicals Co. ,Ltd.制造)。粒径和比表面积的测定方法的例子包括通过透射式电子显微镜进行的测试和BET比表面积法。(通过使用导电层材料的丝网印刷油墨来制备传感器的方法的优化)当使用上述碳材料时，可以将矿物油或类似物混入碳材料(粉末)制备糊状物，但其粘附性差，传感器的结构往往不稳定。因此，在本发明中，优选通过制备上述浸渍有粘结剂和溶剂的碳粒子来制造丝印油墨。通过丝网印刷法将油墨图案化印刷在基材(例如树脂)并通过印刷形成电极，将显著改善制备过程的效率。(通过填充碳材料来制备传感器的方法的优化)在本发明中，对葡萄糖的响应灵敏度可以通过如下简单地估算通过填充糊状物 (通过向上述碳粒子中添加液体石蜡得到)来制备导电层并将该层用于电化学传感器。(酶在导电层材料上的定向固定)在上述导电层上，通过使用MPC或类似物来改性电极表面而形成仿细胞膜结构 (磷脂)。此外，通过例如如下方法来制备酶电极(电化学传感器)将上述改性的电极浸入膜结合酶溶液或将膜结合酶溶液分配到改性的电极表面并且通过使酶固定在上述改性电极上而制备工作电极。电极体系通常由工作电极、对电极和参比电极组成。实施例1在实施例1中，进行电化学传感器的响应灵敏度和稳定性的检测，其中在所述电化学传感器上通过丝网印刷法形成导电层，其中BLACK PEARLS被用作碳粒子，而基材的表面上含有这种BLACK PEARLS。所示的本发明的电化学传感器的应用效果作为其中来自属于 Burkholderia c印acia的微生物的葡萄糖脱氢酶(Cy-GDH)(其具有细胞色素作为亚基)的一个实施例的数据。作为电极体系，使用了 工作电极酶固定化电极；对电极钼电极；和参比电极银/氯化银电极。上述的酶固定化电极是工作电极，是使用本发明的仿细胞膜结构层的电化学传感器；而使用具有常规吸附型酶固定化电极的电化学传感器作为对比例，其中未使用MPC，酶被直接吸附在导电层上。在本发明中，在聚酰亚胺基材的表面上，根据本发明形成了导电层(碳层)、仿细胞膜结构层(磷脂聚合物层)和固定化酶膜(Cy-GDH膜)。作为碳粒子，所制备的BLACK PEARLS 2000 (在下文中被称为BP)的粒径为50nm， 比表面积为1400m2/g，孔隙率为60体积％。基于重量比，将40%的BP、作为粘结剂的40% 聚酯树脂以及作为溶剂的20%的异佛尔酮混合以得到印刷油墨。将该油墨印在聚酰亚胺基材的表面上，使油墨的厚度为ΙΟμπι，然后在150°C下干燥30分钟从而得到导电层。通过利用在导电层表面的VUV处理而进行亲水处理、随后将MPC聚合物溶液涂布在导电层的表面上并干燥，形成仿细胞膜结构层。VUV处理是通过在空气中使用 “MECL-M3-750” (由MD Excimer Co.，Ltd.制造)以Imm的辐照距离将波长为172nm的准分子激光辐照在导电层表面180秒而进行的。作为磷脂聚合物溶液，使用引入了硅烷偶联剂的 MPC 聚合物(产品名“LIPIDURE CR-1702” ；由 NOF CORPORATION 制造)。
通过将其上形成磷脂聚合物层的导电层浸入Cy-GDH溶液中10分钟而形成Cy-GDH 层。Cy-GDH溶液中Cy-GDH的浓度被设为按照活性基准100U/μ L。通过使用所制备的酶电极作为工作电极、Pt作为对电极且Ag/AgCl参比电极作为参比电极，而构建出使用了本发明的仿细胞膜结构层的酶电极体系。另一方面，通过与实施例1相同的方式形成对比例1，不同之处在于磷脂聚合物没有在工作电极上形成，而是使用常规吸附型酶固定化电极，其中未使用MPC，酶被直接吸附在导电层上。通过使用这些电极体系，不用附加的介体，通过计时电流法测定对葡萄糖的响应灵敏度，其中将600mV的电势差施加在电极体系上。在响应灵敏度的测量中，将实施例1和对比例1的酶电极体系(工作电极/对电极/参比电极)中的每一个浸入0. IM的磷酸盐缓冲溶液(pH= 7.0)中。然后，向各个酶电极施加恒定的电压(600mV，相对于Ag/AgCl)，同时将2. OM的葡萄糖水溶液连续滴入溶液中，在最终的葡萄糖浓度为100mg/dl和600mg/dl 时测量恒定电流密度(nA/mm2)。恒定电流密度与响应灵敏度相对应。结果显示在图1中。 如图1所示，已证实与具有其中未使用MPC的吸附型酶固定化电极的对比例的电化学传感器相比，具有其中使用MPC的本发明的仿细胞膜结构的酶固定化电极的电化学传感器的响应灵敏度更高。然后，评估本发明的电极体系的稳定性。在评估稳定性的方法中，测定实施例和对比例的各个酶电极体系的初始响应灵敏度。随后，将体系浸入室温下的0. IM的磷酸盐缓冲溶液(pH = 7. 0)中3天之后测定实施例和对比例的各个酶电极体系的响应灵敏度。响应灵敏度的测定方法在与上述检测响应灵敏度一样的条件下进行。结果显示在图2中。图2 中的图形显示相对于初始值的相对活性(最终的葡萄糖浓度为100mg/dl)。结果，证实与具有其中未使用MPC的吸附型酶固定化电极的电化学传感器相比，具有其中使用MPC的酶固定化电极的电化学传感器的稳定性更高。实施例2在实施例2中，Ketjen Black被用作碳粒子，检测电化学传感器的稳定性，其中在所述电化学传感器上通过使用这种Ketjen Black的丝网印刷法在基材表面上形成导电层。 所示的本发明的电化学传感器的应用效果作为其中来自属于Burliholderia cepacia的微生物的葡萄糖脱氢酶(Cy-GDH)(其具有细胞色素作为亚基)的一个实施例的数据。作为电极体系，使用了 工作电极酶固定化电极；对电极钼电极；和参比电极银/氯化银电极。上述的酶固定化电极是工作电极，是使用本发明的仿细胞膜结构层的电化学传感器，而使用具有常规吸附型酶固定化电极的电化学传感器作为对比例，其中未使用MPC，酶被直接吸附在导电层上。在本发明中，在聚酰亚胺基材的表面上，根据本发明形成了导电层(碳层)、仿细胞膜结构层(磷脂聚合物层)和固定化酶膜(Cy-GDH膜)。作为碳粒子，所制备的Ketjen Black EC600JD(在下文中被称为KB)的粒径为 34nm,比表面积为1270m2/g，孔隙率为60体积％。基于重量比，将40%的KB、作为粘结剂的40%聚酯树脂以及作为溶剂的20%的异佛尔酮混合以得到印刷油墨。将该油墨印在聚酰亚胺基材的表面上，使油墨的厚度为ΙΟμπι，然后在150°C下干燥30分钟从而得到导电层。通过如下方法在上述导电层的表面上形成磷脂聚合物层将上述导电层层浸入MPC聚合物溶液(0. 05%的MPC水溶液，使用0. IM的磷酸盐缓冲溶液作为溶剂)中六小时。作为磷脂聚合物溶液，使用引入了硅烷偶联剂的MPC聚合物(产品名“LIPIDURE CR-1702” ；由 NOF CORPORATION 制造)。通过用蒸馏水冲洗、之后将其上形成磷脂聚合物层的导电层浸入Cy-GDH溶液 (lmg/ml的Cy-GDH溶液)中一整夜而形成Cy-GDH层。Cy-GDH溶液中Cy-GDH的浓度被设为按照活性基准lOOU/μ L。通过使用所制备的酶电极作为工作电极、Pt作为对电极且Ag/ AgCl参比电极作为参比电极，而构建出使用了本发明的仿细胞膜结构层的酶电极体系。另一方面，通过与实施例2相同的方式形成对比例2，不同之处在于磷脂聚合物没有在工作电极上形成，而是使用常规吸附型酶固定化电极体系，其中未使用仿细胞膜结构层，酶被直接吸附在导电层上。通过使用这些电极体系，不用附加的介体，通过计时电流法测定对葡萄糖的响应灵敏度，其中将600mV的电势差施加在电极体系上。在响应灵敏度的测量中，将实施例2和对比例2的酶电极体系(工作电极/对电极/参比电极)中的每一个浸入0. IM的磷酸盐缓冲溶液(pH = 7.0)中。然后，向各个酶电极施加恒定的电压(600mV，相对于Ag/AgCl)， 同时将2. OM的葡萄糖水溶液连续滴入溶液中，在最终的葡萄糖浓度为25mg/dl、100mg/dl 和600mg/dl时测量恒定电流密度(nA/mm2)。恒定电流密度与响应灵敏度相对应。结果显示在图3中。如图3所示，已证实与具有其中未使用MPC的吸附型酶固定化电极的对比例的电化学传感器相比，具有其中使用MPC的本发明的仿细胞膜结构的酶固定化电极的电化学传感器的响应灵敏度更高。实施例3在实施例3中，Ketjen Black被用作碳粒子，检测电化学传感器的稳定性，其中在所述电化学传感器上通过填充这种Ketjen Black的方法而在基材的表面形成导电层。所示的本发明的电化学传感器的应用效果作为其中来自属于Burliholderia cepacia的微生物的葡萄糖脱氢酶(Cy-GDH)(其具有细胞色素作为亚基)的一个实施例的数据。作为电极体系，使用了 工作电极酶固定化电极；对电极钼电极；和参比电极银/氯化银电极。上述的酶固定化电极是工作电极，是使用本发明的仿细胞膜结构层的电化学传感器，而使用具有常规吸附型酶固定化电极的电化学传感器作为对比例，其中未使用MPC，酶被直接吸附在导电层上。在本发明中，在聚酰亚胺基材的表面上，根据本发明形成了导电层(碳层)、仿细胞膜结构层(磷脂聚合物层)和固定化酶膜(Cy-GDH膜)。作为碳粒子，所制备的Ketjen Black EC600JD(在下文中被称为KB)的粒径为 34nm,比表面积为1270m2/g，孔隙率为80体积％。向60mg这种粉末中加入100 μ L的液体石蜡，混合均勻之后加工成糊状物。为了制备直径为3mm的糊电极(由BAS Co.，Ltd.制造的CPE碳糊电极)而用该糊状物填充基体电极，并将电极压缩至厚度为2mm从而得到导电层。通过如下方法在上述导电层的表面上形成磷脂聚合物层将上述导电层层浸入MPC聚合物溶液(0. 05%的MPC水溶液，使用0. IM的磷酸盐缓冲溶液作为溶剂)中六小时。作为磷脂聚合物溶液，使用引入了硅烷偶联剂的MPC聚合物(产品名“LIPIDURE CR-1702” ；由 NOF CORPORATION 制造)。通过用蒸馏水冲洗、之后将其上形成磷脂聚合物层的导电层浸入Cy-GDH溶液 (lmg/ml的Cy-GDH溶液)中一整夜而形成Cy-GDH层。Cy-GDH溶液中Cy-GDH的浓度被设为按照活性基准lOOU/μ L。通过使用所制备的酶电极作为工作电极、Pt作为对电极且Ag/ AgCl参比电极作为参比电极，而构建出使用了本发明的仿细胞膜结构层的酶电极体系。另一方面，通过与实施例3相同的方式形成对比例3，不同之处在于磷脂聚合物没有在工作电极上形成，而是使用常规吸附型酶固定化电极体系，其中未使用仿细胞膜结构层，酶被直接吸附在导电层上。评估本发明的电极体系的稳定性。在评估稳定性的方法中，测定实施例3和对比例3的各个酶电极体系的初始响应灵敏度。随后，将体系浸入室温下的0. IM的磷酸盐缓冲溶液(pH = 7. 0)中1、2、3、6、7、10、14、15天之后测定实施例3和对比例3的各个酶电极体系的响应灵敏度。响应灵敏度的测定方法在与实施例1所示的检测响应灵敏度一样的条件下进行。结果显示在图4中。图4中的图形显示相对于初始值的相对活性(最终的葡萄糖浓度为100mg/dl)。结果，证实与具有其中未使用MPC的吸附型酶固定化电极的电化学传感器相比，具有其中使用MPC的酶固定化电极的电化学传感器的稳定性更高。
权利要求
1.一种电化学传感器，包括基材；配置在基材上的由碳粒子制成的导电层；配置在导电层上的包含酶的仿细胞膜结构层，所述酶存在于所述仿细胞膜结构层内和所述仿细胞膜结构层界面上两者中的至少一个位置。
2.如权利要求1所述的电化学传感器，其中所述仿细胞膜结构层是磷脂膜。
3.如权利要求2所述的电化学传感器，其中所述磷脂膜是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱聚合物。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的电化学传感器，其中所述酶是葡萄糖脱氢酶。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的电化学传感器，其中所述酶以相对于所述仿细胞膜结构层自组织的状态被固定在所述仿细胞膜结构层上。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的电化学传感器，其中所述碳粒子的一级粒径为 IOOnm或更�。缺砻婊�200m2/g或更大。
7.如权利要求1至6中任意一项所述的电化学传感器，其中所述碳粒子是Ketjen Black (商标)或 BLACK PEARLS (商标)。
8.如权利要求1至7中任意一项所述的电化学传感器，其中所述导电层通过丝网印刷碳粒子而形成。
9.如权利要求1至7中任意一项所述的电化学传感器，其中所述所述导电层通过填充碳粒子而形成。
10.一种用于制备电化学传感器的方法，其包括将由碳粒子制成的导电层配置在基材上；将仿细胞膜结构层配置在所述导电层上；使酶固定在所述仿细胞膜结构层上。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述仿细胞膜结构层是磷脂膜。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述磷脂膜是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱聚合物。
13.如权利要求10至12中任意一项所述的方法，其中所述酶是葡萄糖脱氢酶。
14.如权利要求10至13中任意一项所述的方法，其中所述酶以相对于所述仿细胞膜结构层自组织的状态被固定在所述仿细胞膜结构层上。
15.如权利要求10至14中任意一项所述的方法，其中所述碳粒子的一级粒径为IOOnm 或更�。缺砻婊�200m2/g或更大。
16.如权利要求10至15中任意一项所述的方法，其中所述碳粒子是KetjenBlack (商标)或 BLACK PEARLS (商标)。
17.如权利要求10至16中任意一项所述的方法，其中所述导电层通过丝网印刷碳粒子而形成。
18.如权利要求10至16中任意一项所述的方法，其中所述所述导电层通过填充碳粒子而形成。
全文摘要
本发明公开了一种电化学传感器，其包含基材、排列在基材上且包含碳粒子的导电层、以及排列在导电层上且其内部和/或其界面上包含酶的仿细胞膜结构层。
文档编号G01N27/327GK102308204SQ20108000727
公开日2012年1月4日 申请日期2010年2月4日 优先权日2009年2月9日
发明者塚田理志, 村濑阳介, 胜木幸治, 藤绳义明 申请人:爱科来株式会社
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